Summary
Este protocolo describe la síntesis, caracterización y la inyección de péptidos monomérico amiloide-β42 para generar toxicidad amiloide en pez cebra adulto para establecer un modelo de la enfermedad de Alzheimer, seguido por análisis histológicos y la detección de agregaciones.
Abstract
Enfermedad de Alzheimer (EA) es una debilitante enfermedad neurodegenerativa en la que la acumulación de amiloide tóxico-β42 (Aβ42) péptidos conduce a degeneración sináptica, inflamación, muerte neuronal y déficit de aprendizaje. Los seres humanos no pueden regenerar las neuronas perdidas en el caso de AD en parte debido a la deteriorada capacidad proliferativa de las células progenitoras neuronales (NSPCs) y reducción de la neurogénesis. Por lo tanto, terapias regenerativas eficaces también deben aumentar la proliferación y capacidad neurogénica NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) es un organismo regenerativo y podemos aprender los programas moleculares básicos que podríamos diseñar enfoques terapéuticos para hacer frente a AD. Por esta razón, fue necesaria la generación de un modelo de AD-como en el pez cebra. Con nuestra metodología, podemos introducir derivados sintéticos de Aβ42 péptido con capacidad penetrante de tejido en el cerebro del pez cebra adulto y analizar la patología de la enfermedad y la respuesta regenerativa. La ventaja sobre los métodos existentes o modelos animales es que pez cebra puede enseñarnos cómo un cerebro vertebrado puede regenerar naturalmente y así nos ayudan a tratar mejor las enfermedades neurodegenerativas humanas dirigiéndose NSPCs endógenas. Por lo tanto, el modelo de toxicidad del amiloide en el cerebro del pez cebra adulto puede abrir nuevas avenidas para la investigación en el campo de la neurología y la medicina clínica. Además, la ejecución simple de este método permite la evaluación experimental rentable y eficiente. Este manuscrito describe la síntesis y la inyección de péptidos de Aβ42 en cerebro de pez cebra.
Introduction
AD es una enfermedad progresiva crónica caracterizada por la pérdida de neuronas y sinapsis en la corteza cerebral1,2,3,4,5. Los sellos clásicos de neuropathological del anuncio son los depósitos de péptidos amiloides y formación de los ovillos enredos (NFTs)6. Las placas seniles, también conocido como placas amiloideas, están compuestas de péptidos amiloide-β (Aß) que forman estructuras de β-plisadas en el parénquima cerebral del5. La acumulación de Aβ42 en pacientes con EA tiene un papel temprano y crítico en la progresión de la enfermedad. Anuncio desencadena una cascada de eventos que llevan a disfunción sináptica y plasticidad deteriorada pérdida neuronal7,8,9,10.
El cerebro adulto del pez cebra teleósteos sirve como un excelente modelo para estudiar la regulación de la célula de vástago plasticidad11,12,13,14,15, 1617,de,18,19,20 y diversas enfermedades en el sistema nervioso central (SNC), incluyendo AD21,22,23 ,24. Debido a una gran variedad de métodos experimentales disponibles19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, estos estudios son informativos y factible. Pez cebra puede llenar el CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, en parte mediante el uso de programas moleculares activados después de la pérdida neuronal19,39,40,41,42,43, 44. Por lo tanto, establecer un modelo de enfermedad neurodegenerativa en el pez cebra puede ayudar a resolver las preguntas novela sobre biología Regenerativa de capacidad y células madre en cerebros vertebrados.
Recientemente, hemos desarrollado un modelo de la toxicidad del amiloide en cerebro de pez cebra adulto inyectando sintético Aβ42 péptidos (tabla 1)39. Esta inyección causa neurodegeneración fenotipos de patología del cerebro humano (p. ej., muerte celular, la activación microglial, degeneración sináptica y déficits de la memoria), que indica ese pez cebra puede ser utilizado para la obtención de neurodegeneración en cerebro de pez cebra, Aβ42 péptidos pueden ser detectados con los stainings de immunohistochemical y mecanismos moleculares de la regeneración en pez cebra adulto que CNS puede ser identificado39. En este protocolo, demostramos la inyección de péptidos sintéticos de amiloide en el cerebro de pez cebra con cerebroventricular inyección (CVMI) método27,39,45,46 para imitar la deposición amiloidea (figura 1). CVMI ofrece una forma novedosa de entregar los péptidos, que agregan a inyección como estructuras de β-hoja y ejercen toxicidad. Los péptidos se distribuyen uniformemente a través del cerebro, a la zona ventricular a lo largo del eje rostro caudal entero45. Además, este método permite analizar la respuesta morfológica y molecular de las NSPCs en cerebro de pez cebra adulto después de inclusiones amiloideas. Este tipo de estudios nos dará una idea para la reparación exitosa del cerebro en mamíferos. Nuestro método puede utilizarse para comprender el mecanismo molecular necesario de una respuesta exitosa regeneración después de los síntomas de AD-como para inducir la reposición de las neuronas perdidas y recuperación funcional.
