Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מידול עמילואיד-β42 רעילות, הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה למבוגרים

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56014
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 2, 1,3
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

Summary

פרוטוקול זה מתאר את סינתזה אפיון, הזרקה של פפטידים עמילואיד monomeric-β42 ליצירת עמילואיד רעילות של דג זברה בוגרת כדי ליצור מודל של מחלת אלצהיימר, ואחריו ניתוחים היסטולוגית וזיהוי של הסיכומים.

Abstract

מחלת אלצהיימר (AD) היא מתישה מחלות ניווניות איזה הצטברות עמילואיד רעיל-β42 פפטידים (Aβ42) מוביל ניוון סינפטית, דלקת, מוות עצביים, למידה גירעונות. בני אדם לא יכול להתחדש נוירונים אבוד במקרה של המודעה בחלקו בשל קיבולת proliferative לקוי של תאי גזע עצביים/קדמון (NSPCs) ושל נוירוג'נסיס מופחת. לכן, טיפולים משובי יעיל צריך גם לשפר את ההתפשטות neurogenic קיבולת של NSPCs-דג זברה (רזבורה rerio) הוא יצור משובי ואני נוכל ללמוד את התוכניות מולקולרי בסיסי שבו היינו יכולים לעצב גישות טיפוליות כדי להתמודד עם AD. מסיבה זו, הדור של דגם AD-כמו בדג זברה היה הכרחי. באמצעות המתודולוגיה שלנו, אנחנו יכולים להציג נגזרות סינתטי של פפטיד Aβ42 עם יכולת חדירה לרקמות לתוך המוח דג זברה למבוגרים, ולנתח המחלה פתולוגיה ואת התגובה משובי. היתרון מעל שיטות קיימות או בבעלי חיים הוא שדג זברה הזאת יכולה ללמד אותנו איך מוח חוליות יכול להתחדש באופן טבעי, ובכך לסייע לנו להתייחס מחלות ניווניות אנושי טוב יותר על ידי מיקוד NSPCs אנדוגני. לפיכך, המודל עמילואיד רעילות הוקמה במוח דג זברה למבוגרים עשוי להיפתח דרכים חדשות למחקר בתחום של מדעי המוח, רפואה קלינית. בנוסף, ביצוע פשוט בשיטה זו מאפשר הערכת ניסיוני חסכונית ויעילה. כתב יד זה מתאר את סינתזה של הזרקה של פפטידים Aβ42 למוח דג זברה.

Introduction

המודעה היא מחלה פרוגרסיבית כרונית המאופיינת על ידי האובדן של נוירונים, synapses קליפת המוח1,2,3,4,5. גולת neuropathological הקלאסית של AD הן בתצהיר של פפטידים עמילואיד וסבך היווצרות neurofibrillary (NFTs)6. שלטי סנילי, הידוע גם בשם עמילואיד הפלאק, מורכבים של פפטידים עמילואיד-β (Aβ) שיוצרים מבנים קפלים β parenchyma המוח5. ההצטברות של Aβ42 בחולים לספירה יש תפקיד מוקדם וקריטיים התקדמות המחלה. המודעה מפעילה מפל של האירועים שהובילו סינפטית בתפקוד לקוי פלסטיות, אובדן עצביים7,8,9,10.

המוח למבוגרים של דג זברה teleost משמש מודל מצויין ללמוד ברגולציה של תאי גזע פלסטיות11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 ומחלות שונות במערכת העצבים המרכזית (CNS), לרבות לספירה21,22,23 ,24. בשל מגוון רחב של שיטות נסיוניות זמין19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, מחקרים אלה הן אינפורמטיבי ריאלי. דג זברה יכול לחדש את מערכת העצבים המרכזית13,15,32,33,34,35,36,37, 38, בין השאר באמצעות תוכניות מולקולרי מופעל לאחר אובדן עצביים19,39,40,41,42,43, 44. לכן, קביעת מודל מחלות ניווניות דג זברה יכול לעזור כתובת הרומן שאלות הנוגעות משובי יכולת גזע ביולוגיה של התא במוח חוליות.

