Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Моделирование амилоид β42 токсичности и нейродегенеративные в мозге взрослого данио рерио

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56014
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 2, 1,3
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

Summary

Этот протокол описывает синтеза, характеристика и инъекции мономерных амилоид β42 пептидов для генерации амилоида токсичности в взрослых рыбок данио создать модель болезни Альцгеймера, следуют гистологического анализа и обнаружения агрегатов.

Abstract

Болезнь Альцгеймера (AD) — изнурительных нейродегенеративных заболеваний, в котором накопление токсичных амилоид β42 пептидов (Aβ42) приводит к синаптических дегенерации, воспаление, нейронов смерть и обучения дефицита. Люди не регенерировать потерянные нейронов в случае объявления в части из-за нарушения пролиферативной способности нервных стволовых/прогениторных клеток (NSPCs) и снижение нейрогенез. Таким образом эффективный регенеративной терапии следует также расширять распространение и нейрогенных емкость NSPCs. данио рерио (Danio рерио) регенеративный организм, и мы можем узнать основные молекулярные программы, с которыми мы могли бы дизайн терапевтические подходы к решению AD. По этой причине необходимо поколения модель AD-как в данио рерио. С помощью нашей методологии, мы можем ввести синтетические производные Aβ42 пептид с проникающей способностью ткани в мозге взрослого данио рерио и анализировать заболевания патология и восстановительной реакции. Преимуществом над существующими методами или Животные модели является то что у рыбок данио могут научить нас, как позвоночных мозг может естественно регенерации и тем самым помочь нам для лечения человека нейродегенеративные заболевания лучше по ориентации эндогенного NSPCs. Таким образом модель амилоид токсичность, в головном мозге взрослых рыбок данио могут открыть новые возможности для исследований в области нейробиологии и клинической медицины. Кроме того простое выполнение этого метода позволяет для затратоэффективной и действенной экспериментальной оценки. Эта рукопись описывает синтеза и инъекции Aβ42 пептидов в zebrafish мозга.

Introduction

AD-это хроническое прогрессирующее заболевание, характеризующееся потерей нейронов и синапсы в коре1,2,3,4,5. Классическая патологического отличительными чертами AD являются отложением амилоида пептидов и формирования нейрофибриллярных связок (NFTs)6. Старческий таблички, также известный как амилоидных бляшек, состоят из пептидов амилоид β (значения), образующих β-плиссе структур в паренхиме мозга5. Накопление Aβ42 в больных ад имеет раннего и решающую роль в болезни. AD запускает каскад событий, приведших к синаптических дисфункции, нарушение пластичности и нейрональных потери7,8,9,10.

Взрослого мозга костистых данио рерио служит прекрасной моделью для изучения регуляции стволовых клеток пластичности11,12,13,14,15, 16,17,18,,1920 и различных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), включая объявление21,22,23 ,24. Из-за широкий спектр доступных экспериментальные методы19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, эти исследования являются информативными и осуществимым. Данио рерио может пополнить ЦНС13,15,,3233,34,35,36,37, 38, частично с помощью молекулярных программ активируется после нейрональных потери19,39,40,41,,4243, 44. Таким образом создание модели нейродегенеративные заболевания в zebrafish может помочь адрес Роман вопросы относительно регенеративной способности и стволовых клеток биологии позвоночных мозги.

Недавно мы разработали модель амилоида токсичности в мозге взрослого данио рерио путем инъекций синтетических Aβ42 пептидов (Таблица 1)39. Это инъекции вызвало нейродегенеративные фенотипов напоминает патологии мозга человека (например, смерть клетки, микроглии активации, синаптических дегенерация и дефицита памяти), указав, что у рыбок данио могут быть использованы для выявления нейродегенеративные в мозге данио рерио, Aβ42, пептиды могут быть обнаружены с stainings иммуногистохимии и молекулярные механизмы регенерации в взрослых рыбок данио, ЦНС могут быть определены39. В этом протоколе мы демонстрируем инъекции синтетических пептидов амилоида в мозг данио рерио, с помощью которых инъекции (CVMI) метод27,,3945,46 для имитации осаждения амилоида (рис. 1). CVMI предоставляет новый способ доставки пептиды, которые совокупности после инъекции как β-лист структур и оказывать токсическое воздействие. Пептиды распределяются равномерно по всему мозгу, ориентация желудочков район вдоль всей rostro хвостового оси45. Кроме того этот метод позволяет для анализа морфологических и молекулярной реакции NSPCs в мозге взрослого данио рерио, после амилоида включений. Такие исследования даст нам представление для ремонта успешной мозга млекопитающих. Наш метод может использоваться для понимания необходимости молекулярный механизм успешной регенерации ответ после AD-подобные симптомы побудить пополнения потеряли нейронов и функциональное восстановление.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