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Protocol
este protocolo es un procedimiento estándar sugerido por las directrices de la UE (2010/63) y la sociedad europea de modelos de peces en biología y medicina (EuFishBioMed) en Karlsruhe Instituto de tecnología (KIT). Todos los métodos descritos después de aquí han sido aprobados por la Comisión de ética (Landesdirektion Dresden; número TVV-52/2015).
1. preparación de Aβ42 péptido
- sintetizar péptidos (ver tabla 1) utilizando la química estándar 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) con 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) como el reactivo de acoplamiento en un sintetizador de péptidos de fase sólida automatizada 52. La escala de la síntesis fue μmol 100.
- Carga el sintetizador de péptidos automatizada con 500 mg de la resina de Fmoc-protegido como la fase sólida (capacidad de 0,2 mmol/g de carga). Los aminoácidos Fmoc-protegidos disueltos a una concentración 0,5 M de la carga en el volumen requerido y calculado para el sintetizador respectivo.
Nota: Los cálculos se hacen para permitir el acoplamiento de cada aminoácido protegido de Fmoc dos veces con el exceso de 5 veces de cada bloque de edificio para la resina 47. - Disolver los reactivos necesarios para la síntesis de péptidos en dimethlyformamide (DMF). Por ejemplo, preparar el activador, HBTU, en una concentración de 0,48 M, 45% v/v N-Methylmorpholine (NMM) (la base) y el 5% v/v anhídrido acético (la mezcla que capsula) para los grupos aminos no reaccionó.
- Desdoblan los péptidos de la resina mezclando continuamente el soporte sólido mediante un mezclador en una mezcla de escote recién preparada de ácido trifluoroacético (TFA): Triisopropylsilane(TIS): agua: Dithiothreitol (DTT) a 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), para 4 h. Use 10 mL para la escala de síntesis de 100 μmol.
- Precipitar el producto exfoliado mediante la adición de la mezcla de escote a 100 mL de éter de dietilo helada. Pasar a través de una unidad de filtración con un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) con un tamaño de poro de 0,45 μm y lavado con éter dietílico helada de 20 mL.
- Recoger el péptido filtrado desde el papel de filtro y disolver 100 mg de péptido precipitado en 5 mL de agua destilada desionizada agua: acetonitrilo 1:1.
- Purificar por cromatografía líquida alta presión fase inversa (CLAR) en un HPLC semi-preparativa equipado con una columna porosa poliestireno divinilbenceno de grano tamaño 10 μm.
- Calentar previamente la columna y se mantiene a 50 ° C utilizando una columna de aparato de la calefacción. Se recogerán todas las fracciones principales utilizando un colector de fracciones automatizada aplicando un gradiente de 5% a 100% solvente B durante 25 min a 4 mL/min
Nota: A solvente es 0.1% TFA en el agua y el solvente B es 0.1% TFA en acetonitrilo 52. - Monitorear el cromatograma a 220 nm, recoger los picos adecuados y analizar mediante LC-MS.
- Calentar previamente la columna y se mantiene a 50 ° C utilizando una columna de aparato de la calefacción. Se recogerán todas las fracciones principales utilizando un colector de fracciones automatizada aplicando un gradiente de 5% a 100% solvente B durante 25 min a 4 mL/min
- Confirmar la pureza de marcha analítica fase ultra alta presión líquida cromatografía (UPLC) a 220 nm controlando con un Detector Ultravioleta pasando la muestra por una columna C18 analítica (grano tamaño 1.7 μm). Espectrometría de masas para confirmar el producto péptido.
Nota: La UPLC es acoplada a una espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) y el tándem cuadrupolo Detector. - Liofilizar las fracciones correcta del péptido deseado en un matraz de fondo redondo, aplicando un vacío de 0.052 mbar, para un polvo mullido. Acoplar la bomba de vacío a una unidad de congelación mantenida indefinidamente a-78 ° C. tienda a-80 ° C,.
