Summary
Ce protocole décrit la synthèse, la caractérisation et injection de peptides de monomère amyloïde-β42 pour générer les toxicité amyloïde dans adult poisson zèbre à établir un modèle de la maladie d’Alzheimer, suivi d’analyses histologiques et détection de agrégations.
Abstract
La maladie d’Alzheimer (ma) est une maladie neurodégénérative quelle accumulation d’amyloïde toxique-β42 des peptides (Aβ42) mène à la dégénérescence synaptique, l’inflammation, la mort neuronale débilitante et déficits d’apprentissage. Les humains ne peut pas régénérer les neurones perdus dans le cas de l’AD en partie en raison de la capacité de prolifération réduite des cellules souches/progénitrices neurales (NSPC) et réduit la neurogenèse. Par conséquent, thérapies régénératives efficaces devraient également accroître la prolifération et neurogène de NSPC. Zebrafish (Danio rerio) est un organisme régénératrice, et nous pouvons apprendre les programmes moléculaires fondamentales avec laquelle nous pourrions concevoir approches thérapeutiques pour lutter contre les AD. Pour cette raison, la génération d’un modèle AD-comme chez le poisson zèbre était nécessaire. En utilisant notre méthodologie, nous pouvons introduire synthétiques dérivés du peptide Aβ42 avec capacité de pénétration tissulaire dans le cerveau adulte poisson-zèbre et analyser la pathologie de la maladie et la réponse régénératrice. L’avantage sur les méthodes existantes ou des modèles animaux est que ce poisson zèbre peut nous apprendre comment un cerveau vertébré peut régénérer naturellement et ainsi nous aider à traiter les maladies neurodégénératives humaines mieux en ciblant les NSPC endogène. Par conséquent, le modèle amyloïde-toxicité dans le cerveau du poisson-zèbre adulte peut ouvrir de nouvelles avenues pour la recherche dans le domaine des neurosciences et de la médecine clinique. En outre, l’exécution simple de cette méthode permet d’évaluation expérimentale rentable et efficace. Ce manuscrit décrit la synthèse et l’injection de peptides Aβ42 dans le cerveau du poisson-zèbre.
Introduction
AD est une maladie chronique caractérisée par la perte des neurones et de synapses dans le cortex cérébral1,2,3,4,5. Les caractéristiques neuropathologiques de la maladie classiques de publicité sont les dépôts de peptides amyloïdes et formation de la neurofibrillaire embrouillent (NFTs)6. Les plaques séniles, également connu sous le nom de plaques amyloïdes, sont composés de peptides amyloïdes-β (Aβ) qui forment des structures β-plissées dans le parenchyme de cerveau5. L’accumulation de Aβ42 dans Alzheimer joue un rôle critique et début dans la progression de la maladie. AD déclenche une cascade d’événements conduisant à la dysfonction synaptique, plasticité avec facultés affaiblies et perte neuronale7,8,9,10.
Le cerveau adulte des téléostéens poisson zèbre sert un excellent modèle pour étudier la régulation de la plasticité des cellules souches11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 et diverses maladies dans le système nerveux central (CNS), y compris AD21,22,23 ,,24. Grâce à une vaste gamme de méthodes expérimentales disponibles19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, ces études sont informatifs et réalisable. Poisson zèbre peut reconstituer le CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, en partie à l’aide de programmes moléculaires activés après la perte neuronale19,39,40,41,42,43, 44. Par conséquent, établissant un modèle de maladie neurodégénérative chez le poisson zèbre peut aider à poser des questions nouvelles concernant la biologie régénératrice de capacité et de cellules souches dans les cerveaux vertébrés.
