Summary
मेंटल सेल लिंफोमा (MCL) बी कोशिका विकार का इलाज करने के लिए एक मुश्किल है और चिकित्सा विज्ञान के अध्ययन और विकसित करने के लिए प्राथमिक MCL के एक xenograft माउस मॉडल स्थापित करने के लिए समान रूप से मुश्किल है । यहां, हम चूहों में MCL xenografts की सफल स्थापना का वर्णन करने में मदद अपने अंतर्निहित जीवविज्ञानी समझते हैं ।
Abstract
बी लिम्फोसाइटों प्रतिरक्षा कोशिका परिसंचरण में प्रमुख खिलाड़ी है और वे मुख्य रूप से घर के लिए और लसीकावत् अंगों में रहते हैं । जबकि सामांय बी कोशिकाओं केवल पैदा करना जब टी लिम्फोसाइटों, oncogenic बी कोशिकाओं के जीवित रहने और अपरिभाषित अंग niches में autonomously विस्तार से उत्तेजित । मेंटल सेल लिंफोमा (MCL) एक ऐसे बी सेल विकार है, जहां रोगियों की औसत जीवित रहने की दर 4-5 साल है । प्रभावी तंत्र की जरूरत के लिए यह कहता है जिसके द्वारा इन कोशिकाओं के होमिंग और engraftment को अवरुद्ध किया जाता है ताकि रोगियों के अस्तित्व और दीर्घायु को बढ़ाया जा सके । इसलिए, vivo में होमिंग तंत्र को अवरुद्ध करके MCL चिकित्सीय की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए एक xenograft माउस मॉडल को विकसित करने का प्रयास अत्यंत महत्वपूर्ण है । मानव कोशिका xenotransplantation के लिए पशु प्राप्तकर्ताओं का विकास प्रारंभिक चरण दवाओं का परीक्षण करने के लिए लंबे समय तक पीछा किया गया है, के रूप में प्रासंगिक पूर्व नैदानिक माउस मॉडल नए चिकित्सीय एजेंटों स्क्रीन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस पशु मॉडल मानव भ्रष्टाचार अस्वीकृति से बचने के लिए और मानव रोगों के लिए एक मॉडल स्थापित करने के लिए विकसित की है, और यह विभिन्न लिंफोमा प्रकार के रोग प्रगति का अध्ययन करने के लिए और उंमीदवार दवाओं के लिए नैदानिक परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी उपकरण हो सकता है hematologic द्रोही, MCL की तरह. हम एक xenograft माउस मॉडल है कि एक उत्कृष्ट संसाधन के लिए अध्ययन और MCL के लिए उपंयास चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने के रूप में काम करेंगे की स्थापना की ।
Introduction
प्रकृति द्वारा लिम्फोसाइटों प्रतिरक्षा निगरानी में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, और लिम्फोसाइट ्े बढ़ते प्रतिजन विशिष्ट उन्मुक्ति1,2में एक महत्वपूर्ण कदम है । इस प्रक्रिया में थाइमस से रक्त प्रवाह के लिए भोले टी लिम्फोसाइटों का प्रवास शामिल है, और वहां से माध्यमिक लसीकावत् अंगों, लिम्फ नोड्स, Peyer के पैच, या तिल्ली, जहां वे cognate एंटीजन को पूरा शामिल है । बी लिम्फोसाइटों अस्थि मज्जा में अंतर और माध्यमिक लसीकावत् अंगों के रोम में भोली कोशिकाओं के रूप में विस्थापित3। इन बी कोशिकाओं में से कुछ उनके रिसेप्टर के साथ प्रतिजन बाँध और विशिष्ट टी कोशिकाओं द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. प्रसार और विभेदन इन बी कोशिकाओं के कूप के मेंटल जोन में गैर सक्रिय, भोली बी कोशिकाओं धक्का । सक्रिय कोशिकाओं को तो स्मृति बी कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं, जो गश्ती शरीर, या immunoglobulin में परिपक्व प्लाज्मा कोशिकाओं है कि अस्थि मज्जा4की ओर पलायन स्रावित ।