- Utilizar el péptido liofilizado para preparar una solución stock de 1 mM en una mezcla de acetonitrilo: DMF: agua de grado analítico en el 1:1:1 para los experimentos. Esta solución se puede conservar durante al menos 6 meses, como los péptidos no se agregan en esta solución.
2. Preparación de la mezcla de inyección
- preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) para la dilución de los péptidos liofilizados.
- Disolver el péptido a una concentración final de 20 μm en PBS. Preparar esta solución fresca. Mezcla bien y almacenar en hielo hasta la inyección. No exceda 30 min para evitar la agregación en solución.
3. Anestesia
sistema- Prepare la solución de los anestésicos, 0.1% etil-m-aminobenzoato methanesulphonate (MESAB), en agua de pescado regular de la circulación. Preparar la solución para la anestesia a una concentración final de 0.0025% (v/v).
- Quitar el número deseado de peces de los tanques en un recipiente de transporte con 5 L de agua del sistema.
- Mitad-llenar un plato de Petri (90 mm) con anestésicos de 40 mL de plástico. Utilizar este plato para las inyecciones.
- Incubar los peces en los anestésicos hasta que haya cesado el movimiento opercular.
4. Cerebroventricular microinyección
- preparación de aparatos de inyección
- preparar el vidrio capilares de inyección utilizando un extractor de aguja con los siguientes parámetros: calefacción de ciclo, 537, tirando ciclo, 250, velocidad, 1.5 s; tiempo, la Sra. 80
- hacer el ajuste de presión en la fuente de presión 25 psi.
- Configurar los parámetros de microinyectora para lo siguiente: Mantenga presión de 20 psi, presión de expulsión 10 psi; período valor 2.5 bloquea la Sra. valor 100
- Cargar el capilar de vidrio con la solución de la inyección. Introduzca el capilar de vidrio en el soporte de microinyección. Ajustar el ángulo de inyección de 45°.
Nota: Los protocolos más detallados pueden encontrarse como se describe en referencias 27 , 46.
- Llenan de un peces lugar en una nueva placa de Petri con solución para la anestesia (como en el paso 3.3).
- Mantener el pescado con las pinzas y Oriente para la inyección.
- Generar un corte con la punta de una aguja de 30 G en el cráneo en El tectum óptico donde se unen las dos placas laterales. No introduzca la punta en el tejido cerebral, esto causaría sangrado y daño. Ver referencias 27 , 45 , 46 para obtener más detalles.
- Introduzca el capilar de vidrio en la abertura.
- Usar la punta de la aguja y no penetran más de 1 mm a través del cráneo. Sigue aguantando el pescado e inserte la punta del vaso capilar a través del sitio de incisión.
- Orientar la punta del vaso capilar hacia el telencéfalo a un ángulo de 45°. Inyectar 1 μl de la solución. El líquido se dispersa inmediatamente después de la inyección.
5. Recuperación
- lugar los peces hacia un contenedor de transporte hasta que recupera. Conectar el recipiente para el agua de peces regularmente circulante para asegurar la calidad óptima de agua.
Nota: La recuperación debe tomar 1 minuto. Si tarda más, el pescado debe mantenerse en los anestésicos durante un tiempo más corto (esto debe de ser optimizado por el experimentador).
- esperar un período de tiempo antes de sacrificar a los peces.
Nota: Esto depende de la pregunta experimental. Deposición amiloidea puede verse tan solo 1 día después de la inyección. - Sacrificar a los peces utilizando el método apropiado dependiendo de las normas éticas (por ejemplo, tratar a los peces con 0,1 M MESAB).
- Abrir el cráneo sobre El tectum óptico utilizando pinza puntiaguda en la parte dorsal y disecar la cabeza justo detrás de la aleta pectoral con un bisturí.
- Fijar las cabezas usando 2% paraformaldehido (PFA) durante la noche a 4 ° C. utilizar 3 mL de PFA por cabeza en un tubo de plástico con una tapa del tornillo de.
PRECAUCIÓN: Use el equipo de protección personal cuando maneje PFA. - Para crioprotección y descalcificación, lavarse la cabeza tres veces en 0.1M tampón fosfato (pH 7,4), transferencia en 20% sucrose/20% etilendiaminotetracético (EDTA) solución e incubar durante la noche a 4 ° C.