Récemment, nous avons développé un modèle de toxicité amyloïde dans le cerveau du poisson-zèbre adulte en injectant synthétique Aβ42 peptides (tableau 1)39. Cette injection causé des phénotypes de neurodégénérescence réminiscent de la pathologie du cerveau humain (p. ex., la mort cellulaire, activation microgliale, dégénérescence synaptique et les déficits de mémoire), indiquant que poisson zèbre peut être utilisée pour susciter neurodégénérescence dans le cerveau du poisson-zèbre, Aβ42 peptides peuvent être détectées avec salissures immunohistochimiques et mécanismes moléculaires de la régénération chez le poisson zèbre adulte, que CNS peut être identifié39. Dans ce protocole, nous démontrons l’injection de synthétiques peptides amyloïdes dans le cerveau de poisson-zèbre à l’aide d’un cérébroventriculaire injection (CVMI) méthode27,39,45,46 pour imiter le dépôt amyloïde (Figure 1). CVMI propose une nouvelle façon d’offrir les peptides, qui agrègent à injection en tant que structures feuillet β et exercer une toxicité. Les peptides sont réparties uniformément dans tout le cerveau, en ciblant la zone ventriculaire le long de l' axe rostro-caudal ensemble45. En outre, cette méthode permet pour analyser la réponse morphologique et moléculaire de la NSPC dans le cerveau adulte poisson zèbre suite des inclusions amyloïdes. Ces études nous donnera un aperçu de la réparation du cerveau réussie chez les mammifères. Notre méthode peut être utilisée pour comprendre le mécanisme moléculaire nécessaire d’une réponse de régénération réussie après AD-comme des symptômes d’induire la reconstitution des neurones perdus et la récupération fonctionnelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ce protocole est une procédure standard proposée par les orientations de l’UE (2010/63) et la société européenne pour les modèles de poissons en biologie et en médecine (EuFishBioMed) à Karlsruhe Institut de technologie (KIT). Toutes les méthodes décrites après ici ont été approuvés par la commission d’éthique (Landesdirektion Dresden ; le numéro TVV-52/2015).
1. préparation du Peptide Aβ42
- synthétiser des peptides (voir tableau 1) en utilisant la chimie standard 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc) avec 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) comme le réactif de couplage sur un synthétiseur de peptide de phase solide automatisé 52. L’ampleur de la synthèse est 100 µmol.
- Charger le synthétiseur de peptide automatisé avec 500 mg de la résine Fmoc-protégés comme la phase solide (capacité de chargement de 0,2 mmol/g). Charger les dissous Fmoc-protégé des acides aminés à une concentration de 0,5 M dans le volume nécessaire et calculé pour le synthétiseur respectif.
Remarque : Les calculs sont effectués pour permettre l’accouplement de chaque acide aminé Fmoc-protégé deux fois avec un excès de 5 fois de chaque bloc de construction à la résine 47. - Dissoudre les réactifs nécessaires pour la synthèse de peptide dans dimethlyformamide (DMF). Par exemple, préparer l’activateur, HBTU, à une concentration de 0,48 M, 45 % v/v N-méthylmorpholine (NMM) (la base) et 5 % v/v Anhydride acétique (le mélange de plafonnement) de plafonner les groupes aminés non-réagi.
- S’attacher tous les peptides de la résine en mélangeant constamment l’appui solide à l’aide d’un agitateur dans un mélange de clivage fraîchement préparé constitué d’acide trifluoroacétique (TFA) : Triisopropylsilane(TIS) : l’eau : le dithiothréitol (DTT) à 90 (v/v) : 5 (v/v) : 2.5 (v/v) : 2,5 (m/v), pour 4 h. utiliser 10 mL de la grille de synthèse de 100 µmol.
- Précipiter le produit clivé en ajoutant le mélange de clivage à l’éther diéthylique glacée 100 mL. Passer par une unité de filtration contenant un filtre de polytétrafluoroéthylène (PTFE) avec une taille de pores de 0,45 µm et laver avec de l’éther diéthylique glacée de 20 mL.
- Recueillir le peptide filtré de papier-filtre et dissoudre 100 mg de précipité peptide dans 5 mL d’eau désionisée distillée : acétonitrile au 1:1.
