Summary
Linfoma mantellare (MCL) è un difficile da trattare il disordine delle cellule di B ed è altrettanto difficile stabilire in un modello murino di xenotrapianto di MCL primario per studiare e sviluppare terapie. Qui, descriviamo la Costituzione ottimale degli xenotrapianti MCL in topi per aiutare a capire la sua biologia sottostante.
Abstract
I linfociti B sono attori chiave nella circolazione delle cellule immuni e hanno principalmente ospite e risiedono negli organi linfoidi. Mentre le cellule B normali proliferano solo quando sono stimolati da linfociti T, cellule di B oncogeniche sopravvivono ed espandono autonomamente in nicchie di organo non definito. Linfoma mantellare (MCL) è un tale disordine delle cellule B, dove il tasso di sopravvivenza mediana dei pazienti è di 4-5 anni. Ciò richiede la necessità di meccanismi efficaci per cui l'homing e l'attecchimento di queste cellule vengono bloccate al fine di aumentare la sopravvivenza e la longevità dei pazienti. Di conseguenza, lo sforzo di sviluppare un modello di xenotrapianto del topo per studiare l'efficacia di terapie MCL bloccando l'homing meccanismo in vivo è della massima importanza. Sviluppo di animali destinatari per lo xenotrapianto cellulare umana per testare farmaci fase precoce lungo sono state perseguite, come modelli di mouse preclinici rilevanti sono cruciali per nuovi agenti terapeutici dello schermo. Questo modello animale è sviluppato per evitare il rigetto dell'organo umano e per stabilire un modello per le malattie umane, e può essere uno strumento estremamente utile per studiare la progressione della malattia di tipi diversi di linfoma ed eseguire test preclinici di candidati farmaci per malignità ematologiche, come MCL. Abbiamo stabilito un modello di topo dello xenotrapianto che servirà come una risorsa eccellente per studiare e sviluppare nuovi approcci terapeutici per MCL.
Introduction
I linfociti di natura svolgono un ruolo importante nella sorveglianza immunitaria, e traffico dei linfociti è un passo fondamentale nel montaggio dell'antigene specifico immunità1,2. Questo processo include la migrazione dei linfociti T naive al timo nel flusso sanguigno e da lì a organi linfoidi secondari, inclusi i linfonodi, placche di Peyer o milza, dove si incontrano gli antigeni cognati. I linfociti B differenziano nel midollo osseo e la migrazione di cellule naive nei follicoli di organi linfoidi secondari3. Alcune di queste cellule di B legano l'antigene con loro recettore e vengono attivati da specifiche cellule T. Proliferazione e la differenziazione di queste cellule B spinge le cellule di B ingenui non attivato, nella zona del manto del follicolo. Le cellule attivate quindi possono differenziarsi in memoria B cellule, che pattugliano il corpo, o maturano in immunoglobulina che secernono le cellule di plasma che migrano al midollo osseo4.
MCL si verifica quando i linfociti di B ingenui nella zona del mantello si trasformano in un tumore. Queste cellule di linfoma risiedono nel microambiente degli organi linfoidi e proliferano indipendentemente dal controllo specifico dei linfociti T. Tuttavia, in una determinata fase della densità di fuggire da questa nicchia e ricircolare nella circolazione sanguigna in cerca di nicchie in altri organi. Considerando la complessità delle molecole di adesione e la promiscuità di chemochine e loro recettori, il meccanismo di questo cellulare traffico in vivo è capito male e quindi ostacola la terapia. Nuovi metodi sono necessari per bloccare efficacemente questo processo di migrazione per impedire che le cellule di linfoma B raggiungendo nuovi microambienti.