- Para incrustar el tejido en la resina, de seccionamiento congelar las cabezas en la solución de sacarosa 7,5% gelatin/20% en moldes de histología plástica en hielo seco (aproximadamente 3-5 min para congelar un bloque). Almacenar las muestras a-80 ° C o seguir el siguiente paso (cryosectioning).
- Sección las cabezas en cryosections gruesa de 12 μm utilizando un criostato como descrito 28 , 42. Transferir los cryosections directamente sobre los portaobjetos de vidrio y conservarlo a-20 ° C para uso a largo plazo.
7. Tinción inmunohistoquímica y la microscopia
Nota: realizar todos los pasos de incubación en una cámara humidificada. Y todos los pasos de lavado son de 10 minutos cada uno.
- Secar las secciones durante 30 min a temperatura ambiente. Después de descongelar, lavar las secciones dos veces en PBS y una vez en PBSTx (PBS con 0,03% Tritón X-100).
- Incubar con el anticuerpo primario (anticuerpo anti-Aβ42; dilución 1: 500 en PBSTx) a 4 ° C durante la noche tras día, lavar una vez en PBS y dos veces en PBSTx.
- Incubar las secciones con el anticuerpo secundario (detección de fluorescencia junto, dilución 1: 500) junto con DAPI (1 μg/mL) en PBSTx por 2 h a temperatura ambiente.
- Lavado tres veces en PBSTx. Después del lavado final, montar el portaobjetos con un cubreobjetos usando glicerol de 70% de 100 μL.
- Adquirir imágenes fluorescentes utilizando un microscopio confocal (por ejemplo con objetivo 20 X PL APO N.A. 0.7 con 488 rango de excitación y un filtro verde estándar; figura 2) 39.
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Representative Results
HPLC se utiliza para purificar el péptido sintetizado y espectrometría de masas se ha utilizado para caracterizar los péptidos β amiloide purificada. La columna HPLC se calienta a 50 ° C para mejorar la separación de los péptidos Aβ y se recolectaron las fracciones. Para identificar el péptido sintetizado correctamente, se realizó análisis de espectrometría de masas para todas aquellas fracciones. El cromatograma UPLC muestra la pureza del compuesto. La fracción HPLC que produjo un pico en la UPLC (es decir, la correcta masa para cargar cociente del péptido β amiloide requiere) fue procesada más lejos para los experimentos (figura 2).
La funcionalidad de los péptidos en la formación de agregados puede evaluarse utilizando diferentes métodos espectroscópicos39,48,49, y también por los péptidos en PBS a temperatura ambiente durante más de 1 h de incubación, que producción de agregados. En este caso, precipitados y agregados grandes puede considerarse en la solución.
Después de la microinyección cerebroventricular, los péptidos agregados en las declaraciones de amiloide cerebral y forma (figura 3). Estos agregados se ven sobre todo como depósitos intracelulares, pero también alrededor de los vasos sanguíneos. Estas agregaciones son indicaciones de una exitosa acumulación de péptidos amiloides en el tejido.
Figura 1: representación esquemática de la síntesis de péptidos, purificación, inyección y análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: caracterización del péptido amiloide nativo-β42. Caracterización de la espectrometría de masa del péptido amiloide-β42 nativo (A) y el péptido amiloide-β42 etiquetado de CPP (TR-Aβ42; B). (C) la cromatografía de la purificada, natural y TR-Aβ42 péptido en la cromatografía de líquido ultraalta presión (UPLC). Axes denotan la relación masa / carga (m/z) (A, B) y el tiempo de elución en minutos (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: la coloración de Immunohistochemical de la deposición amiloidea en una sección del cerebro del pez cebra adulto 1 día después de la inyección. Aβ42 es en verde, y los núcleos están en azul. Detección de clusters verdes indica eficiente agregación de Aβ42. Barras de escala = 100 μm. Esta figura ha sido modificada de referencia39.
| Péptido | Secuencia de péptido | MW (g/mol) | |||
| AΒ42 | DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 4514.1 | |||
| TR-AΒ42 | GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 5919.8 | |||
Tabla 1: Secuencias de péptidos Aβ42 y TR-Aβ42.