этот протокол является стандартной процедуры, предложенные руководящие принципы ЕС (2010/63) и Европейского общества для моделей рыбы в биологии и медицине (EuFishBioMed) в Карлсруэ институт технологии (комплект). Все методы, описанные после здесь были утверждены Комиссией по этике (Landesdirektion Дрезден; номер документа TVV-52/2015).

1. Подготовка Aβ42 пептид

  1. синтезируют пептидов (см. таблицу 1) с помощью химии стандартный 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) с 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) как муфта реагента на автоматизированных твердофазный пептид синтезатор 52. Масштаб синтеза был 100 мкмоль.
  2. Загрузить автоматизированных пептид синтезатор с 500 мг Fmoc защитой смолы как твердой фазы (грузоподъемность 0,2 ммоль/г). Загрузить растворенных Fmoc защищенный аминокислоты в концентрации 0,5 М в необходимого объема и рассчитывается для соответствующего синтезатор.
    Примечание: Расчеты выполнены для включения сцепления каждой аминокислоты Fmoc защищенный дважды с 5 раз избыток каждого строительного блока смолой 47.
  3. Распустить необходимые Реагенты синтеза пептида в dimethlyformamide (DMF). Например, подготовить активатор, HBTU, в концентрации 0,48 М, 45% v/v N-Methylmorpholine (НММ) (база) и 5% v/v ангидрида уксусной кислоты (укупорки смесь) крышка не отреагировал аминогруппами.
  4. Расщеплять все пептидов из смолы, постоянно смешивая твердой поддержки, с помощью мешалкой в свежеприготовленные расщепления смесь, состоящую из Trifluoroacetic кислоты (ТФК): Triisopropylsilane(TIS): вода: Дитиотреитол (DTT) 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2.5 (m/v), за 4 ч. использовать 10 мл для синтеза масштаб 100 мкмоль.
  5. Осадок рассеченного продукт путем добавления расщепления смесь 100 мл ледяной диэтиловом эфире. Пройти через блок фильтрации, содержащие политетрафторэтилен (ПТФЭ) фильтр с размером пор 0,45 мкм и мыть с 20 мл ледяной диэтиловом эфире.
  6. Собирать отфильтрованных пептид из фильтр-бумаги и Растворите 100 мг осажденный пептида в 5 мл дистиллированной деионизированной воды: Ацетонитрил 1:1.
  7. Очистить через реверс фазы высокого давления жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на полу препаративные ВЭЖХ с пористой полистирола дивинилбензолом столбец шарик размером 10 мкм.
    1. Нагреть столбце и поддерживать при 50 ° C, с помощью столбца Отопление устройства. Собрать всех основных фракций, с использованием автоматизированных часть коллектора, применяя градиент от 5% до 100% растворителем B свыше 25 мин на 4 мл/мин
      Примечание: Растворителей является 0,1% TFA в воде и растворителях B составляет 0,1% TFA в ацетонитриле 52.
    2. Мониторинг Хроматограмма на 220 Нм, собирать соответствующие вершины и анализировать с помощью LC-г-жа
  8. Подтверждение чистоты путем аналитических обратной фазы сверхвысокого давления жидких хроматографии (UPLC) на 220 Нм путем мониторинга с УФ детектор проходя образца через столбец аналитической C18 (бисера Размер 1.7 мкм). Подтвердите продукт пептид, масс-спектрометрия.
    Примечание: UPLC сочетании электроспрей ионизационная масс-спектрометрия (ESI-МС) и детектор тандем квадрупольного.
  9. Lyophilize правильные дроби желаемого пептида в колбе круглым дном, применяя вакуум 0,052 мбар, пушистые порошок. Пара вакуумный насос к блоку замораживания, поддерживается в магазине-78 ° C. при температуре-80 ° C, бесконечно.
  10. Использовать лиофилизированные пептид подготовить раствор 1 мм в смеси Ацетонитрил: ДМФ: чда водой 1:1:1 для экспериментов. Этот раствор можно хранить по крайней мере 6 месяцев, как пептиды не объединить в этом растворе.