MCL è uno dei più difficili per il trattamento di malignità delle cellule di B. Lo sviluppo di un fenotipo neoplastico di MCL è il risultato di una cascata multistep, caratterizzata dall'acquisizione delle proprietà biologiche uniche. Al momento della diagnosi, maggior parte dei pazienti (70%) già presente con una malattia diffusa, con una maggioranza dei casi che esibiscono la partecipazione extranodal in milza, midollo osseo e/o del tratto gastrointestinale5,6. Nei pazienti trattati, ricaduta di tumori resistenti in pochi anni è comune, anche se la chemioterapia convenzionale induce tassi della remissione alta a breve termine7,8. Qui vi presentiamo un nuovo modello di malattia che può aiutare a comprendere la diffusione di MCL e sua biologia sottostante: abbiamo stabilito un modello di mouse dello xenotrapianto MCL umano che ha avuto origine dalle cellule del tumore primario dei pazienti. Speriamo che questo modello aiuterà a sviluppare strategie terapeutiche contro la diffusione di MCL e possibilmente fornire nuove prospettive cliniche per la diagnosi ottima ed il trattamento di pazienti recidivati.
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Protocol
I campioni di sangue umano sono stati utilizzati secondo procedure approvate dalle commissioni di sperimentazione umana dell'ospedale dell'Università di Ginevra ed etica locali.
Procedure degli animali sono state effettuate in conformità con l'istituzionale etico Comitato di cura degli animali in Ginevra, Svizzera e l'ufficio del veterinario cantonale (numero di autorizzazione: 15/26/GE).
1. preparazione delle cellule mononucleari di anima periferica primaria (PBMCs) tramite la separazione di gradienti di densità
Nota: 3-5 mL di sangue periferico è stata ottenuta da pazienti con MCL in una fase leucemica. La diagnosi era stabilita secondo criteri diagnostici standard per citometria a flusso (CD5 +, CD23−, CD200 +, popolazione monoclonale delle cellule B) e successivamente confermata dalla presenza di t(11;14) la traslocazione cromosomica e la sovraespressione di ciclina D1. In tutti i casi, le cellule B monoclonali costituivano a > 90% della popolazione totale delle cellule di B. Le cellule restanti erano principalmente monociti e alcune cellule di T.
- Diluire 5 mL (1:1) di campione di sangue MCL con 5 mL di terreno di Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (Figura 1A).
- Invertire i media del gradiente di densità (Tabella materiali) parecchie volte prima dell'uso per garantire la completa miscelazione.
- Aggiungere 5 mL di media pendenza di densità in una provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando un aspiratore di pipetta.
- Strato delicatamente il campione di sangue diluito sopra i mezzi di gradienti di densità la provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando un aspiratore (il sangue al rapporto di densità media pendenza dovrebbe essere 2:1, ad esempio, 10 mL di sangue a 5 mL di media pendenza di densità). Dovrebbe prestare attenzione a non mescolare i due strati (Figura 1B, C).
- Centrifugare il campione a 400 x g per 40 min a temperatura ambiente con i freni di centrifuga spenti.
- Utilizzando una pipetta Pasteur sterile, aspirare delicatamente lo strato intermedio (biancastro, sottile anello indicato con una freccia (Figura 1, E)) che contengono le cellule mononucleari e trasferirli in una provetta pulita.
- Lavaggio delle cellule mononucleari
- Stimare il volume della sospensione cellulare trasferiti e aggiungere ad esso 3 volumi di sterile 1x tamponato fosfato salino (PBS) con 1% albumina di siero bovino (BSA).
- Mescolare la sospensione pipettando su e giù più volte.
- Centrifugare la sospensione a 400-500 x g per 10-15 min a temperatura ambiente.
- Scartare il surnatante per ottenere il pellet cellulare e ripetere la fase di lavaggio.
- Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule nel volume desiderato, ad esempio, 1 o 2 mL di PBS.
- Contare il numero di cellule da un contatore di cellule automatizzato o manualmente utilizzando un emocitometro (camera di Neubauer).
2. arricchimento delle cellule di B di selezione negativa delle cellule di B
- Diluire le cellule in PBS a una concentrazione finale di 50 x 106 cellule/mL.
- Trasferire le cellule a un 5 mL provetta polistirolo. Aggiungere 100 µ l di anticorpo cocktail dal kit di arricchimento delle cellule di B a 2 mL di sospensione cellulare e mescolare delicatamente pipettando su e giù (Figura 2-1).
- Incubare le cellule a temperatura ambiente per 10 min.