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Discussion
Los péptidos amiloides pueden modificarse para incluir variaciones de secuencia o varias etiquetas. Por ejemplo, se puede generar un péptido amiloide revuelto, y los péptidos pueden ser marcados con etiquetas fluorescentes en el N-terminal del extremo del péptido o etiquetados portador péptidos39. Del mismo modo, en el presente Protocolo, el péptido portador es el penetrar en la célula péptido TR debido a su eficacia para el transporte de carga profunda en el tejido cerebral del39. Además, nuestro método permite la inyección y los análisis de péptidos diferentes que pueden causar las agregaciones tóxicos50,51. Por lo tanto, nuestro sistema ofrece un método versátil para inyección manual de proteínas tóxicas en el cerebro de pez cebra y analizar los efectos celulares de dicha toxicidad.
Péptidos amiloides agregados rápidamente y por lo tanto, las acciones deben mantenerse en la solución agua-DMF-acetonitrilo y deben mezclarse con PBS solo 0,5 h antes de la inyección. Si hay grandes agregados de la solución, la solución de la inyección se preparara en sólo 10 minutos antes de la inyección. Eficiencia de la inyección es un parámetro importante para la obtención de resultados consistentes. Por favor consulte nuestro anterior JoVE papel46 para realizar una inyección de buena y consistente. Si no se observa ninguna agregación después de la inyección, el método de inyección debe ser optimizado.
Nuestro método es limitado en cuanto al tamaño de las moléculas que se inyecta. Anteriormente demostramos que los plásmidos u oligómeros cortos se pueden tomar eficientemente por las células ventriculares45,46, sin embargo, para la entrega eficiente en los tejidos cerebrales profundos, las moléculas grandes (p. ej., anticuerpos, grandes no se puede utilizar las proteínas). Además, las moléculas lipofílicas pueden no penetrar fácilmente los tejidos profundos porque estas moléculas serán secuestradas por las primera pocas capas de células ventriculares.
La generación de modelos de ratón de la neurodegeneración es desperdiciador de tiempo y mantenimiento de estos modelos es bastante caro. Nuestro método de inyección es un modelo rápido de deposición amiloide tóxico y neurodegeneración. Además, el pez cebra tiene una capacidad regenerativa superior en comparación con modelos mamíferos, y las investigaciones centrándose en cerebros de vertebrados cómo podrían montar una respuesta de regeneración después de neurodegeneración se beneficiará seguramente de sistemas de ensayo rápido en pez cebra.
La calidad del péptido sintetizado y su pureza son importantes para el éxito del experimento. Para garantizar esta calidad, péptidos sintetizados deben caracterizarse completamente mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas. Además, se sugieren estudios agregación y dicroísmo circular descrito39 .
Inyección en el cerebro de peces es un paso crítico para asegurar una agregación consistente y resultados patológicos. Un estudio longitudinal que analiza la dinámica de agregación y separación de los péptidos amiloides puede realizarse, si así lo desea. Utilizamos un amiloide péptido acoplado a un péptido portador para asegurar la distribución equitativa y la penetración en el tejido cerebral. Péptidos amiloides desacoplados también dan resultados similares pero la línea de tiempo de distribución y agregación es diferentes39. El experimentador puede elegir la versión que desee de péptidos amiloides dependiendo el objetivo.
Hay gran potencial para el uso de nuestro método en combinación con otros estudios de manipulación. CVMI de péptidos amiloides puede combinarse con tratamientos farmacológicos o la inyección de otros compuestos para probar los efectos sinérgicos de varias moléculas en una condición de la enfermedad. En definitiva, nuestro modelo rápido y novedoso también puede utilizarse para enfoques de detección de drogas en pequeña escala en un entorno de laboratorio fácil.
Nuestro método de microinyección manual puede utilizarse eficientemente para inyectar péptidos amiloides en el cerebro del pez cebra adulto para imitar la deposición amiloidea. Depósitos amiloides en el cerebro provocan efecto citotóxico y resultados en patología de la AD, por lo tanto mostrando una condición neurodegenerative aguda. Las perspectivas futuras de este método sería utilizar en un modelo degenerativo agudo para el estudio de la neuropatología en cerebro de pez cebra y la respuesta regenerativa mismo. Tal entendimiento proporcionará una importante plataforma para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por DZNE y la Asociación Helmholtz (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) y DFG (KI1524/6) (CK); y por la Asociación de Leibniz (Sierra-2011-IPF-2) y el BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). También nos gustaría agradecer a Ulrike Hofmann para síntesis de péptidos y Nandini Asokan, Prayag Murawala y Elly Tanaka durante la filmación del procedimiento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
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