לאחרונה, פיתחנו מודל רעילות עמילואיד במוח דג זברה למבוגרים באמצעות הזרקת Aβ42 סינתטי פפטידים (טבלה 1)39. זריקה זו גרמה הקשורים ניוון מוחיים פנוטיפים מזכיר הפתולוגיה במוח האנושי (למשלמוות של תאים, microglial הפעלה, ניוון סינפטית, גירעונות זיכרון), המציין את דג זברה יכול לשמש עבור העלאת הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה, Aβ42 פפטידים יכולים להתגלות עם immunohistochemical stainings, המנגנונים המולקולריים של התחדשות של דג זברה בוגרת ש-CNS יכול להיות מזוהה39. ב פרוטוקול זה, נדגים ההזרקה של peptides סינתטי עמילואיד למוח דג זברה באמצעות של cerebroventricular הזרקה (CVMI) שיטה27,39,45,46 כדי לחקות את התצהיר עמילואיד (איור 1). CVMI מספק דרך מקורית להעביר את פפטידים, אשר צבירה בעת הזרקת כמבני β-גיליון ולעשות מאמץ רעילות. פפטידים מפוזרים באופן אחיד ברחבי המוח, פילוח האזור חדרית לאורך כל ציר rostro-סימטרית45. בנוסף, שיטה זו מאפשרת ניתוח התגובה מולקולרית מורפולוגיים של NSPCs במוח דג זברה בוגרת בעקבות תכלילים עמילואיד. מחקרים כאלה תספק לנו תובנה עבור תיקון מוצלח המוח ביונקים. השיטה שלנו יכול לשמש כדי להבין את המנגנון המולקולרי הכרחי של תגובה התחדשות מוצלחת אחרי לספירה תסמינים לזירוז חידוש המלאי של נוירונים לאיבוד שחזור פונקציונלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה הוא הליך סטנדרטי שהוצעה על ידי המנחים של האיחוד האירופי (2010/63) החברה האירופית דגים מודלים בביולוגיה ורפואה (EuFishBioMed) ב קרלסרוה המכון של טכנולוגיה (קיט). כל השיטות המתוארות לאחר כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה (Landesdirektion דרזדן; מספר המסמך לך טלוויזיה-52/2015).

1. הכנה של פפטיד Aβ42

  1. Synthesize פפטידים (ראה טבלה 1) באמצעות הכימיה תקן 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) כמו הכימית צימוד על סינתיסייזר פפטיד מוצק-פאזי אוטומטיות 52. קנה המידה של הסינתזה היה 100 µmol.
  2. לטעון את סינתיסייזר פפטיד אוטומטית עם 500 מ ג של שרף המוגנים Fmoc כמו השלב מוצק (טעינה קיבולת של 0.2 mmol/g). לטעון את המומס המוגנים Fmoc חומצות אמינו בריכוז 0.5 M באמצעי האחסון הנדרשים, כפי שמחושבת עבור סינתיסייזר בהתאמה.
    הערה: החישובים נעשים כדי לאפשר צימוד של כל חומצת אמינו המוגנים Fmoc פעמיים עם 5 פעמים עודף של כל הבניין כדי שרף 47.
  3. לפזר את ריאגנטים הנדרשים עבור פפטיד סינתזה dimethlyformamide (DMF). לדוגמה, להכין activator, HBTU, בריכוז של 0.48 M, 45% v/v N-Methylmorpholine (NMM) (הבסיס), ו-5% v/v אנהידריד אצטי (התערובת הגבלת התכיפות) וחוץ הקבוצות אמינו שאינן הגיבו.
  4. קליב כל פפטידים מן השרף ברציפות ערבוב של תמיכה מוצקה באמצעות תועמלן בתערובת המחשוף הטרי המורכב Trifluoroacetic חומצה (TFA): Triisopropylsilane(TIS): מים: Dithiothreitol (DTT) בגיל 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (וי/v): 2.5 (m/v), עבור 4 h השתמש 10 מ"ל עבור היקף סינתזה 100 µmol.
  5. לזרז את המוצר cleaved על-ידי הוספת את התערובת המחשוף דיאתיל כקרח 100 מ. עוברים דרך יחידת סינון המכילה מסנן טפלון (PTFE) עם גודל הנקבוביות של 0.45 מיקרומטר, לשטוף עם 20 מ ל קרה כקרח דיאתיל אתר.
  6. לאסוף את פפטיד מסוננים נייר הסינון, להמיס 100 מ ג של פפטיד זירז ב 5 מ ל מים יונים מזוקקים: acetonitrile-1:1.
  7. Purify דרך הפוכה-פאזי בלחץ גבוה כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) ב- HPLC מפוח למחצה מצויד עמודה נקבוביים פוליסטירול divinylbenzene של חרוז בגודל 10 מיקרומטר.
    1. מראש בחום את העמודה ולתחזק ב 50 מעלות צלזיוס משתמש בעמודה חימום התקן. לאסוף את כל השברים הגדולים באמצעות אספן שבר אוטומטית על-ידי החלת מעבר הצבע מ- 5% על 100% ממס B מעל 25 דקות ב 4 מ"ל לדקה
      הערה: החומר הממיס הוא 0.1% TFA מים, הממס B הוא 0.1% TFA ב acetonitrile 52.
    2. לפקח על chromatogram-220 nm, לאסוף את הפסגות המתאים, ולנתח תוך שימוש LC-גב'
  8. אשר הטוהר על ידי הפוך אנליטית תלת פאזי גבוהה במיוחד לחץ נוזל כרומטוגרפיה (UPLC)-220 ננומטר על-ידי ניטור עם גלאי UV תוך העברת המדגם באמצעות עמודת סי18 אנליטי (חרוז בגודל 1.7 מיקרומטר). לאשר את המוצר פפטיד באמצעות ספקטרומטר מסה.
    הערה: UPLC זה משולב של ספקטרומטריית electrospray יינון ספקטרומטר מסה (ESI-MS), גלאי פאול טנדם.
  9. Lyophilize שברים הנכון של פפטיד הרצוי בבקבוקון התחתון עגול, על-ידי החלת ואקום של 0.052 mbar, אבקה רכות. כמה את משאבת ואקום ליחידה מקפיא ומתוחזק על חנות-78 מעלות צלזיוס ב- 80 ° C, ללא הגבלת זמן.
  10. שימוש של פפטיד lyophilized כדי להכין פתרון מניות של 1 מ מ בתערובת של acetonitrile: DMF: מים אנליטית כיתה ב- 1:1:1 על הניסויים. פתרון זה ניתן לאחסן במשך לפחות 6 חודשים, כמו פפטידים ולא צבורים בפתרון זה.