- Brevemente vortice le particelle magnetiche fornite nel kit di arricchimento delle cellule di B per 30 s (Figura 2-2). Aggiungere 150 µ l delle particelle magnetiche a 2 mL del campione.
- Incubare il campione per un altro 5 min a temperatura ambiente.
- Portare il volume del campione a 2,5 mL con 1x PBS contenente 2% siero fetale di vitello (FCS) e 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Collocare la provetta nel magnete e incubare la provetta per altri 3-5 min (Figura 2-3).
- Prendi il magnete con il tubo in luogo e in un unico movimento continuo, decantare il tubo in modo che la sospensione cellulare arricchiti è raccolti in una nuova provetta (Figura 2-4). Contare le celle di un contatore di cellule automatizzato o manualmente utilizzando un emocitometro per ottenere la resa totale delle cellule B.
Nota: In genere, la resa è ~ 105 B cellule/mL per le cellule B normali e 5-50 x 106 cellule/mL per MCL. - Confermando la purezza dell'arricchimento delle cellule di B
- Prendere ~ 50.000 cellule e incubare le cellule con anticorpi anti-CD19/CD20 (01:20 diluizione) e l'anticorpo anti-CD45 accoppiato a diversi fluorocromi (01:10 diluizione) a temperatura ambiente per 15-30 min.
- Lavare con 1 mL di 1X PBS + 1% BSA, centrifugare le cellule a 400-500 x g per 5 min e risospendere le cellule in ~ 200 µ l di PBS.
- Acquisire i campioni delle cellule tramite flusso cytometry e analizzare per la purezza delle cellule B. La purezza è principalmente > 90% di questo metodo (Figura 3).
3. sviluppo del modello del topo di xenotrapianto
- Sospendere ~ 40-60 x 106 cellule in 150-200 µ l di PBS 1X (volume richiesto per iniettare per topo).
- Iniettare 150 µ l di sospensione cellulare per via endovenosa (i.v.) in ogni vena della coda di 6-7 settimana vecchio immunodeficienti scid NOD (NSG) topi gamma indipendentemente dal genere (Figura 4A).
- Consentire i topi di sviluppare linfoma umano per ~ 10 settimane.
Nota: Le cellule di linfoma umano primario richiedono molto più tempo per sviluppare tumore rispetto alle linee cellulari di linfoma umano (~ 3 settimane). - Quando gli animali cominciano a mostrare sintomi di malattia mortale come perdita di peso, capelli arruffati, diminuzione dell'attività, paralisi dell'arto, ecc., sacrificare i topi di CO2 asfissia seguita da puntura cardiaci cuore per ottenere sangue.
- Raccogli diversi organi come fegato, milza e midollo osseo dissezionando i topi e raccogliere il sangue periferico mediante prelievo di sangue dal cuore al momento del sacrificio per analisi di engraftment di tumore (Figura 4B -F).
4. chimerism analisi della cellula del tumore Engrafted nei diversi organi
- Dopo aver raccolto i diversi organi, elaborarli da rottura meccanica per generare sospensioni singola cella dopo lisi di globuli rossi (RBC) utilizzando 200 µ l di tampone di potassio cloruro di ammonio 1x per sangue e midollo osseo, 500 µ l per la milza e 2 mL per fegato .
- Contare e macchia le celle utilizzando anticorpi specifici umana delle cellule di B, cioè, anti-CD19, anti-CD20 e anti-CD45.
Nota: NSG topi privi di cellule di B e quindi per l'analisi, le cellule sono colorate con marcatori umana specifica delle cellule B. - Analizzare le cellule derivate da ogni organo tramite flusso cytometry di gating sui linfociti B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).
- Quantificare le cellule del tumore engrafted negli organi differenti derivate da topi MCL iniettato basati sulle cellule con cancello come indicato al punto 4.3 (Figura 4).
Nota: Vedi Tabella materiali particolari.
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Representative Results
Il manoscritto descrive un protocollo ottimizzato per il corretto sviluppo di un modello murino di xenotrapianto per engraftment delle cellule MCL. Preparazione di una popolazione di puro delle cellule (in questo caso cellule MCL), è molto critica per sviluppare il successo degli xenotrapianti MCL. Figura 1 rappresenta la procedura preparativa per l'isolamento di cellule mononucleate da sangue di MCL paziente tramite la separazione di gradienti di densità. Le cellule mononucleari sono ulteriormente trattate per ottenere cellule B pure utilizzando un kit di arricchimento negativa delle cellule di B per ottenere una popolazione di cellule puro iniettabile dello xenotrapianto nei topi. Cura dovrebbe essere presa per ottenere la massima purezza al fine di avere successo attecchimento di MCL. La purezza ottenuta utilizzando questo metodo è di solito > 90%. Le cellule restanti erano principalmente monociti e alcune cellule di T (dati non mostrati).
Figura 2 rappresenta le diverse fasi del protocollo di purificazione delle cellule di B come descritto nella sezione metodi. Le cellule arricchite ulteriormente analizzate per la loro purezza da citometro a flusso utilizzando differenti marcatori (CD45, CD19, CD20, CD23, CD200, CD5, kappa e lambda). Gating sequenziale come mostrato nella Figura 3 permette la caratterizzazione delle cellule MCL: CD45 +, CD19 +, CD20 +, CD5 +, CD23− e CD200− sono selezionati. Compensazione per la macchiatura multicolor è stato effettuato utilizzando i controlli macchiati singoli per ciascuno dei fluorocromi utilizzati, secondo cytometry standard set-up.
Figura 3E G rappresenta la trama di dot tipica delle cellule di B prima e dopo arricchimento. In questo caso, > 95% delle cellule arricchite utilizzando questo kit sono cellule di B. Le cellule sono sospese in PBS ad una concentrazione di 40-60 × 106 cellule in 150-200 µ l PBS come indicato nel protocollo. Immediatamente sono stati iniettati i.v. ai topi NSG. Dopo 10 settimane, > 90% del linfoma animali iniettati sviluppati Mostra segni di malattia terminale (perdita di peso, capelli arruffati, diminuzione dell'attività, ecc.). Dopo il sacrificio, milza e fegato sono rimossi e trattati per ottenere sospensioni di cellule singole da rottura meccanica (Figura 4, F); sangue è disegnata con cura da puntura cardiaci cuore e midollo osseo viene elaborato dal taglio entrambe le estremità del femore e vampate di calore utilizzando una siringa da 2 mL riempita con medium RPMI o PBS (Figura 4). Le cellule sono ulteriormente trattate mediante citometria a flusso utilizzando gli indicatori specifici di umana delle cellule di B come CD19/CD20 e CD45. Abbiamo usato marcatori specifici sulle cellule umane B qui perché il ceppo del destinatario mouse (NSG) manca di cellule B. Figura 4B - F rappresenta l'insieme degli organi dopo il sacrificio e i passaggi delle lavorazioni successive. Il grado di attecchimento delle cellule MCL derivate da due pazienti è rappresentato in Figura 4. Il modello di attecchimento in diversi organi e tra i pazienti può essere paragonato seguendo questa tecnica.