MCL तब होता है जब भोली बी मेंटल जोन में लिम्फोसाइटों को एक ट्यूमर में परिणत कर देती है. इन लिंफोमा कोशिकाओं लसीकावत् अंगों और पैदा करना के स्वतंत्र रूप से विशिष्ट टी लिम्फोसाइट नियंत्रण के microenvironment में रहते हैं । हालांकि, घनत्व के एक निश्चित चरण में वे इस आला से बचने के लिए और अंय अंगों में niches के लिए खोज में खून में reसंचारित । आसंजन अणुओं की जटिलता और chemokines और उनके रिसेप्टर्स की संकीर्णता को देखते हुए vivo में इस सेलुलर तस्करी का तंत्र खराब समझा जाता है और इसलिए चिकित्सा में बाधा उत्पन्न होती है । उपंयास तरीकों को प्रभावी ढंग से इस प्रवास की प्रक्रिया को रोकने के लिए नए microenvironments तक पहुंचने से लिंफोमा बी कोशिकाओं को रोक की जरूरत है ।
MCL बी सेल द्रोह का इलाज करने के लिए सबसे मुश्किल में से एक है । MCL के एक नवोत्पादित phenotype का विकास एक multistep झरना, अद्वितीय जीवविज्ञान संपत्तियों के अधिग्रहण की विशेषता का परिणाम है । निदान के समय, अधिकांश रोगियों (70%) पहले से ही एक प्रसार रोग के साथ मौजूद, तिल्ली, अस्थि मज्जा में extranodal भागीदारी का प्रदर्शन मामलों के बहुमत के साथ, और/या जठरांत्र संबंधी मार्ग5,6. इलाज रोगियों में, एक कुछ वर्षों के भीतर प्रतिरोधी ट्यूमर से पतन आम है, भले ही पारंपरिक कीमोथेरेपी अल्पावधि7,8में उच्च छूट दरों लाती है । यहां हम एक नया रोग मॉडल है कि मदद कर सकता है वर्तमान MCL प्रसार और उसके अंतर्निहित जीवविज्ञानी: हम एक मानव MCL xenograft माउस मॉडल है कि रोगियों की प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं से उत्पंन की स्थापना की । हमें उंमीद है कि इस मॉडल MCL प्रसार के खिलाफ चिकित्सकीय रणनीतियों के विकास में मदद मिलेगी, और संभवतः इष्टतम निदान और पलटा रोगियों के उपचार के लिए नए नैदानिक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं ।
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Protocol
जिनेवा विश्वविद्यालय अस्पताल की स्थानीय नैतिकता और मानव प्रयोग समितियों द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार मानव रक्त नमूनों का उपयोग किया गया.
पशु प्रक्रियाओं जिनेवा, स्विट्जरलैंड और कैंटर पशु चिकित्सा कार्यालय में पशु देखभाल की संस्थागत नैतिक समिति के अनुसार प्रदर्शन किया गया (प्राधिकरण संख्या: जीई/
1. घनत्व ढाल जुदाई द्वारा प्राथमिक परिधीय रक्त Mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) की तैयारी
नोट: परिधीय रक्त के 3-5 मिलीलीटर एक ल्यूकेमिया से प्रभावित चरण में MCL के साथ पेश रोगियों से प्राप्त किया गया था । निदान प्रवाह cytometry (CD5 +, CD23 −, CD200 +, मोनोक्लोनल बी सेल जनसंख्या) के लिए मानक नैदानिक मानदंडों के अनुसार स्थापित किया गया था, और बाद में गुणसूत्र translocation टी (11; 14) और cyclin D1 के व्यक्त की उपस्थिति की पुष्टि की । सभी मामलों में, मोनोक्लोनल बी कोशिकाओं का गठन > कुल बी सेल जनसंख्या का 90% । शेष कोशिकाएँ मुख्य रूप से monocytes और कुछ टी कोशिकाएँ थीं.
- पतला (1:1) रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट मीडियम १६४० (RPMI) (figure 1a) की 5 मिलीलीटर के साथ 5 मिलीलीटर MCL रक्त का नमूना ।
- उलटा घनत्व ढाल मीडिया (सामग्री की मेज) कई बार पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने से पहले ।
- एक पिपेट aspirator का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में घनत्व ढाल मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
- धीरे 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में घनत्व ढाल मीडिया पर पतला रक्त का नमूना परत एक aspirator का उपयोग (रक्त के घनत्व ढाल मीडिया अनुपात के लिए 2, 1 होना चाहिए, जैसे, 10 घनत्व ढाल मीडिया के 5 मिलीलीटर के लिए रक्त की मिलीलीटर) । देखभाल के लिए दो परतों मिश्रण नहीं लिया जाना चाहिए (आंकड़ा 1b, सी) ।
- 40 मिनट के लिए 400 x g पर नमूना केंद्रापसारक ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर बंद कर दिया ।
- एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, धीरे मध्य परत महाप्राण (सफेद, पतली अंगूठी एक तीर से चिह्नित (चित्रा 1 डी, ई)) mononuclear कोशिकाओं से युक्त है और उन्हें एक साफ ट्यूब में हस्तांतरण.
- mononuclear कोशिकाओं की धुलाई
- तबादला सेल निलंबन की मात्रा का अनुमान है और यह 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ बाँझ 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) के 3 संस्करणों को जोड़ने ।
- कई बार ऊपर और नीचे pipetting करके सस्पेंशन को मिक्स कर लें ।
- 400 पर निलंबन केंद्रापसारक-500 x जी कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए ।
- सेल गोली प्राप्त करने के लिए supernatant त्यागें और फिर से धो चरण दोहराएँ ।
- supernatant को निकालें और वांछित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें, जैसेकि पंजाब के 1 या 2 मिलीलीटर ।
- किसी स्वचालित कक्ष काउंटर द्वारा या मैन्युअल रूप से किसी hemocytometer (Neubauer कक्ष) का उपयोग करके कक्षों की संख्या गिनना.
2. बी सेल के द्वारा बी कोशिकाओं के संवर्धन नकारात्मक चयन
- पंजाब में कोशिकाओं के एक अंतिम एकाग्रता को पतला 50 x 106 कोशिकाओं/
- एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित । बी सेल संवर्धन किट से एंटीबॉडी कॉकटेल के 100 µ एल जोड़ें सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर के लिए, और धीरे pipetting ऊपर और नीचे से मिश्रण (चित्रा 2-1) ।
- 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं की मशीन ।
- 30 एस (चित्रा 2-2) के लिए बी सेल संवर्धन किट में प्रदान की संक्षेप में चुंबकीय कणों भंवर । नमूने के 2 मिलीलीटर के लिए चुंबकीय कणों के 150 µ एल जोड़ें ।
- कमरे के तापमान पर एक और 5 मिनट के लिए नमूना मशीन ।
- 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) और 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) युक्त 1x पंजाबियों के साथ 2.5 मिलीलीटर के लिए नमूना मात्रा लाओ । चुंबक में ट्यूब प्लेस और एक और 3-5 मिनट के लिए ट्यूब मशीन(चित्रा 2-3) ।
- जगह में ट्यूब के साथ चुंबक उठाओ, और एक सतत गति में, ट्यूब इतना नहीं है कि समृद्ध सेल निलंबन एक ताजा ट्यूब में एकत्र किया जाता है (चित्रा 2-4) । एक स्वचालित सेल काउंटर द्वारा या बी कोशिकाओं की कुल उपज प्राप्त करने के लिए एक hemocytometer का उपयोग कर मैंयुअल रूप से कोशिकाओं गिनती ।
नोट: आम तौर पर, उपज है ~ 105 बी कोशिकाओं/एमएल सामांय बी कोशिकाओं के लिए और 5-50 x10 6 कोशिकाओं MCL के लिए/ - बी कोशिका संवर्धन की शुद्धता की पुष्टि
- ~ 50,000 कोशिकाओं ले लो और विरोधी CD19/CD20 एंटीबॉडी (1:20 कमजोर पड़ने) और विरोधी CD45 के साथ कोशिकाओं के लिए अलग fluorochromes (1:10 कमजोर पड़ने) 15-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर युग्मित एंटीबॉडी ।
- 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर + 1% BSA के साथ धो लें, 5 मिनट के लिए 400-500 x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, और ~ 200 µ के एल में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
- फ्लो cytometry द्वारा सेल नमूने प्राप्त और बी कोशिकाओं की शुद्धता के लिए विश्लेषण । पवित्रता ज्यादातर > 90% इस पद्धति से है (चित्रा 3) ।
3. Xenograft माउस मॉडल का विकास
- निलंबित ~ 40-60 x 106 कोशिकाओं में 150-1x पंजाब के 200 µ एल (प्रति माउस सुई की आवश्यकता मात्रा) ।
- सेल निलंबन के 150 µ एल सुई (i.v.) 6-7 सप्ताह पुरानी immunodeficient मंजूरी scid गामा (एनएसजी) चूहों लिंग(चित्रा 4a) की प्रत्येक पूंछ नस में) ।
- चूहों के लिए मानव लिंफोमा विकसित करने की अनुमति ~ 10 सप्ताह.