2. Подготовка смеси инъекций

  1. подготовить фосфат амортизированное saline (PBS) (137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na 2 HPO 4, 2 мм х 2 PO 4, рН 7,4) для разбавления лиофилизированный пептидов.
  2. Распустить пептида в конечной концентрации 20 мкм в PBS. Подготовьте этот свежий раствор. Хорошо перемешать и хранить на льду до инъекции. Не превышать 30 мин для предотвращения агрегации в растворе.

3. Анестезия

  1. подготовить раствор анестетиков, 0.1% этиловый m аминобензоат Метансульфонат (MESAB), в воде регулярных рыбы от циркулирующих системы. Приготовляют раствор обезболивания до конечной концентрации 0,0025% (v/v).
  2. Удалить необходимое количество рыбы из их танки в контейнер с 5 Л воды системы транспорта.
  3. Половину заполнить пластиковый Петри (90 мм) с 40 мл анестетиков. Используйте это блюдо для инъекций.
  4. Инкубировать рыбы в обезболивающих средств, до тех пор, пока opercular движение прекратилось.

4. Микроинъекции которых

  1. Подготовка аппарата инъекций
    1. подготовить стекла инъекции капилляров с помощью иглы съемник со следующими параметрами: Отопление цикла, 537; потянув цикла, 250 скорость, 1.5 s; время, 80 г-жа
    2. принести давления на источнике давления до 25 psi.
    3. Microinjector параметры присвоено следующее: удерживать давление 20 psi; извлечь давление 10 psi; значение периода 2,5; стробирования значение 100 г-жа
    4. Загрузить стеклянный капилляр с инъекционного раствора. Вставьте держатель микроинъекции стеклянный капилляр. Отрегулируйте угол впрыска до 45°.
      Примечание: Более подробные протоколы можно найти как описано в ссылки 27 , 46.
  2. Место одной рыбы в новой Петри заполнены раствором обезболивания (как и шагу 3.3).
  3. Удержать рыбу с щипцами и ориентации для инъекций.
  4. Генерировать щели с помощью кончика иглой 30 G в череп через оптические tectum где встречаются две боковые пластины. Не вводите наконечник в ткани мозга, это приведет к кровотечение и повреждения. Просмотреть ссылки 27 , 45 , 46 для получения дополнительных сведений.
  5. Вставьте стеклянный капилляр в слите.
    1. Использовать только кончик иглы и не проникают более чем на 1 мм через череп. Продолжайте удерживать рыбу и вставить кончик стеклянный капилляр через сайт разрез.
    2. Ориент кончик стеклянный капилляр направлении конечного мозга под углом 45°. Придать 1 мкл раствора. Жидкости рассеивается сразу же после инъекции.

5. Восстановление

  1. место, рыбу обратно в транспортировочный контейнер до тех пор, пока она восстанавливается. Подключите контейнер к регулярно циркулирующей воды рыбы для обеспечения оптимального воды качества.
    Примечание: Восстановление обычно должен занять 1 мин. Если это занимает больше времени, рыба должна храниться в анестетиков за более короткое время (это должен быть оптимизирован экспериментатор).

6. Подготовка тканей и Sectioning

  1. ожидания за желаемый период времени перед жертвуя рыба.
    Примечание: Это зависит от экспериментальных вопрос. Амилоида осаждения может рассматриваться как 1 день после инъекций.
  2. Пожертвовать рыбы, с использованием соответствующего метода в зависимости от этических правил (например, лечить рыбу с 0,1 М MESAB).
  3. Разрезать черепа выше оптические tectum, используя острый forcep на спинной стороне и вскрыть голову позади грудных плавников, с помощью скальпеля.
  4. Исправить головы, с использованием 2% параформальдегида (PFA) на ночь при 4 ° C. Использование 3 мл PFA душу в пластиковую трубку с винтовой крышкой.
    Предупреждение: Носить надлежащие средства личной защиты, при обработке PFA.
  5. Для криозащиты и декальцинации, моют головы трижды в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), затем передать их в раствор 20% sucrose/20% этилендиаминтетрауксусная (ЭДТА) и инкубировать на ночь при 4 ° C.
  6. Для внедрения в ткани в резании смолы, заморозить головы в gelatin/20% 7,5% раствора сахарозы в пластиковых гистология плесени на сухой лед (примерно 3-5 мин до замораживания блок). Хранение образцов-80 ° C или продолжать к следующему шагу (cryosectioning).
  7. Раздел главы в 12 мкм толщиной cryosections с помощью криостата как описано 28 , 42. Передача cryosections непосредственно на стеклянных вставках и хранить при температуре-20 ° C для долгосрочного использования.