Figura 1: isolamento delle PBMC da sangue intero. Sangue prelevato da un paziente MCL è diluito 1:1 nel medium RPMI (A) e adagiate sopra lo strato di pendenza media densità (B) senza mescolare il sangue in questa media del gradiente di densità (C). Centrifugazione a 400 x g per 45 min separa le cellule mononucleari, che appaiono come anello biancastro (la freccia indica lo strato delle cellule mononucleari) (D). Questo strato è dispensato delicatamente senza miscelazione con altri livelli in una provetta pulita per un'ulteriore elaborazione (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: arricchimento di B cellule da PBMCs. PBMC isolati mediante centrifugazione in gradiente di densità sono lavate due volte con PBS. Utilizzando il negativo B cella kit di arricchimento e seguendo il protocollo del produttore, una popolazione pura di cellule B è ottenuta (1–4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi Citofluorimetrica delle cellule MCL e purezza di B cellule prima e dopo arricchimento. Le cellule mononucleari di MCL sono caratterizzate mediante analisi Citofluorimetrica, utilizzando differenti marcatori come CD45, CD19, CD20, CD23, CD200, CD5, kappa e lambda. Selezionare le celle che sono positive per CD45, CD19, CD20, CD5 e negativo per CD23 e CD200 sono (A–F). G rappresenta la popolazione delle cellule dopo arricchimento utilizzando il kit di selezione negativa rispetto a E, che è prima di arricchimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: topi NSG come un modello di xenotrapianto per engraftment delle cellule MCL. B cellule derivate da pazienti MCL sono state iniettate i.v. via vena caudale laterale dei topi NSG (A). Dopo che parecchi giorni per il tumore per attecchire, i topi sono stati sacrificati e sezionato (B) per raccogliere i diversi organi come il midollo osseo (C), milza (D), sangue periferico (E) (disegnati da puntura cardiaci cuore), e fegato (F). Questi organi sono stati ulteriormente elaborati e analizzati mediante citometria a flusso per la presenza di cellule di B. G rappresenta il modello di attecchimento delle cellule MCL negli organi differenti derivati da MCL iniettato nei topi NSG. Due pazienti i risultati vengono visualizzati. I dati sono mostrati come media ± SEM, n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Studi clinici sono possibili per i farmaci che sono in fase avanzata di sviluppo, ma non possono essere utilizzati per la scoperta di nuovi farmaci. Gli sforzi per sviluppare degli animali destinatari per lo xenotrapianto umano delle cellule al fine di testare farmaci fase precoce lungo sono stati perseguiti. Qui vi presentiamo un modello animale che evita il rigetto del trapianto umano e può stabilire un modello per le malattie umane, quali MCL. Questo è attualmente un modello di xenotrapianto d'avanguardia per studiare i meccanismi di tumore umano attecchimento e la crescita del tumore. Qui usiamo topi NSG, uno dei modelli del mouse carenti più immuni alla data, al fine di ottenere un maggiore successo di attecchimento di linfoma. NSG topi privi di cellule NK, linfociti B e cellule T mature. Inoltre hanno alterato cytokine signaling ed hanno difetti nella risposta immunitaria innata.
Preparazione del linfocita del campione primario di MCL mediante gradiente di densità è un passo importante per rimuovere altri tipi di cellule come globuli rossi e piastrine. Tradizionalmente, una centrifugazione in gradiente di densità consente l'isolamento successo dei linfociti. Ulteriore elaborazione di questi linfociti per arricchire la popolazione delle cellule B è raggiunto mediante l'uso di un kit di arricchimento delle cellule di B seguendo il protocollo, come descritto all'interno di questo manoscritto. Prestare la massima attenzione per raggiungere un'elevata purezza delle popolazioni del linfocita B per raggiungere ottima attecchimento delle cellule del linfoma. Le cellule MCL sono iniettate per via endovenosa (almeno 40-60 x 106 cellule/mouse) attraverso la coda laterale della vena ed i topi sono stati ha permesso di sviluppare linfoma per fino a 10 settimane. I topi sono stati esaminati attentamente ogni giorno per i sintomi della malattia compreso, perdita di peso, i capelli, arruffati diminuita attività, paralisi dell'arto, ecc analisi di diversi organi come milza, fegato, midollo osseo e sangue da citometria a flusso ha rivelato MCL attecchimento. Recentemente, è stato indicato che le cellule primarie di MCL attecchire nel midollo osseo e nella milza dei topi irradiati NSG a 20 settimane di iniezione9. Indipendente di questa individuazione, che abbiamo sviluppato con successo il proprio modello di xenotrapianto di MCL primaria con più rapida formazione del tumore.