नोट: प्राथमिक मानव लिंफोमा कोशिकाओं को अधिक समय लेने के लिए मानव लिंफोमा सेल लाइनों की तुलना में ट्यूमर का विकास (~ 3 सप्ताह) । - जब जानवरों के लिए वजन घटाने, व्याकुल बालों की तरह घातक बीमारी के लक्षण दिखाने के लिए शुरू, कम गतिविधि, हिंद अंग पक्षाघात, आदि, सह द्वारा चूहों बलिदान2 asphyxiation हृदय पंचर द्वारा पीछा रक्त प्राप्त करने के लिए ।
- चूहों को विच्छेदन करके अस्थि मज्जा, तिल्ली, और जिगर जैसे विभिन्न अंगों को इकट्ठा करें और ट्यूमर engraftment विश्लेषण (चित्रा 4B -F) के लिए बलिदान के समय दिल से रक्त ड्राइंग द्वारा परिधीय रक्त इकट्ठा.
4. विभिन्न अंगों में ट्यूमर कोशिका Engrafted का Chimerism विश्लेषण
- विभिन्न अंगों को इकट्ठा करने के बाद, यांत्रिक व्यवधान द्वारा उन्हें प्रक्रिया लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) के बाद एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए lysis का उपयोग कर 200 µ एल के लिए 1x अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम बफर के रक्त और अस्थि मज्जा, तिल्ली के लिए 500 µ एल, और जिगर के लिए 2 मिलीलीटर .
- गिनती और मानव बी सेल विशिष्ट एंटीबॉडी, यानी, विरोधी CD19, विरोधी CD20, और विरोधी CD45 का उपयोग कर कोशिकाओं दाग ।
नोट: एनएसजी चूहों बी कोशिकाओं की कमी है और इसलिए विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं मानव विशिष्ट बी सेल मार्कर के साथ दाग रहे हैं । - बी कोशिकाओं पर गेटिंग द्वारा प्रवाह cytometry द्वारा प्रत्येक अंग से व्युत्पंन कोशिकाओं का विश्लेषण (CD19 +, CD20 +, CD45 +) ।
- engrafted ट्यूमर कोशिकाओं MCL इंजेक्शन चूहों से व्युत्पंन gated कोशिकाओं पर आधारित के रूप में कदम 4.3 में संकेत दिया है (चित्रा 4g) ।
नोट: विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
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Representative Results
पांडुलिपि MCL कोशिकाओं के engraftment के लिए एक xenograft माउस मॉडल के सफल विकास के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन । एक शुद्ध कोशिका जनसंख्या की तैयारी (इस मामले MCL कोशिकाओं में), सफल MCL xenografts विकसित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. चित्रा 1 घनत्व ढाल जुदाई द्वारा MCL रोगी के रक्त से mononuclear कोशिका अलगाव के लिए preparative चरणों का प्रतिनिधित्व करता है । mononuclear कोशिकाओं को आगे चूहों में xenograft इंजेक्शन के लिए एक शुद्ध कोशिका जनसंख्या प्राप्त करने के लिए एक नकारात्मक बी सेल संवर्धन किट का उपयोग कर शुद्ध बी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए संसाधित कर रहे हैं. देखभाल के लिए अधिकतम पवित्रता प्राप्त करने के लिए लिया जाना चाहिए ताकि सफल MCL engraftment है । इस विधि का उपयोग कर प्राप्त पवित्रता आमतौर पर > 90% है । शेष कोशिकाओं को मुख्य रूप से monocytes थे और कुछ टी कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।
चित्र 2 विधियां अनुभाग में बताए अनुसार B कक्ष शुद्धिकरण प्रोटोकॉल के विभिंन चरणों का प्रतिनिधित्व करता है । समृद्ध कोशिकाओं को और अधिक विभिन्न मार्करों का उपयोग कर प्रवाह cytometer द्वारा उनकी पवित्रता के लिए विश्लेषण कर रहे हैं (CD45, CD19, CD20, CD23, CD200, CD5, कापा, और लैंब्डा). चित्रा 3 में दर्शाए अनुसार अनुक्रमिक गेटिंग MCL कोशिकाओं के निस्र्पक की अनुमति देता है: CD45 +, CD19 +, CD20 +, CD5 +, CD23 −, और CD200 − चुने गए हैं । बहुरंगा धुंधला के लिए मुआवजा इस्तेमाल fluorochromes में से प्रत्येक के लिए एक दाग नियंत्रण का उपयोग करके किया गया था, मानक cytometry सेट अप के अनुसार ।
चित्रा 3E , जी से पहले और संवर्धन के बाद बी कोशिकाओं के ठेठ डॉट साजिश का प्रतिनिधित्व करता है । इस मामले में, > इस किट का उपयोग कर समृद्ध कोशिकाओं के 95% बी कोशिकाओं रहे हैं । कोशिकाओं को पंजाब में 40 की एकाग्रता पर निलंबित कर रहे हैं-60 × 106 कोशिकाओं में 150-200 µ l पंजाब के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया. वे तुरंत एनएसजी चूहों को i.v. इंजेक्शन लगा रहे थे. 10 सप्ताह के बाद, > इंजेक्शन जानवरों का 90% विकसित लिंफोमा टर्मिनल बीमारी के लक्षण (वजन घटाने, व्याकुल बाल, गतिविधि में कमी, आदि) से पता चलता है । बलिदान के बाद, तिल्ली और जिगर को हटा दिया और यांत्रिक व्यवधान द्वारा एकल सेल निलंबन (चित्रा 4d, एफ) प्राप्त करने के लिए संसाधित कर रहे हैं; रक्त हृदय हृदय पंचर द्वारा ध्यान से तैयार की जाती है और अस्थि मज्जा फीमर के दोनों सिरों को काटने और यह एक 2 एमएल RPMI माध्यम या पंजाबियों (चित्रा 4c) से भरा सिरिंज का उपयोग कर फ्लशिंग द्वारा संसाधित किया जाता है । कोशिकाओं को आगे CD19/CD20 और CD45 जैसे मानव बी सेल विशिष्ट मार्कर का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा संसाधित कर रहे हैं । हम मानव बी सेल विशिष्ट मार्करों यहां इस्तेमाल किया क्योंकि प्राप्तकर्ता माउस तनाव (एनएसजी) बी कोशिकाओं का अभाव है । चित्रा 4B - च बलिदान के बाद अंगों के संग्रह का प्रतिनिधित्व करता है और आगे की प्रक्रिया के कदम । दो रोगियों से प्राप्त MCL कोशिकाओं के engraftment का अंश चित्रा 4gमें दर्शाया गया है. विभिंन अंगों और रोगियों के बीच में engraftment पैटर्न इस तकनीक के बाद की तुलना में किया जा सकता है ।
चित्र 1: पूरे रक्त से PBMCs का अलगाव । रक्त एक MCL रोगी से खींचा RPMI मध्यम (a) में 1:1 पतला है, और इस घनत्व ढाल मीडिया (सी) में रक्त मिश्रण के बिना घनत्व ढाल मीडिया परत (ख) के शीर्ष पर ध्यान से रखा । 400 45 मिनट के लिए एक्स जी पर केंद्रापसारक mononuclear कोशिकाओं है, जो सफेद अंगूठी के रूप में दिखाई देते है अलग (तीर mononuclear कोशिका परत को इंगित करता है) (D) । इस परत को आगे प्रसंस्करण के लिए एक स्वच्छ ट्यूब में अन्य परतों के साथ मिश्रण के बिना धीरे pipetted है (ई) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: PBMCs से बी कोशिकाओं के संवर्धन. घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा पृथक PBMCs दो बार पंजाब के साथ धोया जाता है । नकारात्मक बी सेल संवर्धन किट का उपयोग और निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करके, बी कोशिकाओं की एक शुद्ध जनसंख्या प्राप्त की है (1-4). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: MCL कोशिकाओं और से पहले और संवर्धन के बाद बी कोशिकाओं की शुद्धता का FACS विश्लेषण । mononuclear MCL कोशिकाओं CD45, CD19, CD20, CD23, CD200, CD5, कापा, और लैंब्डा जैसे विभिन्न मार्करों का उपयोग कर FACS विश्लेषण की विशेषता है. CD45, CD19, CD20, CD5, और CD23 और CD200 के लिए ऋणात्मक के लिए धनात्मक कक्ष (A-F) चयनित हैं । जी संवर्धन के बाद सेल जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करता है ई, जो समृद्ध से पहले है की तुलना में नकारात्मक चयन किट का उपयोग कर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: MCL कोशिकाओं के engraftment के लिए एक xenograft मॉडल के रूप में एनएसजी चूहों । बी MCL रोगियों से व्युत्पंन कोशिकाओं एनएसजी चूहों की पार्श्व पूंछ नस (A) के माध्यम से i.v. इंजेक्शन थे । engraft को ट्यूमर के लिए कई दिनों की अनुमति के बाद, चूहों बलिदान, और विच्छेदित (ख) अस्थि मज्जा (सी), तिल्ली (डी), परिधीय रक्त (ई) (हृदय हृदय पंचर द्वारा तैयार) जैसे विभिन्न अंगों को इकट्ठा करने के लिए, और यकृत (च) । इन अंगों आगे संसाधित और बी कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया । छ MCL इंजेक्शन एनएसजी चूहों से प्राप्त विभिन्न अंगों में MCL कोशिकाओं के engraftment पैटर्न का प्रतिनिधित्व करता है. दो मरीजों से परिणाम दर्शाए गए हैं । डेटा मतलब ± SEM के रूप में दिखाया जाता है, n = 3 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
नैदानिक परीक्षणों दवाओं है कि विकास के एक उन्नत चरण में कर रहे हैं के लिए संभव है, लेकिन दवा की खोज के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । प्रारंभिक चरण की दवाओं का परीक्षण करने के लिए मानव कोशिका xenotransplantation के लिए पशु प्राप्तकर्ताओं को विकसित करने के प्रयास लंबे समय से आगे बढ़े हैं । यहाँ हम मानव भ्रष्टाचार अस्वीकृति से बचा जाता है और ऐसे MCL के रूप में मानव रोगों, के लिए एक मॉडल स्थापित कर सकते हैं कि एक पशु मॉडल मौजूद. यह वर्तमान में कला xenograft मॉडल के एक राज्य मानव ट्यूमर engraftment और ट्यूमर के विकास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए है । यहां हम एनएसजी चूहों, सबसे प्रतिरक्षा कमी माउस मॉडलों में से एक के लिए तारीख में आदेश लिंफोमा engraftment की अधिक से अधिक सफलता प्राप्त करने के लिए उपयोग करें । एनएसजी चूहों परिपक्व टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, और NK कोशिकाओं की कमी है । उंहोंने यह भी बिगड़ा cytokine संकेतन है और जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में दोष है ।
घनत्व ढाल द्वारा प्राथमिक MCL नमूना से लिम्फोसाइट तैयारी लाल रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट्स की तरह अन्य कोशिका प्रकार को दूर करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । परंपरागत रूप से, एक घनत्व ढाल केंद्रापसारक लिम्फोसाइटों के सफल अलगाव की अनुमति देता है । इन लिम्फोसाइटों के आगे प्रसंस्करण बी सेल जनसंख्या को समृद्ध करने के लिए इस पांडुलिपि के भीतर वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल के बाद एक बी सेल संवर्धन किट के उपयोग से प्राप्त होता है । देखभाल के लिए बी लिम्फोसाइट आबादी की एक उच्च शुद्धता प्राप्त करने के लिए लिंफोमा कोशिकाओं के इष्टतम engraftment तक पहुंचने लिया जाना चाहिए । MCL कोशिकाओं नसों में इंजेक्ट कर रहे हैं (कम से 40-60 x 106 कक्ष/माउस) पार्श्व पूंछ नस के माध्यम से, और चूहों को 10 सप्ताह तक के लिए लिंफोमा विकसित करने की अनुमति दी गई । चूहों बारीकी सहित बीमारी के लक्षणों के लिए हर दिन की जांच की गई, वजन घटाने, व्याकुल बाल, कम गतिविधि, हिंद अंग पक्षाघात, आदि तिल्ली, जिगर, अस्थि मज्जा की तरह विभिन्न अंगों का विश्लेषण, और प्रवाह द्वारा रक्त cytometry से पता चला MCL engraftment । हाल ही में, यह दिखाया गया है कि प्राथमिक MCL कोशिकाओं इंजेक्शन9के 20 सप्ताह में अस्थि मज्जा और विकिरणित एनएसजी चूहों की तिल्ली में engraft. इस खोज के स्वतंत्र, हम सफलतापूर्वक और अधिक तेजी से ट्यूमर गठन के साथ प्राथमिक MCL के अपने xenograft मॉडल विकसित किया है ।
इस xenograft माउस मॉडल विभिंन लिंफोमा प्रकार के रोग प्रगति के अध्ययन के लिए एक अत्यंत उपयोगी उपकरण बन सकता है । Xenograft मॉडल भी MCL तरह hematologic द्रोह के लिए उंमीदवार दवाओं के नैदानिक परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं, तथापि, उदाहरण के लिए कुछ सीमाओं के साथ, एक रोगी में पतन पर प्रमुख क्लोन जरूरी क्लोन नहीं है xenotransplantation10पर उभर रहा है । यह अलग चयनात्मक दबाव है कि xenograft विभिंन मेजबान प्रणालियों में बहोत के कारण हो सकता है । इस तनाव में टेम संरचना पूरी तरह से मानव hematopoiesis दोहराऊंगा नहीं है, इस प्रकार, मानव कोशिकाओं के दीर्घकालिक रखरखाव सीमित । मानव ट्यूमर xenografts का उपयोग करने में लाभ सीमाओं को ओवरराइड करता है के रूप में परिणाम एक मानव ट्यूमर चिकित्सा के जवाब के बारे में बायोप्सी से कुछ ही हफ्तों में प्राप्त कर रहे हैं । दवा प्रतिक्रियाओं अक्सर प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं के बजाय मानव कोशिका लाइनों xenografts के रूप में उपयोग किया जाता है जब11 रोगियों में नैदानिक गतिविधियों के साथ सहसंबंधी नहीं है, लेकिन वे संभव चिकित्सकीय प्रतिक्रियाओं के लिए आधार फार्म मदद करते हैं. एक orthotropic xenograft के रूप में प्राथमिक ट्यूमर का उपयोग एक मजबूत भविष्यवाणी प्रतिक्रिया मूल्य है, विशेष रूप से जब एक नैदानिक प्रासंगिक दवा खुराक का उपयोग किया जाता है11,12,13. लिंफोमा कोशिकाओं के होमिंग उनके niches के लिए एक महत्वपूर्ण पूर्व अपेक्षित है ताकि जीवित रहने के लिए और ट्यूमर engraftment स्थापित करने के लिए । इस प्रक्रिया को बड़ी लसीका प्रणाली के माध्यम से विनियमित है, और उच्च endothelial venules के माध्यम से परिसंचारी लिम्फोसाइटों के प्रवेश लिम्फ नोड्स में लिम्फोसाइट homeostasis का कहना है ।
लिम्फ नोड्स के माध्यम से बी लिम्फोसाइटों के संचलन endothelial बाधाओं को पार करने की आवश्यकता है और विभिन्न आसंजन अणुओं के साथ समंवित बातचीत द्वारा chemoattractant-ट्रिगर सेल माइग्रेशन । इसलिए, अणुओं है कि उनके अस्तित्व niches के लिए लिम्फोसाइटों के होमिंग नियंत्रण लक्ष्यीकरण बी सेल लिंफोमा के लिए एक नया उपचार रणनीति का गठन कर सकते है क्योंकि वे सामांय लिम्फोसाइटों के समान व्यवहार । हमारा उद्देश्य अणु जाम सी, एक जंक्शनीय आसंजन अणु, जो MCL पर मौजूद है लक्ष्य था । इस xenograft मॉडल जाम के उपचारात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा सी एंटीबॉडी पर होमिंग और प्राथमिक लिंफोमा कोशिकाओं के engraftment उनके अस्तित्व niches के लिए । हमने हाल ही में चूहों में एंटी-जैम-सी एंटीबॉडी का प्रभाव दिखाया है जो MCL सेल लाइन, Jeko-114को प्राप्त हुआ । इस एंटीबॉडी Jeko-1 कोशिकाओं के होमिंग पर एक अवरुद्ध प्रभाव पड़ा और भी जब नियमित अंतराल में प्रशासित, यह कुशलता से Jeko-1 कोशिकाओं के engraftment को रोका. होमिंग पर इसके प्रभाव के अलावा, एंटीबॉडी उपचार इस चूहों14में परीक्षण अंगों के अधिकांश में लिंफोमा engrafted उन्मूलन.
वैज्ञानिक और नैदानिक सवाल के प्रकाश में संबोधित किया जा रहा, इन xenografted ट्यूमर वर्तमान में प्रतिनिधित्व करते हैं, MCL के चिकित्सीय परिणाम का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प मॉडल.
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
इस कार्य को Ligue Genevoise contre le Cancer, शौकीन डॉ. Dubois Ferriere दिनु-Lipatti, Oncosuisse KPS-ocs, ocs-02260-08-2008 और 2914-02-2012, और स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 31003A_156760 और 310030-153456 द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-paque media | GE Healthcare | 17-1440-02 | for separation of mononuclear cells |
| RPMI Medium 1640 | Gibco-Life technologies | 61870-010 | for dilution of blood sample |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | washing of cells |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8412 | for preparation of PBS with 1% BSA used in washing cells during isolation |
| CD19-APC700 | Beckman Coulter | B49212 | human pan-B cell marker |
| CD20-APC | Beckman Coulter | A21693 | human pan-B cell marker |
| CD20-ECD | Beckman Coulter | IM3607 | human pan-B cell marker |
| CD5-PC 5.5 | Beckman Coulter | PN A70203 | human T cell marker |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | Cell surface protein typically absent in MCL |
| CD45 KO | Beckman Coulter | B36294 | Pan-leucocyte marker |
| CD200-PE | Pharmingen | 552475 | Cell surface protein typically absent in MCL |
| NOD scid gamma (NSG) mice | Charles River Laboratories | 5557 | used to develop MCL xenografts in this study |
| Easy sep Human B cell enrichment kit | Stem cell technologies | 19054 | used to enrich B cells to obtain pure cells for injecting into mice |
| FACS | Beckman Coulter | Navios | used to characterize MCL sample and to study the organs for MCL engraftment |
| 1X ammonium chloride potassium buffer | red blood lysis buffer (NH4Cl 8,024 mg/l; KHCO3 1,001 mg/l; EDTA.Na2·2H2O 3.722 mg/l ) |
References
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