7. Иммуногистохимическое окрашивание и микроскопии

Примечание: выполнить все шаги инкубации в камере увлажненной. И, все шаги стиральных за 10 мин.

  1. Сухие разделы для 30 мин при комнатной температуре. После оттаивания, мыть разделы дважды в PBS и один раз в PBSTx (PBS с 0,03% Тритон X-100).
  2. Инкубировать с основного антитела (антитела анти Aβ42; 1: 500 разрежения в PBSTx) на 4 ° C ночь. следующий день, мыть раз в PBS и дважды в PBSTx.
  3. Инкубировать секции с вторичное антитело (сочетании флуоресценции обнаружения, разведение 1: 500) наряду с DAPI (1 мкг/мл) в PBSTx втечение 2 ч при комнатной температуре.
  4. Мыть три раза в PBSTx. После окончательной стирки, смонтировать слайды с coverslip, с использованием 100 мкл 70% глицерина.
  5. Приобретать флуоресцентного изображения с помощью конфокального микроскопа (например, с цель 20 X PL н.а. АПО 0,7 с 488 возбуждения спектра и стандартный зеленый фильтр; Рисунок 2) 39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ВЭЖХ была использована для того чтобы очистить синтезированных пептидов и масс-спектрометрии была использована для характеризовать очищенный амилоида β пептиды. Столбце ВЭЖХ нагревается до 50 ° C для улучшения разделения значения пептидов и были собраны все фракции. Чтобы определить правильно синтезированных пептидов, масс-спектроскопии анализ проводился для всех фракций. Хроматограмма UPLC показывает чистоту соединения. ВЭЖХ фракции, которые принесли один пик на UPLC (т.е., правильной массы взимать соотношение требуемых амилоида β пептида) был дополнительно обработаны для экспериментов (рис. 2).

Функциональность пептидов в формировании агрегатов можно оценить, используя различные спектральные методы39,48,49, а также по инкубации пептидов в PBS при комнатной температуре для более чем 1 h, который будет доходность агрегатов. В этом случае преципитаты и большие компоситы должны рассматриваться в растворе.

После которых микроинъекции, пептиды, крашенную в мозга и формы амилоидных отложений (рис. 3). Эти агрегаты основном рассматриваются как внутриклеточных осаждений, но также вокруг кровеносных сосудов. Такие агрегаты — это признаки успешного накопления амилоида пептидов в ткани.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление пептидного синтеза, очистки, инъекции и анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: характеристика родной амилоид β42 пептид. Масс-спектрометрия характеристика родной амилоид β42 пептид (A) и CPP-тегами амилоид β42 пептида (TR-Aβ42; B). (C) хроматограф из очищенной, родной и TR-Aβ42 пептид на ультравысоких давления жидкого хроматографии (UPLC). X-Axes обозначают отношение массы и заряда (m/z) (A, B) и элюции время в минутах (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: иммуногистохимическое окрашивание амилоида осаждения в разделе мозга взрослого данио рерио 1 день после инъекций. Aβ42 в зеленый, и ядер синим цветом. Обнаружение зеленый кластеров указывает эффективным Aβ42 агрегации. Масштаб баров = 100 мкм. Этот рисунок был изменен со ссылкой39.

Пептид Пептид последовательность МВт (г/моль)
AΒ42 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 4514.1
TR-AΒ42 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 5919.8

Таблица 1: Aβ42 и TR-Aβ42 пептид последовательности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Амилоида пептиды могут быть изменены для включения изменения последовательности или различные теги. К примеру кинулись амилоида пептид может быть создан, и пептиды могут быть помечены флуоресцентные метки в N-terminus конца пептид или отмеченных перевозчик пептиды39. Аналогичным образом в настоящем Протоколе, пептида перевозчика является ячейка проникая пептида TR из-за его эффективности для перевозки грузов глубоко в ткани мозга39. Кроме того наш метод позволяет для инъекций и анализ различных пептидов, которые может вызвать токсические агрегаты50,51. Таким образом наша система предлагает универсальный метод для ручной подачи токсичных белков в данио рерио мозга и анализа сотовой последствия таких токсичности.

Амилоидоподобные пептиды совокупных быстро и, следовательно, запасы должны храниться в растворе воды ДМФ Ацетонитрил и должна быть смешанной с PBS только 0,5 ч до инъекции. Если в решении имеются большие компоситы, инъекционного раствора должен быть подготовлен только 10 мин до инъекции. Эффективность инъекций является важным параметром для приносят устойчивые результаты. Пожалуйста, обратитесь к нашей JoVE предыдущего порядка бумага46 для выполнения хорошо и последовательного впрыска. Если не агрегации виден после инъекции, метод инъекции должны быть оптимизированы.

Наш метод ограничен с точки зрения размера молекул для инъекций. Ранее мы показали, что плазмид или короткие олигомеров могут быть приняты эффективно желудочков клетки45,46, однако, для эффективной доставки в глубокую мозга ткани, большие молекулы (например, антитела, большой нельзя использовать белки). Кроме того липофильных молекул не могут легко проникать глубоких тканей, потому что такие молекулы будет поглощено, первые несколько слоев клеток желудочков.

Поколения модели мыши нейродегенеративные занимает много времени и поддержание этих моделей является довольно дорогим. Наш метод инъекции является быстрый модель для токсичных амилоидные отложения и нейродегенеративные. Кроме того данио рерио имеет улучшенный регенерационной способности по сравнению с моделями млекопитающих, и исследований, посвященных как позвоночных мозги может реагировать регенерации после нейродегенеративные наверняка выиграют от быстрого анализа систем в Данио рерио.

Качество ее чистоты и синтезированных пептидов имеют важное значение для успешного проведения эксперимента. Для обеспечения этого качества, синтезированных пептидов должны быть тщательно характеризуется с помощью жидкостной хроматографии и масс-спектроскопии. Кроме того предлагаются круговые дихроизма и агрегации исследования как описано39 .

Инъекции в мозг рыба является важным шагом для обеспечения последовательной агрегации и патологических результатов. Продольное исследование, которое анализирует агрегации и распродажа динамика амилоида пептиды могут выполняться, если желаемого. Мы используем амилоида пептид, в сочетании с пептида перевозчика для обеспечения равного распределения и проникновение в ткани мозга. Центровку амилоида пептиды также дать аналогичные результаты но шкале распределения и агрегации различных39. Экспериментатор можно выбрать нужную версию амилоида пептидов в зависимости от цели.

Существует большой потенциал для использования нашего метода в сочетании с другими исследованиями манипуляции. CVMI амилоида пептиды могут сочетаться с медикаментозное лечение или инъекции других соединений для тестирования синергических эффектов различных молекул в состоянии болезни. В конечном счете наша модель быстрого и Роман также может использоваться для небольших наркотиков скрининг подходов в обстановке легко лаборатории.

Наш метод ручной микроинъекции может использоваться эффективно придать амилоида пептидов головного мозга взрослых рыбок данио имитировать амилоида осаждения. Амилоидных отложений в мозге вызывают цитотоксическое действие и приводит к патологии AD, поэтому отображение состояния острого нейродегенеративных. Перспективы для этого метода будет его использовать в острых дегенеративных модель для изучения невропатология в zebrafish мозга и восстановительной реакции их. Такое понимание будет предоставлять важную платформу для разработки новых терапевтических стратегий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать

Acknowledgments

Эта работа была поддержана DZNE и Гельмгольца (VH-NG-1021), КГПОГ, ту Дрезден (ФЗ-111, 043_261518) и DFG (KI1524/6) (C.K.); Лейбница (пила-2011-ОПЗ-2) и BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (ВМФ). Мы также хотели бы поблагодарить Ulrike Hofmann пептидного синтеза, а также Nandini Asokan, Праяг Murawala и Элли Танака за помощь во время съемок процедура.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
  3. Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
  4. Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
  5. Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
  6. Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
  7. Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
  8. McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  9. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  10. Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
  11. Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
  12. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
  13. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  14. Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
  15. Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
  16. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  17. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
  18. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  19. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  20. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  21. Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
  22. Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
  23. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  24. Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
  25. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  26. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  27. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
  28. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
  29. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  30. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
  31. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  32. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
  33. Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
  34. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  35. Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
  36. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  37. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
  38. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  39. Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
  40. Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
  41. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
  42. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  43. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  44. Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
  45. Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
  46. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  47. Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
  48. Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
  49. Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
  50. Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
  51. Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
  52. Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

Tags

Нейробиологии выпуск 128 амилоида β42 данио рерио нейродегенеративные которых микроинъекции болезнь Альцгеймера твердофазного синтеза пептида
Моделирование амилоид β42 токсичности и нейродегенеративные в мозге взрослого данио рерио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattarai, P., Thomas, A. K.,… More

Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter