Summary
Detta dokument beskriver hur man utför hjärt bypass hos möss. Denna nya modell kommer att underlätta utredningen av de molekylära mekanismerna som är involverade i organskada.
Abstract
Som långvarig hjärt bypass blir viktigare under hjärt interventioner, uppstår en ökad klinisk efterfrågan för optimering av förfarandet och för att minimera orgel skador till följd av långvarig extrakorporeala cirkulation. Syftet med denna uppsats var att visa en fullt fungerande och kliniskt relevant modell av hjärt bypass i en mus. Vi rapporterar om enheten design, perfusion krets optimering och mikrokirurgiska tekniker. Denna modellen är en akut, som inte är förenligt med överlevnad på grund av behovet av flera blod ritningar. På grund av spänna av verktyg tillgängliga för möss (t.ex., markörer, knockouts, etc.), kommer att denna modell underlätta utredning av molekylära mekanismer av organskada och effekten av hjärt bypass i förhållande till andra samsjuklighet.
Introduction
Sedan införandet av hjärt bypass (CPB) till kliniken, har den spelat en viktig roll i hjärtkirurgi1. I moderna hjärtkirurgi är långvarig CPB tid viktigt att utföra omfattande aorta rekonstruktioner och kombinerade förfaranden. Även tekniska framsteg har varit enorm, användning av extrakorporeala omsättning är associerad med intra - och postoperativ systemisk och lokala organ skada2,3.
Stora modeller har utvecklats för att undersöka CPB roll den fysiologiska processer4,5. Även om dessa modeller har inblick i några av CPB associerade komplikationer, de är extremt dyrt och molekylära verktyg (t.ex. antikroppar) är mycket begränsad. Ett mer kostnadseffektivt alternativ har tagits fram i små djur. Sedan deras utveckling, har flera studier utförts för att optimera en CPB modell i råttor och kaniner5,6,7,8,9. Dessa modeller ger en bra grund för mätningar av patofysiologiska sjukdomsprocesser; de är dock fortfarande otillräcklig för att undersöka cellulära och humorala immunologi på grund av bristen på relevanta antikroppar och reagenser. Detta försämrar deras roll inom detta forskningsområde.
Vi har nyligen utvecklat en musmodell av CPB. På grund av ett brett utbud av mus-specifika reagens och genetiskt modifierade möss är musmodeller i allmänhet modellen av val för fysiologiska, molekylär och immunologisk forskning10,11. Vår modell kommer därför att underlätta studiet av CPB i förhållande till olika sjukdomstillstånd som det finns många möss stammar tillgängliga med kliniskt relevanta sjukdomar12,13. Således beskriver detta papper, i detalj, hur du utför CPB i möss. Syre och hemodynamiska parametrar övervakas noggrant efter djupt andnings-och cirkulationsstillestånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla djurförsök har utförts i enlighet med den tyska djur skydd lagen (TierSchG) och godkändes av utskottet för lokala djurskydd (lägre Sachsen statens byrå för konsumentskydd och livsmedelssäkerhet, protokoll TSA 14/1556). Minimal mus lämplig för denna modell väger 25 g.
1. preoperativa förberedelser
Obs: alla förfaranden genomförs under rena, icke-sterila förhållanden, med Ånghärdad instrument.
- Plats 50-60 8 cm lång propen ihåliga fibrer parallellt i ett rör och ansluta med en T-adapter på båda sidor. Fyll utrymmet mellan den ihåliga fibrer och den yttre grenen av den T-adaptern med lim.
- Tillåt minst 24 timmar för limmet härda. Klipp den ihåliga fibrer som sträcker sig ut från T-adaptern med en standard mikrotomen och dra silikon röret till kopplingsställen.
- In en 2 Fr polyuretan kanyl 27 G metall nål (från en 26G branule). Använda en kirurgisk kniv och mikro-sax under ett mikroskop (8-12 X förstoring) att göra tre till fyra fenestrations ca 0,15 cm varje distala tredjedelen av kanylen att säkerställa optimal venös tillbaka flöde.
- Ta bort tråden när klar. Använda bomullspinnar för trubbig dissektion och indragning av strukturer. Använd gasväv kompresser (5 x 5 cm 2) för att suga upp överflödig vätska för att förhindra vävnad uttorkning.
- Förbereda priming volymen. Lägg till 30 IE heparin per mL priming lösning och 2,5% v/v för en 8,4% lösning av NaHCO 3 för buffring för komplettering. Här förvaras vid 4 ° C tills används.
- Fylla CPB kretsen (dvs., pump, air trapper, slangar och båda kanyler) med 850 µL priming lösning via den venös kanylen. När fyllt, hålla de CPB cirkulerande tills djuret är redo för kanylering.
2. Djur anestesi
- att administrera anestesi, placera djuret i en induktion kammare under 2,5% v/v och isofluran oxygen. Bekräfta rätt anestesi genom att bedöma pedal tillbakadragande reflexen, svans nypa reflex och ögat blinkreflexen. Använda veterinärmedicinska ögonsalva för att undvika torra ögon.
- Placera djuret på en värmande pad med temperaturreglerande funktion. Mäta kroppstemperaturen med en sond införas rektalt och ansluten till datainsamlingssystemet.
- Efter narkos uppnås, intubation den djura orotracheally använder en 20G plast braunule, sätter in det muntligt och trycka den in i luftstrupen under visuell kontroll. Starta mekanisk ventilation med hjälp av en isofluran spridare ansluten till en mus ventilator. Beroende på djurens vikt, justera ventilationen så att en tidalvolym på 250-350 µL uppnås.
- Att säkerställa fullständig smärtlindring, injicera 5 mg/kg djurens kroppsvikt karprofen subkutant. Det rekommenderas att isofluran koncentration hålls mellan 1,3-2,5% syre. Isofluran koncentration kan justeras manuellt beroende på stadium av förfarandet.
3. Kirurgiska ingrepp
- efter narkos och intubation uppnås, utföra en mittlinjen huden snitt till halsen med skarpa fina sax, separata muskler på ett trubbigt sätt och exponera de rätt halsvenen och vänster carotis. Under beredning, koagulerar små fartyg med en veterinär coagulator ansluten till bipolär pincett för att säkerställa minimal blodförlust.
- Efter beredning av jugular fartyg, cranially ligera distala segmentet av den vänstra gemensamma halspulsådern att dess bifurkation med 8-0 silk suturer.
- Anslut den distala änden av en 27 G kanyl till arteriella inflödet slangen med en silikon connector (0,5 mm ID, 1 mm OD), plats 8-0 silk suturen slip knop på den proximala segmentet av artär och skär spetsen av kanylen i halspulsådern.
- Efter korrekt placering av kanyl spets, vidare kanyl spetsen så att den lägger 3-4 mm proximalt till aortabågen. Fixa kanyl spetsen genom att säkra med 8-0 silk knop.
- Med mikrokirurgisk pincett och sax, utför trubbig och vassa dissektion, exponera rätt halsvenen av trubbiga beredning av vävnad sidled till sternocleidomastoideus, nära nyckelbenet, och placera en 8-0 silk Knut på den distala änden och en 8-0 ögla i den proximala änden.
- Efter ligering av den distala änden av halsvenen, Placera spetsen på den venös kanylen i rätt halsvenen och framsteg mot höger förmak och säkra med hjälp av silk Knut. För optimal venöst återflöde, kan det krävas att avancera venös spetsen in i höger kammare.
- När den rätta kanyl ståndpunkten uppnås, utföra systemisk heparinization genom att lägga till 2,5 IE heparin per gram djurens kroppsvikt via direkt intravenös injektion i halsvenen.
- För realtid invasiva tryckövervakning, cannulate vänster femoralartären. Exponera ljumskarna och försiktigt separera gemensamma femoralartären från femoral ven och femoralisblockad under 25 X förstoring.
- Ligate den distala delen av femoralartären. Tillfälligt Täpp den proximala delen med en slip-Knut och göra ett litet snitt på den främre väggen med hjälp av mikro-pincett.
- Efteråt, infoga en 1 Fr polyuretan kanyl i femoralartären och säkra den med en 10-0 sutur. Denna kanyl används för att extrahera blodprov för blod gasar analys.
- Efter lyckad placering av de arteriella och venösa kanyler, initiera hjärt bypass genom att vrida på pumpen. Tiden från intubation till start av CPB är ungefär 45 min. börja använda ett flöde av 0,5 mL/min, beroende på systemisk påtryckningar mätningar, och öka blodflödet inom 2 min till fullt flöde (4-6 mL/min) genom att öka pumpens varvtal.
- Under fullständig kontroll, utföra en övre sternotomi med vass sax från manubrium och gå 5 mm i kaudala riktning. Koagulera sternala kanterna omedelbart för att undvika blödning. Exponera aortabågen genom att dra den rätt halspulsådern i kranial riktning.
- För optimal kontroll, runt om gratis aortabågen från thymus och omgivande vävnad att underlätta fastspänning. Placera en 8-0 silk slinga runt aorta ascendens. För att placera cross klämman för cardioplegia, dra silk slingan i kranial riktning till bättre exponera aorta ascendens.
4. Hjärt Bypass och blod gasar analys
- för blod gasar analys (BGA), använda glas kapillärrör för att samla in 60-90 µL arteriellt blod via lårbensartären katetern.
- Använda en liten klämma på silikon slangar och lossa slangen från katetern. Släpp trycket långsamt på klämman att tillåta kontrollerad fyllning av kapillärröret.
- Återanslut silikon röret till katetern. Infoga kapillärrör i blod gas analyzer för mätningar vid följande tidpunkter:
10 min efter påbörjande av CPB med ventilation (BGA1)
efter 25 min av CPB och 15 min av andningsstillestånd (BGA2)
efter 40 min av CPB och 30 min av andningsstillestånd (BGA3)
efter 55 min i CPB, 45 min andning och 20 min av hjärtstopp (BGA4)
- Under stabilt CPB flöde, initiativ te andningsstillestånd genom att stoppa ventilation.
- Efter uppsägning av ventilation, ställa den värmande pad och 28 ºC och börja lokalt kylning djur till 28 ºC kroppstemperaturen inom de första 20 min av andningsstillestånd med gasväv indränkt i kall saltlösning.
- När en kroppstemperatur på 28 ° c uppnås, och efter totalt 30 min av andningsstillestånd, administrera 0,3 mL 7,45% KCl-lösning in i CPB krets att inleda cardioplegia.
- För cross fastspänning av aorta, dra tidigare placerade silk slingan (steg 3.10) i kranial riktning för bättre exponering och placera en mikro-serrefine klämma på den stigande delen av aorta.
- Utför totalt 60 min andningsstillestånd och 30 min av hjärtstopp. Ta bort mikro-serrefine klämman från aorta ascendens att inleda reperfusion av hjärtat. Samtidigt åter ventilera och värma djuret till 37 ° C.
- Efter reperfusion har slutförts och djuret har nått normothermia, avsluta CPB genom att stänga av pumpen och fortsätta att övervaka fysiologiska mätningar (t.ex. kroppstemperatur, EKG, och invasivt blodtryck) för 20 min.
- Vid slutet av experimentet, exsanguinate djuret under full narkos (5% isofluran) och samla in blod och organ för ytterligare analys 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det här protokollet beskriver de perfusion krets, kirurgiska ingrepp, och övervakning av fysiologiska parametrar under CPB musklick. När de utförs av en tillräckligt skicklig microsurgeon, erhålls resultaten konsekvent och reproducibly.
För att bibehålla adekvat vävnadsperfusion, hålls genomsnittliga arteriella trycket alltid mellan 40 och 60 mmHg genom att justera CPB blodflödet och tillägg av extra volym. Beroende på vikten på djuret, dess volymstatus och kroppstemperatur upprätthålls extrakorporeala blodflödet mellan 2,3-6,5 mL/min. korrigering av volymförlust under experimentet uppnås genom att tillsätta 0,1 ml av priming lösning till kretsen under CPB. Systemiska pH stabilisering uppnås genom att lägga till 8,4 mmol/L NaHCO2. Alla vätskor administreras via air-trapping reservoaren att minska risken för luft embolisering.
Fysiologiska parametrar utvärderades med hjälp av BGA vid fyra olika tidpunkter (figur 1) och mätningarna från en representativ framgångsrika CPB procedur presenteras i tabell 1.
Hematokrit mätningar visar hemodilution på grund av tillägg av priming volym till kretsen (tabell 1). Det var dock inget behov av blodtransfusion som hemoglobinnivåer kvarstod vid tillräckliga nivåer under experimentet (tabell 1). Systemiska arteriella pO2, syremättnad, pCO2 utgångsdatum värden validerade utmärkt fungerande mikro-oxygenator (tabell 1). pCO2 utgångsdatum var optimal använder en syre/luft blandningen på FiO2 0,8.
BGA tillhandahålls också inblick i metabolisk status för djuret under CPB. Efter initiering av CPB med ventilation, arteriella pH upphöjdes (tabell 1). Denna effekt är ofta minska när andningsstillestånd initieras. En gradvis minskning av pH under experimentet sågs (tabell 1). Kontinuerlig buffring av arteriella pH och laktat var nödvändigt att kompensera för acidos.
Figur 1 : Experimentell tidslinje. Tidpunkten för intubation, ventilation, andningsstillestånd, CPB, hjärtstillestånd, reperfusion, kylning/re-uppvärmningen och BGA provtagningspunkter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| BGA1 | BGA2 | BGA3 | BGA4 | |
| Hemoglobin (g/dl) | 8,9 | 6,8 | 6,8 | 5.6 |
| Hematokrit | 27,5 | 21,2 | 21,3 | 17,7 |
| pO2 (mmHg) | 508 | 506 | 504 | 271 |
| pCO2 (mmHg) | 24,5 | 20,3 | 20 | 36,4 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 100 | 100 |
| pH | 7,56 | 7,65 | 7,36 | 7,32 |
| Laktat (mmol/L) | 2.6 | 3.1 | 3 | 6,9 |
Tabell 1: representant BGA resultat från en framgångsrik CPB i en mus. BGA tagit fyra olika tidpunkter under loppet av ett experiment.
Figur 2 : Schematisk bild av CPB kretsen i musen. En venös kanyl (blå) är placerad i den sämre vena cava via rätt halsvenen och en arteriell kanyl (röd) i den stora kroppspulsådern via den vänstra halspulsådern. Syresatt blod pumpas genom luft-trapper reservoaren i den vänstra halspulsådern. EKG-elektroder placeras subkutant, kroppstemperatur mäts rektalt och trycket övervakas via femoralartären. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utvecklat en fullt fungerande kliniskt relevant modell för CPB i en mus. Med mer än trettio stammar av möss med hjärt-kärlsjukdomar, kan vår modell vara en utgångspunkt för utveckling av nya blivande protokoll relaterade till CPB. Dessutom, på grund av överflödet av mus-specifika reagens och knockout-out möss, denna modell inte bara kan ersätta den nuvarande råtta modellen av CPB men kommer att underlätta dissekering av de molekylära mekanismerna som är involverade i CPB-relaterade organskada. Hittills har CPB inte tillämpats i möss på grund av mikrokirurgisk utmaningar i kanylering teknik, liksom tekniska utmaningar inklusive utveckling av en mikro-oxygenator har en tillräckligt liten priming volym. Cirka för 90 vandringsleder och omsorgsfulla arbete av en erfaren microsurgeon att uppnå en stabil modell. Över 15 prototyper av CPB maskinen att ha olika roller pumpar, slangar och olika reservoarer testades och ständigt förbättras. Mer än 10 versioner av olika oxygenatorer byggdes och testats för att uppnå nuvarande resultat. Vår nya modell krävs en fullständig omarbetning av befintliga råtta modell installationen av extrakorporeala cirkulation. För det första, vi byggde de minsta möjliga mikro-oxygenator möjliggör priming-volymerna < 0,3 mL. Oxygenator omarbetades med hjälp av en inverterad system där blodet flyter genom de ihåliga fibrerna och inte mellan dem, möjliggör en betydande reducering av priming volym.
Under utvecklingen av vår modell har vi stött flera tekniska svårigheter. Vår första prototyp kretsar krävs stora priming volymer upp till 6 ml. Detta resulterade i extrema hemodilution med hemoglobin värden under 4 g/dL och hematokrit cirka 15. Trots BGA visar god syresättning observerade vi tecken på hypoxemi leder till snabb hjärtstillestånd under förfarandet. För att uppnå korrekt vävnad syresättning, bör hematokrit värden vara över 25. Genom att justera storleken slangar, att ändra utformningen av rullen-pumpen, producerar en miniatyriserade luft trapper och optimera venösa och arteriella kanyler, priming volymen minskade signifikant till < 0,9 mL.
Trots adekvat perfusion är flödet av 4-6 mL/min, som ger tillräcklig venös tillbaka flöde viktigt. Placering av venös kanylen i höger förmak eller, ännu bättre, i höger kammare, avhjälper problemet. Ökar genomblödning leder till antingen suger av venös kanyl eller overperfusion-relaterade förlust av vätska och vävnad ödem. För att undvika CO2 retention i musen, som har en snabb ämnesomsättning, hittade vi att hålla syretillförseln genom oxygenator på FiO2 80 procent med ett flöde av 600 mL/min är optimal för vävnad syresättning.
En annan fråga som man kan stöta på är gradvis förlust av intravaskulära volymen till den interstitium, vilket nödvändiggör upprepa volym substitution var 30-40 min. Hyperosmolaritet av elektrolyt lösningar som innehåller hydroxietylstärkelse stärkelse (HES) förhindrar intravaskulär volymförlust, men när den används uteslutande, dess hög viskositet orsakar en enorm ökning i systemisk trycket under CPB. Detta leder till läckage i oxygenator och slangen proximalt arteriell kanylen. Därför, för att uppnå en balans mellan Hyperosmolaritet och moderat viskositet, en 1:1 blandning av HES-innehållande lösningar och en annan isoton balanserad vätska befanns vara optimal.
Rullpump körning elektronik ändrades för att öka rotationshastigheten vilket möjliggör tillräckligt flöde inom liten diameter rören. Under den starkt sug som produceras av rullen-pumpen, är det typiskt att ha mikroskopiska luftbubblor i det venösa systemet. Byggandet av en miniatyriserade luft trapper med grundning volym under 0,15 mL löst problemet. Att tillsätta 0,1 mL av extra volym och minska CPB flödet förutom att kontrollera den korrekta placeringen av venös kanylen elimineras luftemboli i kretsen.
För att testa den tekniska genomförbarheten av en roman hjärt bypass modell, krävs flera blod provtagningar. Ta bort mer än 0,2 mL blod är vanligtvis dödlig för en hälsosam mus. För att säkerställa oxygen och hemodynamisk stabilitet, mängden blod provtagningar i vårt experiment var långt bortom detta värde och nått nästan 0,9 mL i slutet av experimentet. Dock observerades stabil syresättning och hemodynamiska parametrar hematologiska värden har minskat konstant. Vår inledande genomförbarhet modell var därför primärt utformat som ett akut, icke-överlevnad protokoll. Vi utvecklar nu en minimalinvasiv överlevnad modell som med nödvändighet kommer att ha mindre blodprovstagning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | priming volume, 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% HES Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | priming volume, 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2.5 IU per ml of priming solution |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| KCL 7.45 % Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 2418577 | 0.1 mL for cardioplegia |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 08859153 | 5 mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotid artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| Vasofix Safety catheter 20G | B.Braun Medical | 4268113S-01 | orotracheal intubation |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care Deutschland GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| CLINITUBES blood capillaries | Radiomed GmbH | 51750132 | blood sampling 60 - 95 microliter |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| MiniVent Ventilator for Mice (Model 845) | Harvard Apparatus | 73-0044 | mechanical ventilation |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1.3 - 2.5% | |
| PowerLab data acquisition device 4/35 | ADInstruments Ltd, New Zealand | PL3504 | invasive pressure, ECG, temperature |
| ABL 800 Flex | Radiometer GmbH | blood gas analysis | |
| NMRI mice | Charles River Laboratories | Crl:NMRI(Han) | male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment |
References
- Edmunds, L. Cardiopulmonary Bypass after 50 Years. N. Engl. J. Med. 351 (16), 1601-1603 (2004).
- Goto, T., Maekawa, K. Cerebral dysfunction after coronary artery bypass surgery. J. Anesth. 28 (2), 242-248 (2014).
- Uysal, S., Reich, D. L. Neurocognitive outcomes of cardiac surgery. J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 27 (5), 958-971 (2013).
- Ballaux, P. K., Gourlay, T., Ratnatunga, C. P., Taylor, K. M. A literature review of cardiopulmonary bypass models for rats. Perfusion. 14 (6), 411-417 (1999).
- Jungwirth, B., de Lange, F. Animal models of cardiopulmonary bypass: development, applications, and impact. Semin. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 14 (2), 136-140 (2010).
- Günzinger, R., et al. A rat model of cardiopulmonary bypass with cardioplegic arrest and hemodynamic assessment by conductance catheter technique. Basic Res Cardiol. 102 (6), 508-517 (2007).
- Waterbury, T., Clark, T. J., Niles, S., Farivar, R. S. Rat model of cardiopulmonary bypass for deep hypothermic circulatory arrest. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (6), 1549-1551 (2011).
- Schnoering, H., et al. A newly developed miniaturized heart-lung machine-expression of inflammation in a small animal model. Artif. Organs. 34 (11), 911-917 (2010).
- Kim, J., et al. The responses of tissues from the brain, heart, kidney, and liver to resuscitation following prolonged cardiac arrest by examining mitochondrial respiration in rats. Oxid. Med. Cell. Longev. 2016, (2016).
- Shappell, S. B., Gurpinar, T., Lechago, J., Suki, W. N., Truong, L. D. Chronic obstructive uropathy in severe combined immunodeficient (SCID) mice: lymphocyte infiltration is not required for progressive tubulointerstitial injury. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (6), 1008-1017 (1998).
- Majzoub, J. A., Muglia, L. J. Knockout mice. N. Engl. J. Med. , 904-907 (1996).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ. Res. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovasc. Pathol. 15 (6), 318-330 (2006).
- Iurascu-Gagea, M., Craig, S. Euthanasia and necropsy. The laboratory rabbit, guinea pig, hamster, and other rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press (Elsevier). 117-141 (2012).