- Purifier par chromatographie liquide à haute pression phase inverse (CLHP) sur une HPLC semi-préparative équipé d’une colonne poreux polystyrène divinylbenzène de perle taille 10 µm.
- Préchauffer la colonne et maintenir à 50 ° C à l’aide d’une colonne de dispositif de chauffage. Collecter toutes les principales fractions à l’aide d’un collecteur de fraction automatisé en appliquant un dégradé de 5 % à 100 % de solvant B pendant 25 min à 4 mL/min.
NOTE : A solvant est 0,1 % TFA dans l’eau et solvant B est 0,1 % TFA dans l’acétonitrile 52. - Surveiller le chromatogramme à 220 nm, recueillir les sommets appropriés et d’analyser à l’aide de la LC-Mme
- Préchauffer la colonne et maintenir à 50 ° C à l’aide d’une colonne de dispositif de chauffage. Collecter toutes les principales fractions à l’aide d’un collecteur de fraction automatisé en appliquant un dégradé de 5 % à 100 % de solvant B pendant 25 min à 4 mL/min.
- Confirmer la pureté par analyse inverse la phase ultra-haute pression Liquid Chromatography (UPLC) à 220 nm en surveillant avec un détecteur UV en passant de l’échantillon à travers une colonne analytique de C18 (perle taille 1,7 µm). Confirmer le produit de peptide par spectrométrie de masse.
Remarque : L’UPLC est couplée à une spectrométrie de masse d’ionisation par électrospray (ESI-MS) et le détecteur quadripolaire Tandem. - Lyophiliser les fractions correctes du peptide désiré dans un ballon à fond rond, en appliquant un vide de 0,052 mbar, à une poudre pelucheuse. Coupler la pompe à vide sur une unité de congélation maintenue indéfiniment à-78 ° C. conserver à-80 ° C,.
- Utiliser le peptide lyophilisé pour préparer une solution de 1 mM dans un mélange d’acétonitrile : DMF : eau de pureté analytique au 1:1:1 pour les expériences. Cette solution peut être conservée pendant au moins 6 mois, comme les peptides ne s’agrègent pas dans cette solution.
2. Préparation de la bouillie d’Injection
- préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (137 mM NaCl, KCl, 2,7 mM 10 mM Na 2 HPO 4 mM 2 KH 2 PO 4, pH 7,4) pour diluer les peptides lyophilisés.
- Dissoudre le peptide à une concentration finale de 20 µM dans du PBS. Préparer cette solution douce. Bien mélanger et conserver sur la glace jusqu'à l’injection. Ne dépassez pas 30 min pour empêcher l’agrégation dans solution.
3. Anesthésie
système de- préparer la solution mère des anesthésiques, 0,1 %-m-aminobenzoate d’éthyle méthanesulfonate d’éthyle (MESAB), dans l’eau poissons régulier de la circulation. Préparer la solution d’anesthésie à une concentration finale de 0,0025 % (v/v).
- Enlever le nombre désiré de poissons à leurs chars dans un conteneur de transport avec 5 L d’eau du système de.
- Demi-remplissez un plastique boîte de Pétri (90 mm) avec les anesthésiques de 40 mL. Utilisez ce plat pour les injections.
- Incuber les poissons dans les anesthésiques, jusqu'à ce que le mouvement operculaire a cessé.
4. Microinjection cérébroventriculaire
- préparation des appareils d’injection de
- préparer le verre capillaires de l’injection à l’aide d’un extracteur de l’aiguille avec les paramètres suivants : chauffage, cycle, 537 cycle, 250 ou vitesse, traction 1,5 s ; temps, Mme 80
- faire le réglage de la pression sur la source de pression 25psi.
- Définir les paramètres de microinjector à ce qui suit : cale 20 lb/po2 de pression, pression d’éjection 10 lb/po2 ; période valeur 2,5 ; gating valeur 100 m
- Charger le capillaire de verre avec la solution injectable. Insérez le capillaire de verre dans le support de microinjection. Régler l’angle d’injection à 45°.
NOTE : Des protocoles plus détaillés peuvent être trouvés comme décrit dans références 27 , 46.
- Une poissons Place dans une autre boite de Petri rempli de la solution d’anesthésie (comme à l’étape 3.3).
- Tenir le poisson avec la pince et l’orient pour injection.
- Génèrent une fente à l’aide de la pointe d’une aiguille de 30 G dans le crâne sur le tectum optique où les deux plaques latérales se rencontrent. Ne pas insérer l’embout dans le tissu cérébral, cela causerait des saignements et des dommages. Voir références 27 , 45 , 46 pour plus de détails.
- Insérer le capillaire de verre dans le slit.
- Utiliser seulement la pointe de l’aiguille et ne pénètrent pas plus de 1 mm à travers le crâne. Garder tenant le poisson et introduire l’embout du verre capillaire à travers l’incision de.
- Orienter l’extrémité du verre capillaire vers le télencéphale à un angle de 45°. Injecter 1 µL de la solution. Le liquide se disperse immédiatement après l’injection.
5. Récupération
- replacer le poisson dans un conteneur de transport jusqu'à ce qu’il récupère. Raccorder le réservoir à l’eau de poisson circulant régulièrement pour assurer une qualité optimale de l’eau.
NOTE : La reprise devrait normalement prendre 1 min. Si elle prend plus de temps, les poissons doivent être conservées sous les anesthésiques pendant une période plus courte (cela doit être optimisée par l’expérimentateur).
- attendre un certain temps avant de sacrifier le poisson désiré.
Remarque : Cela dépend de la question expérimentale. Les dépôts amyloïdes sont visibles dès le 1 jour après l’injection. - Sacrifier le poisson à l’aide de la méthode appropriée selon les règlements éthiques (p. ex., traiter le poisson avec 0,1 M MESAB).
- Fend le crâne au-dessus de tectum optique à l’aide d’instrument pointu sur la face dorsale et disséquer la tête juste derrière les nageoires pectorales à l’aide d’un scalpel.
- Fixer les têtes à l’aide de 2 % de paraformaldéhyde (PFA) durant la nuit à 4 ° C. utiliser 3 mL de PFA par habitant dans un tube en plastique avec un couvercle à vis.
ATTENTION : Porter l’équipement de protection individuelle approprié lorsque vous manipulez les PFA. - Pour cryoprotection, décalcification, nettoyer les têtes de trois fois au 0,1 M tampon Phosphate (pH 7,4), puis transférez-les dans la solution d’EDTA (EDTA) sucrose/20% 20 % et incuber une nuit à 4 ° C.
- Pour incorporer le tissu en sectionnant la résine, congeler les têtes dans une solution de sucrose 7,5 % gelatin/20% dans des moules en plastique histologie sur la glace sèche (environ 3-5 min de geler un bloc). Stocker les échantillons à-80 ° C ou passez à l’étape suivante (cryosectioning).
- De l’article les têtes dans cryosections épais de 12 µm à l’aide d’un cryostat comme décrit 28 , 42. Transférer les cryosections directement sur lames de verre et conserver à-20 ° C pour une utilisation à long terme.
7. Microscopie et coloration immunohistochimique
Remarque : effectuez toutes les étapes d’incubation dans une chambre humidifiée. Et, toutes les étapes de lavage sont pour chaque 10 min.
- Sécher les sections pendant 30 min à température ambiante. Après décongélation, laver les sections deux fois dans du PBS et une fois dans PBSTx (PBS avec 0,03 % Triton-X-100).
- Incuber avec l’anticorps primaire (anticorps anti-Aβ42 ; dilution 1/500 en PBSTx) à 4 ° C pendant la nuit. suite de jour, laver une fois dans du PBS et deux fois dans PBSTx.
- Incuber les sections avec l’anticorps secondaire (détection de fluorescence couplés, dilution de 1/500) ainsi que de DAPI (1 μg/mL) en PBSTx pendant 2 h à température ambiante.