2. הכנת התערובת הזרקת

  1. להתכונן באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10 מ מ נה 2 HPO 4, 2 מ מ ח' 2 PO 4, pH 7.4) דילול של פפטידים lyophilized.
  2. לפזר את פפטיד כדי ריכוז סופי של 20 מיקרומטר ב- PBS. להכין טרי פתרון זה. מערבבים היטב ולאחסן על הקרח עד הזריקה. לא יעלה על 30 דקות כדי למנוע צבירת בפתרון.

3. הרדמה

  1. הכן הפתרון מניות של הרדמה, 0.1% אתיל-m-aminobenzoate methanesulphonate (MESAB), במים רגילים דגים מלהסתובב המערכת. להכין את פתרון anaesthetization בריכוז סופי 0.0025% (v/v).
  2. להסיר את המספר הרצוי של דגים הטנקים שלהם לתוך מיכל להובלה עם 5 L של מערכת מים.
  3. חצי-מילוי פלסטיק פטרי (90 מ מ) עם 40 מ"ל הרדמה. שימוש זה מאכל לזריקות.
  4. דגירה הדג במשככי כאבים עד שחדל התנועה opercular.

4. Cerebroventricular Microinjection

  1. הכנה של מכשיר הזרקת
    1. הכן הזכוכית הזרקת נימים באמצעות של פולר מחט עם הפרמטרים הבאים: חימום מחזור, 537; מושך מחזור, 250; מהירות, 1.5 s; הפעם, גב' 80
    2. להביא את הגדרת לחץ על מקור הלחץ 25 psi.
    3. קבע את הפרמטרים microinjector הבאים: להחזיק לחץ 20 psi; הוצאת לחץ 10 psi; ערך תקופה 2.5 המגביל ערך 100 גב
    4. לטעון את נימי זכוכית עם הפתרון הזרקה. הכנס את נימי זכוכית בעל microinjection. לכוון את זווית הזריקה ° 45.
      הערה: פרוטוקולים מפורט יותר ניתן למצוא כפי שמתואר הפניות 27 , 46.
  2. מקום אחד דגים לתוך צלחת פטרי חדש מלא anaesthetization פתרון (כמו שלב 3.3).
  3. להחזיק את הדגים עם מלקחיים, אוריינט להזרקה.
  4. ליצור חתך באמצעות קצה מחט 30 גרם בתוך הגולגולת מעל tectum סיב אופטי שבו לפגוש שני לוחות לרוחב. לא להכניס את הטיפ רקמת המוח, זה יכול לגרום דימום ופגיעה. ראה הפניות 27 , 45 ,, 46, לפרטים נוספים-
  5. להוסיף את נימי זכוכית לתוך הסדק.
    1. להשתמש רק את קצה המחט, לא לחדור יותר מ 1 מ"מ דרך הגולגולת. תמשיך להחזיק את הדגים ולהוסיף קצה זכוכית נימי דרך החתך.
    2. אוריינט קצה זכוכית נימי לכיוון telencephalon בזווית של 45°. מזריקים µL 1 של הפתרון. הנוזל מפזר מיד לאחר ההזרקה.

5. שחזור

  1. המקום הדג בחזרה אל מיכל להובלה עד זה יחלים. להתחבר את המיכל המים דגים באופן קבוע במחזור כדי להבטיח איכות אופטימלית המים.
    הערה: ההתאוששות בדרך כלל צריך לקחת 1 דקות. אם זה לוקח יותר זמן, הדגים חייבים להיות כל הזמן את במשככי כאבים למשך זמן קצר יותר (זה צריך להיות מותאם על ידי הנסיין).

6. רקמות והכנה Sectioning

  1. להמתין תקופה הרצוי לפני להקריב את הדגים.
    הערה: זה תלוי השאלה ניסיוני. ניתן לראות בתצהיר עמילואיד מוקדם ככל 1 יום לאחר ההזרקה-
  2. להקריב את הדג באמצעות השיטה המתאימה בהתאם תקנות אתיות (למשל, מתייחסים הדג עם 0.1 M MESAB).
  3. לחתוך את. הגולגולת מעל tectum סיב אופטי באמצעות forcep הצביע על הצד הגבי, ומנתחים את הראש מאחוריו מקסימום באמצעות אזמל.
  4. את ראשי באמצעות 2% paraformaldehyde (PFA) בן לילה-4 ° C. השתמש 3 מ"ל של מחברים לראש צינור פלסטיק עם מכסה בורג.
    התראה: ללבוש ציוד מגן אישי המתאים את בעת טיפול PFA.
  5. עבור cryoprotection ו- decalcification, לשטוף את ראשי שלוש פעמים ב 0.1M מאגר פוספט (pH 7.4), ואז להעביר אותם לתוך 20% sucrose/20% ethylenediaminetetraacetic (EDTA) פתרון, דגירה בין לילה ב-4 מעלות צלזיוס
  6. כדי להטביע את הרקמה לתוך חלוקתה שרף, להקפיא את ראשיהם בפתרון סוכרוז gelatin/20% 7.5% בהיסטולוגיה פלסטיק בתבניות על קרח יבש (כ 3-5 דקות כדי להקפיא גוש). לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס או להמשיך לשלב הבא (cryosectioning).
  7. סעיף ראשי לתוך 12 מיקרומטר עבה cryosections באמצעות cryostat כמו שמתואר 28 , 42. להעביר את cryosections ישירות על גבי מדרון זכוכית ולאחסן ב-20 ° C לשימוש לטווח ארוך-

7. נוגדן, מיקרוסקופ

הערה: ביצוע כל הצעדים הדגירה בתוך תא humidified. כל השלבים כביסה הם 10 דקות כל אחד.

  1. יבש הסעיפים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מפשיר, לשטוף את הסעיפים פעמיים ב- PBS ופעם ב- PBSTx (PBS 0.03% טריטון-X-100).
  2. Incubate עם נוגדן ראשוני (נוגדן anti-Aβ42; שבערך דילול ב- PBSTx) ב 4 ° C בלילה. בעקבות יום, לשטוף פעם ב- PBS פעמיים ב- PBSTx.
  3. דגירה הסעיפים עם הנוגדן המשני (זיהוי מצמידים פלורסצנטיות, שבערך דילול) יחד עם דאפי (1 μg/מ"ל) ב- PBSTx עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
  4. שטיפת שלוש פעמים ב- PBSTx. לאחר השטיפה האחרונה לטעון את השקופיות עם coverslip שימוש 100 גליצרול 70% μL.
  5. ידרשו פלורסנט תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (לדוגמה עם 20 X PL APO נ. א 0.7 אובייקטיבית עם מגוון עירור 488, מסנן ירוק רגיל; איור 2) 39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HPLC שימש לטהר את פפטיד מסונתז, ספקטרומטר מסה שימש לאפיין את פפטידים β עמילואיד מטוהרים. העמודה HPLC היה מחומם ל 50 מעלות כדי לשפר את ההפרדה של פפטידים Aβ, נאספו כל השברים. כדי לזהות את פפטיד כראוי מסונתז, בוצע ניתוח לספקטרומטרית לשברים כל. Chromatogram UPLC מציג את הטוהר של המתחם. השבר HPLC הניב שיא אחד על UPLC (דהיינו, המסה נכונה לחייב יחס של פפטיד β עמילואיד נדרש) היה עיבוד נוסף לניסויים (איור 2).

הפונקציונליות של פפטידים ויוצרים אגרגטים ניתן לבדיקה באמצעות מגוון שיטות ספקטרוסקופיות39,48,49, גם על ידי המקננת על פפטידים PBS בטמפרטורת החדר במשך יותר משעה, אשר יהיה תשואות אגרגטים. במקרה זה, פוחת משקעים, אגרגטים גדולים כדאי לראות בפתרון.

לאחר cerebroventricular microinjection, צבירה פפטידים בתוך המוח ואת טופס עמילואיד התצהירים (איור 3). אגרגטים האלה נראים בעיקר התצהירים תאיים, אלא גם סביב כלי הדם. מצבורים כאלה סימנים של הצטברות מוצלחת של פפטידים עמילואיד ברקמות.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של פפטיד סינתזה, טיהור, הזרקה, ניתוחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: אפיון של פפטיד עמילואיד מקורי-β42. אפיון ספקטרומטר מסה של פפטיד עמילואיד מקורי-β42 (א), את פפטיד מתויג CPP עמילואיד-β42 (TR-Aβ42; B)-(ג) כרומטוגרפיה של מטוהרים, מקורי, וגם פפטיד TR-Aβ42-Ultra-high לחץ נוזל כרומטוגרפיה (UPLC). X-axes מציינות את היחס בנפח גדול לתשלום (מ/z) (A, B) ואת הזמן • תנאי בדקות (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נוגדן של עמילואיד התצהיר בסעיף מוח דג זברה בוגרת 1 יום לאחר ההזרקה- Aβ42 בירוק, גרעינים בכחול. זיהוי של אשכולות ירוק מציין צבירה Aβ42 יעיל. גודל ברים = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה מן ההפניה39.

פפטיד רצף פפטיד MW (g/mol)
AΒ42 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 4514.1
TR-AΒ42 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 5919.8

טבלה 1: Aβ42 ו- TR-Aβ42 פפטיד רצפים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתן לשנות את פפטידים עמילואיד שיכלול וריאציות ברצף או תגיות שונות. למשל, מקושקשות פפטיד עמילואיד יכול להיווצר, פפטידים יכול להיות המסומנות בתגי פלורסנט-קצה אמיני של הסוף פפטיד או מתויג עם פפטידים נושאת39. באופן דומה, פרוטוקול זה, הינו פפטיד נושאת חודר לתא פפטיד TR בגלל היעילות שלו כדי תחבורה מטען עמוק לתוך רקמת המוח39. בנוסף, השיטה שלנו מאפשר הזרקת וניתוחים של פפטידים שונים שיכולים לגרום רעילים הצטברויות של50,51. לכן, המערכת שלנו מציעה שיטה רב-תכליתי להזרקה ידנית של חלבונים רעילים לתוך המוח דג זברה וניתוח השפעות רעילות כגון הסלולר.

פפטידים עמילואיד צבירה במהירות, ולכן, המניות חייב להישמר בפתרון מים-DMF-acetonitrile, ואני אמור. להיות מעורב עם PBS h לפני הזריקה רק 0.5. אם ישנם אגרגטים גדולים בפתרון, הפתרון הזרקת צריך להיות מוכן רק 10 דקות לפני הזריקה. יעילות הזרקת הוא פרמטר חשוב עבור מניב תוצאות עקביות. נא עיין שלנו הקודם יופיטר נייר46 לביצוע זריקה טובה ועקבית. אם אין צבירת נתפסת לאחר ההזרקה, חייב להיות מוטבת בשיטת הזרקה.

השיטה שלנו היא מוגבלת מבחינת הגודל של מולקולות להיות מוזרק. בעבר הראינו כי פלסמידים או oligomers קצר שאפשר לקחת ביעילות על ידי התאים חדרית45,46, אולם, למסירה יעיל לרקמות מוחי עמוק, מולקולות גדולות (למשל, נוגדנים, גדול אין אפשרות להשתמש חלבונים). בנוסף, מולקולות lipophilic יכול בקלות לחדור רקמות עמוק כי מולקולות כאלה להיות בבידוד על ידי הראשונה כמה שכבות של תאים חדרית.