Questo modello di mouse dello xenotrapianto potrebbe diventare uno strumento estremamente utile per lo studio della progressione di malattia di tipi diversi di linfoma. Modelli di xenotrapianto anche forniscono strumenti potenti per eseguire test preclinici di candidati farmaci per malignità ematologiche come MCL, tuttavia, con alcune limitazioni, ad esempio, il clone dominante presente alla ricaduta in un paziente non è necessariamente il clone emergenti su xenotrapianti10. Questo potrebbe essere dovuto alla pressione selettiva differente che xenotrapianto subisce in sistemi host diversi. La composizione ematopoietica in questo ceppo non ricapitolare completamente umano ematopoiesi, così, limitando la manutenzione a lungo termine delle cellule umane. I vantaggi nell'utilizzo di xenotrapianti umani del tumore esegue l'override delle limitazioni quando si ottengano risultati in poche settimane da una biopsia del tumore umano per quanto riguarda la risposta alla terapia. Risposte di droga non correlano spesso con attività cliniche in pazienti11 quando linee cellulari umane invece di cellule primarie del tumore sono utilizzati come xenotrapianti, ma aiutano a formare le basi per possibili risposte terapeutiche. L'uso dei tumori primari come un xenograft ortotropo ha un valore predittivo di risposta più forte, specialmente quando un dosaggio farmaco clinicamente rilevanti è usato11,12,13. Homing delle cellule di linfoma a loro nicchie è un importante pre-requisito per poter sopravvivere e per stabilire l'attecchimento del tumore. Questo processo è majorly regolato attraverso il sistema linfatico, e la voce di fare circolare i linfociti attraverso alti venules endothelial mantiene l'omeostasi dei linfociti nei linfonodi.
Circolazione dei linfociti di B attraverso i linfonodi richiede attraversamento barriere endoteliali e migrazione cellulare chemoattractant-innescato dall'interazione coordinata con molecole di adesione differenti. Di conseguenza, le molecole che controllano l'homing dei linfociti ai loro nicchie di sopravvivenza di targeting potrebbe costituire una nuova strategia di trattamento per i linfomi delle cellule B come si comportano simili a linfociti normali. Il nostro obiettivo era di indirizzare la molecola JAM-C, una molecola di adesione giunzionale, che è presente il MCL. Questo modello di xenotrapianto serviranno per studiare gli effetti terapeutici dell'anticorpo di JAM-C su homing ed engraftment delle cellule di linfoma primario a loro nicchie di sopravvivenza. Abbiamo recentemente dimostrato un effetto dell'anticorpo anti-JAM-C in topi che hanno ricevuto una linea cellulare MCL, Jeko-114. Questo anticorpo ha avuto un effetto bloccante su homing delle cellule Jeko-1 e anche quando somministrato a intervalli regolari, ha impedito in modo efficiente l'attecchimento delle cellule Jeko-1. Oltre al suo effetto su homing, il trattamento dell'anticorpo ha sradicato il linfoma innestato nella maggior parte degli organi testati nel topi14.
Alla luce la questione scientifica e clinica affrontata, questi tumori xenotrapiantati rappresentano allo stato attuale, un modello interessante per studiare il risultato terapeutico di MCL.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Ligue Genevoise contre le Cancer, Fondation Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 e 2914-02-2012 e Swiss National Science Foundation Grant 31003A_156760 e 310030-153456.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-paque media | GE Healthcare | 17-1440-02 | for separation of mononuclear cells |
| RPMI Medium 1640 | Gibco-Life technologies | 61870-010 | for dilution of blood sample |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | washing of cells |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8412 | for preparation of PBS with 1% BSA used in washing cells during isolation |
| CD19-APC700 | Beckman Coulter | B49212 | human pan-B cell marker |
| CD20-APC | Beckman Coulter | A21693 | human pan-B cell marker |
| CD20-ECD | Beckman Coulter | IM3607 | human pan-B cell marker |
| CD5-PC 5.5 | Beckman Coulter | PN A70203 | human T cell marker |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | Cell surface protein typically absent in MCL |
| CD45 KO | Beckman Coulter | B36294 | Pan-leucocyte marker |
| CD200-PE | Pharmingen | 552475 | Cell surface protein typically absent in MCL |
| NOD scid gamma (NSG) mice | Charles River Laboratories | 5557 | used to develop MCL xenografts in this study |
| Easy sep Human B cell enrichment kit | Stem cell technologies | 19054 | used to enrich B cells to obtain pure cells for injecting into mice |
| FACS | Beckman Coulter | Navios | used to characterize MCL sample and to study the organs for MCL engraftment |
| 1X ammonium chloride potassium buffer | red blood lysis buffer (NH4Cl 8,024 mg/l; KHCO3 1,001 mg/l; EDTA.Na2·2H2O 3.722 mg/l ) |
References
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