- Laver trois fois à PBSTx. Après le lavage final, monter les lames avec un lamelle couvre-objet à l’aide de glycérol de 70 % 100 μL.
- Acquérir les images fluorescents à l’aide d’un microscope confocal (par exemple avec l’objectif 20 X PL APO N.A. 0,7 avec 488 gamme d’excitation et d’un filtre vert standard ; la figure 2) 39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HPLC servait à purifier le peptide synthétisé et spectrométrie de masse a été utilisée pour caractériser les peptides purifié β-amyloïde. La colonne HPLC a été chauffée à 50 ° C afin d’améliorer la séparation des peptides bêta-amyloïdes, et toutes les fractions ont été recueillies. Pour identifier le peptide synthétisé correctement, analyse de spectrométrie de masse a été réalisée pour toutes les fractions. Le chromatogramme UPLC montre la pureté du composé. La fraction HPLC qui a abouti à un pic sur l’UPLC (c.-à-d., la masse correcte pour charger le ratio du peptide β-amyloïde requis) a été traitée pour des expériences (Figure 2).
La fonctionnalité des peptides en formant des agrégats peut être évaluée à l’aide de diverses méthodes spectroscopiques39,48,49, et aussi en incubant les peptides dans du PBS à température ambiante pendant plus de 1 h, qui sera produire des agrégats. Dans ce cas, les précipités et les grands agrégats doivent être considérés dans solution.
Après microinjection de cérébroventriculaire, les peptides agrègent dans les dépôts amyloïdes cérébrales et de la forme (Figure 3). Ces agrégats sont principalement considérés comme dépôts intracellulaires, mais aussi autour des vaisseaux sanguins. Ces agrégations sont des indications d’une accumulation de succès de peptides amyloïdes dans les tissus.
Figure 1 : représentation schématique de la synthèse peptidique, purification, injection et des analyses. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : caractérisation du peptide amyloïde native-β42. Caractérisation de la spectrométrie de masse de peptide amyloïde native-β42 (A) et le peptide amyloïde-β42 RPC-tag (TR-Aβ42 ; B). (C) le chromatographe de purifiés, natif et le peptide Aβ42-TR sur la chromatographie en phase liquide de la pression ultra-haute (UPLC). X-axes désigne le rapport entre la masse de charge (m/z) (A, B) et le temps d’élution en minutes (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : coloration immunohistochimique des dépôts amyloïdes dans une section de cerveau de poisson-zèbre adulte 1 jour après l’injection. Aβ42 est en vert, et les noyaux sont en bleu. Détection des grappes vertes indique l’agrégation de Aβ42 efficace. Barreaux de l’échelle = 100 µm. Ce chiffre a été modifié par référence39.
| Peptide | Séquence peptidique | MW (g/mol) | |||
| AΒ42 | DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 4514.1 | |||
| TR-AΒ42 | GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 5919.8 | |||
Tableau 1 : Aβ42 et TR-Aβ42 séquences peptidiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les peptides amyloïdes peuvent être modifiés pour inclure les variations de séquence ou les différentes balises. Par exemple, un peptide bêta-amyloïde brouillé peut être généré, et les peptides peuvent être marqués avec des étiquettes fluorescentes à la N-terminale de la fin de peptide ou transporteur peptides39le tag. De même, dans le présent protocole, le peptide de transporteur est la pénétration cellulaire peptide TR en raison de son efficacité pour transport marchandise profonde dans le tissu de cerveau39. De plus, notre méthode permet injection et analyses de divers peptides qui peuvent causer des agrégations toxiques50,,51. Par conséquent, notre système offre une méthode polyvalente pour injection manuelle des protéines toxiques dans le cerveau du poisson-zèbre et analysant les effets cellulaires de cette toxicité.
Peptides amyloïdes agrégation rapidement et, par conséquent, les stocks doivent être conservés dans la solution eau-DMF-acétonitrile et doivent être mélangés avec du PBS seulement 0,5 h avant l’injection. S’il y a gros agrégats dans la solution, la solution d’injection doit être préparée uniquement 10 min avant l’injection. Efficacité de l’injection est un paramètre important à donner des résultats cohérents. Veuillez vous reporter à notre précédent du papier JoVE46 permettant d’effectuer une injection bonne et uniforme. Si aucune agrégation n’est considérée après l’injection, la méthode d’injection doit être optimisée.
Notre méthode est limitée en ce qui concerne la taille des molécules à doser. Nous avons montré précédemment que les plasmides ou oligomères courts peuvent être absorbés efficacement par les cellules ventriculaires45,46, cependant, pour une prestation efficace dans les tissus cérébraux profonds, grosses molécules (p. ex., anticorps, grands Impossible d’utiliser les protéines). En outre, les molécules lipophiles peuvent pénétrer pas facilement les tissus profonds parce que ces molécules seront séquestrés par les quelques premières couches de cellules ventriculaires.
La génération de modèles murins de la neurodégénérescence prend du temps et de l’entretien de ces modèles est assez cher. Notre méthode d’injection est un modèle rapid pour le dépôt amyloïde toxique et neurodégénérescence. En outre, le poisson-zèbre a une capacité de régénération supérieure par rapport aux modèles mammifères et investigations en se concentrant sur le cerveau des vertébrés comment pourraient monter une réponse de régénération après que neurodégénérescence bénéficiera sûrement provenant des systèmes de test rapide à poisson zèbre.
La qualité du peptide synthétisé et sa pureté sont importants pour le succès de l’expérience. Pour assurer cette qualité, peptides synthétisés doivent être soigneusement caractérisés par chromatographie liquide et spectrométrie de masse. En outre, les études dichroïsme et agrégation circulaires décrit39 sont suggérées.
Injection dans le cerveau de poisson est une étape essentielle pour assurer une agrégation cohérente et résultat pathologique. Une étude longitudinale qui analyse la dynamique de l’agrégation et la clairance des peptides amyloïdes peut être effectuée, si vous le souhaitez. Nous utilisons un peptide bêta-amyloïde couplé à un peptide de transporteur pour assurer une répartition égale et pénétration dans le tissu cérébral. Peptides amyloïdes dételés fournit aussi des résultats similaires, mais la chronologie de la distribution et l’agrégation est différents39. L’expérimentateur peut choisir la version souhaitée de peptides amyloïdes selon le but.
Il n’y a grand potentiel pour l’utilisation de notre méthode en combinaison avec d’autres études de manipulation. CVMI de peptides amyloïdes est cumulable avec les traitements médicamenteux ou injection d’autres composés pour tester les effets synergiques de diverses molécules dans un état pathologique. En fin de compte, notre modèle rapide et roman utilisable également pour des approches de dépistage des drogues à petite échelle dans un environnement de laboratoire facile.
Notre méthode de microinjection manuel peut servir efficacement à injecter des peptides amyloïdes dans le cerveau adulte poisson zèbre pour imiter le dépôt amyloïde. Des dépôts amyloïdes dans le cerveau provoquent l’effet cytotoxique et résultats en pathologie de la ma, affichant ainsi une affection neurodégénérative aiguë. Perspectives d’avenir de cette méthode consisterait à utiliser dans un modèle dégénératif aiguë pour étudier la neuropathologie dans le cerveau du poisson-zèbre et la réponse régénératrice celle-ci. Une telle compréhension fournira une plate-forme importante pour la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le DZNE et l’Association Helmholtz (VH-NG-1021), CRDT, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) et Dia (KI1524/6) (C.K.) ; et par la Communauté Leibniz (scie-2011-gif-2) et le BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Nous tenons également à remercier Ulrike Hofmann pour la synthèse de peptide et à Nandini Asokan et Prayag Murawala Elly Tanaka pour aide pendant le tournage de la procédure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
References
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
- Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
- McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
- Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
- Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
- Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
- Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
- Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
- Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
- Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
- Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
- Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
- Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
- Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
- Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
- Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
- Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
- Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).