הדור של העכבר דגמי הקשורים ניוון מוחיים הוא זמן רב והוא תחזוקה של מודלים אלה די יקר. שיטת הזרקת שלנו הוא מודל מהירה התצהיר עמילואיד רעילים, הקשורים ניוון מוחיים. בנוסף, דג זברה יש יכולת ההתחדשות מעולה לעומת מודלים בתרבית של ולאחר חקירות התמקדות חוליות איך המוח נוכל להציב מענה התחדשות לאחר הקשורים ניוון מוחיים יהנה בוודאי מערכות assay מהירה דג זברה.

האיכות של פפטיד מסונתזת את וטוהר שלו חשובים להצלחת הניסוי. כדי להבטיח את האיכות, פפטידים מסונתז חייב להיות ביסודיות מאופיין באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית לספקטרומטרית מסות. בנוסף, dichroism מעגלית לימודי צבירה כפי שמתואר39 הם הציעו.

הזרקת למוח דגים היא שלב קריטי כדי להבטיח צבירה עקבית של ההשתלשלות. מחקר זה מנתח את הדינמיקה צבירת ואישור של פפטידים עמילואיד ניתן לבצע, אם רצונך בכך. אנו משתמשים של פפטיד עמילואיד מצמידים פפטיד הספק כדי להבטיח חלוקה שוויונית, חדירה לתוך רקמת המוח. פפטידים עמילואיד חשיפות גם לתת תוצאות דומות אך ציר הזמן של הפצה, צבירה שונים39. הנסיין ניתן לבחור את הגירסה הרצויה של פפטידים עמילואיד בהתאם המטרה.

יש פוטנציאל גדול לשימוש בשיטה שלנו בשילוב עם מחקרים אחרים מניפולציה. CVMI של פפטידים עמילואיד יכול להיות משולב עם טיפולים תרופות או הזרקה של תרכובות אחרות כדי לבחון את ההשפעה סינרגטי של מולקולות שונות במצב המחלה. בסופו של דבר, המודל שלנו מהיר ולא רומן יכול לשמש גם עבור גישות סמים-הקרנה בקנה מידה קטן באווירה נוחה מעבדה.

שיטת microinjection ידנית שלנו יכול לשמש ביעילות להחדיר פפטידים עמילואיד לתוך המוח דג זברה בוגרת כדי לחקות את התצהיר עמילואיד. התצהירים עמילואיד במוח להפיק אפקט ציטוטוקסיות ותוצאות בפתולוגיה לספירה, ומכאן הצגת מצב ניווניות חריפה. התחזית לעתיד עבור שיטה זו יהיה לנצל את זה במודל ניוונית חריפה ללמוד את neuropathology במוח דג זברה ואת התגובה משובי הימנו. הבנה כזו תספק פלטפורמה חשוב לתכנן אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי DZNE, האגודה הלמהולץ (VH-NG-1021), CRTD, ט ו דרזדן (FZ-111, 043_261518) ולאחר DFG (KI1524/6) (סי. קיי); על ידי לייבניץ ההתאגדות (ראה-2011-IPF-2) ו BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). כן נרצה להודות אולריקה הופמן פפטיד סינתזה, וכדי נאנדיני אשוקה, Prayag Murawala וטאנאקה אלי לעזרה במהלך הצילומים ההליך.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
  3. Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
  4. Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
  5. Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
  6. Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
  7. Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
  8. McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  9. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  10. Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
  11. Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
  12. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
  13. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  14. Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
  15. Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
  16. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  17. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
  18. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  19. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  20. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  21. Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
  22. Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
  23. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  24. Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
  25. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  26. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  27. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
  28. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
  29. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  30. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
  31. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  32. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
  33. Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
  34. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  35. Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
  36. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  37. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
  38. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  39. Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
  40. Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
  41. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
  42. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  43. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  44. Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
  45. Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
  46. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  47. Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
  48. Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
  49. Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
  50. Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
  51. Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
  52. Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

Tags

מדעי המוח 128 הנושא עמילואיד β42 דג זברה הקשורים ניוון מוחיים cerebroventricular microinjection מחלת אלצהיימר סינתזה פפטיד מעבדתי
מידול עמילואיד-β42 רעילות, הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה למבוגרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattarai, P., Thomas, A. K.,… More

Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter