Summary
Linfoma de células do manto (MCL) é um difícil de tratar a doença associada a células B e é igualmente difícil estabelecer um modelo de rato de enxerto heterólogo do MCL primário para estudar e desenvolver a terapêutica. Aqui, descrevemos a criação bem sucedida de xenografts MCL em camundongos para ajudar a compreender a sua biologia subjacente.
Abstract
Linfócitos B são jogadores-chave na circulação de células imunes e eles principalmente para casa e residam em órgãos linfoides. Enquanto as células B normais só proliferam quando estimulados por linfócitos T, oncogênicas células B sobrevivem e expandir-se autonomamente em nichos de órgão indefinido. Linfoma de células do manto (MCL) é uma tal distúrbio de células B, onde a taxa de sobrevida mediana dos pacientes é de 4-5 anos. Isso exige a necessidade de mecanismos eficazes, pelos quais o homing e enxertia dessas células são bloqueados a fim de aumentar a sobrevivência e longevidade dos pacientes. Portanto, o esforço para desenvolver um modelo do rato de enxerto para estudar a eficácia da terapêutica MCL, bloqueando o localizador mecanismo na vivo é de extrema importância. Desenvolvimento de animais destinatários para xenotransplante de células humanas para testar drogas cedo do palco há muito ter sido exercida, como modelos de rato pré-clínicos relevantes são cruciais para novos agentes terapêuticos de tela. Este modelo animal é desenvolvido para evitar a rejeição do enxerto humano e estabelecer um modelo para doenças humanas, e pode ser uma ferramenta extremamente útil para estudar a progressão da doença de tipos diferentes de linfoma e executar testes pré-clínicos de drogas de candidato para malignidades hematológicas, como MCL. Estabelecemos um modelo do rato de enxerto heterólogo que irá servir como um excelente recurso para estudar e desenvolver novas abordagens terapêuticas para MCL.
Introduction
Linfócitos por natureza desempenham um papel importante na vigilância imune, e tráfico de linfócitos é um passo fundamental na montagem do antígeno imunidade específica1,2. Este processo inclui a migração de ingênuo T linfócitos do timo para o fluxo de sangue e de lá para os órgãos linfoides secundários, incluindo os gânglios linfáticos, de Peyer ou baço, onde se encontram os antígenos cognatos. Os linfócitos B diferenciam na medula óssea e migram como ingênuo células em folículos de órgãos linfoides secundários3. Algumas dessas células B vincular o antígeno com o receptor e são ativadas por células T específicas. Proliferação e diferenciação dessas células B empurra as células ingênua B não está ativado, para a zona do manto do folículo. Células ativadas podem diferenciar na memória B células, que patrulham o corpo, ou maduro em imunoglobulinas secretoras células plasmáticas que migram para a medula óssea4.
MCL ocorre quando linfócitos ingênua B na zona de manto transformam em um tumor. Estas células do linfoma residem no microambiente dos órgãos linfoides e proliferaram independentemente do controle específico dos linfócitos T. No entanto, em uma determinada fase de densidade escapar deste nicho e recircular na corrente sanguínea em busca de nichos em outros órgãos. Considerando a complexidade das moléculas de adesão e a promiscuidade de quimiocinas e seus receptores, o mecanismo desse celular de tráfico na vivo é mal compreendido e, portanto, dificulta a terapia. Novos métodos são necessários para efetivamente bloquear este processo de migração para impedir que as células do linfoma B atingindo novos microambiente.
MCL é uma das mais difíceis de tratar tumores malignos de células B. O desenvolvimento de um fenótipo neoplásico de MCL é o resultado de uma cascata de várias etapas, caracterizada pela aquisição de propriedades biológicas únicas. No momento do diagnóstico, a maioria dos pacientes (70%) já está presente com uma doença disseminada, com a maioria dos casos, exibindo o envolvimento extranodal no baço, medula óssea e/ou o trato gastrointestinal5,6. Em pacientes tratados, recaída por tumores resistentes dentro de alguns anos é comum, mesmo que a quimioterapia convencional induz a taxas de remissão de alta no curto prazo7,8. Aqui nós apresentamos um novo modelo de doença que pode ajudar a entender a divulgação MCL e sua biologia subjacente: estabelecemos um humano MCL xenoenxertos rato modelo que originou as células do tumor primário dos pacientes. Esperamos que este modelo vai ajudar a desenvolver estratégias terapêuticas contra divulgação de MCL e possivelmente proporcionar novas perspectivas clínicas para melhor diagnóstico e tratamento dos pacientes recaíram.
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Protocol
As amostras de sangue humano foram utilizadas de acordo com procedimentos aprovados pelo local de ética e comissões de experimentação humana do Hospital da Universidade de Genebra.
Animais procedimentos foram realizados em conformidade com o institucional ética Comissão de cuidado Animal em Genebra, na Suíça e o veterinário cantonais (número de autorização: GE/26/15).
1. preparação de células mononucleares do sangue periférico primário (PBMC) pela separação de gradiente de densidade
Nota: obteve-se 3-5 mL de sangue periférico de pacientes que apresentam com MCL numa fase leucêmicas. O diagnóstico foi estabelecido de acordo com critérios de diagnósticos por citometria de fluxo (CD5 +, CD23−, CD200 +, população monoclonal de células B) e posteriormente confirmado pela presença de t(11;14) a translocação cromossômica e superexpressão de ciclina D1. Em todos os casos, o anticorpo monoclonal de células B constituíam para > 90% da população total de células B. As células restantes foram principalmente monócitos e algumas células T.
- Diluído (1:1) 5 mL de amostra de sangue do MCL com 5 mL de meio de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (figura 1A).
- Inverta os meios de comunicação de gradiente de densidade (Tabela de materiais) várias vezes antes do uso para assegurar uma mistura completa.
- Adicione 5 mL de mídia gradiente de densidade em um tubo de centrífuga de 15 mL usando um aspirador pipeta.
- Suavemente da camada da amostra de sangue diluído sobre a mídia de gradiente de densidade no tubo de centrífuga de 15 mL, usando um aspirador (o sangue a relação da mídia gradiente de densidade deve ser 2:1, por exemplo, 10 mL de sangue com 5 mL de mídia gradiente de densidade). Deve ter cuidado para não misturar as duas camadas (figura 1B, C).
- Centrifugar a amostra a 400 x g, durante 40 min à temperatura ambiente com os freios de centrífuga desligados.
- Delicadamente, usando uma pipeta Pasteur estéril, Aspire a camada média (esbranquiçado, fino anel marcado com uma seta (Figura 1, E)) que contém as células mononucleares e transferi-los para um tubo limpo.
- Lavagem de células mononucleares
- Estimar o volume da suspensão celular transferidos e adicione-lhe 3 volumes de estéril 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) com 1% albumina de soro bovino (BSA).
- Misture a suspensão pipetando subindo e descendo várias vezes.
- Centrifugar a suspensão de 400-500 x g durante 10-15 min à temperatura ambiente.
- Desprezar o sobrenadante para obter o centrifugado e repetir a etapa de lavagem.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células no volume desejado, por exemplo, 1 ou 2 mL de PBS.
- Conte o número de células por um contador de célula automática ou manualmente usando um hemocytometer (câmara de Neubauer).
2. enriquecimento de células B por células B seleção negativa
- Dilua as células em PBS para uma concentração final de 50 x 106 células/mL.
- Transferi as células para um 5 mL redonda poliestireno tubo inferior. Adicione 100 µ l de anticorpo cocktail do kit do enriquecimento da célula B a 2 mL de suspensão de células e misture suavemente pipetando acima e para baixo (Figura 2-1).
- Incube as celulas em temperatura ambiente por 10 min.
- Brevemente vórtice partículas magnéticas fornecido no kit do enriquecimento de células B por 30 s (Figura 2-2). Adicione 150 µ l das partículas magnéticas a 2 mL da amostra.
- Incube a amostra por mais 5 min à temperatura ambiente.
- Trazer o volume da amostra de 2,5 mL com 1X PBS contendo 2% de soro de vitela fetal (FCS) e o ácido 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Colocar o tubo no imã e incubar o tubo por outro 3-5 min (Figura 2-3).
- Pegue o ímã com o tubo no lugar e em um movimento contínuo, decantar o tubo para que a suspensão de eritrócitos enriquecido é coletada em um tubo fresco (Figura 2-4). Conte as células por um contador de célula automática ou manualmente usando um hemocytometer para obter o rendimento total de células B.
Nota: Normalmente, o rendimento é de 10 ~5 B células/mL para o normal de células B e 5-50 x 106 células/mL para MCL. - Confirmando a pureza do enriquecimento da célula B
- Leve ~ 50.000 células e incubar as células com anticorpos anti-CD19/CD20 (01:20 diluição) e anticorpo anti-CD45 acoplado ao fluorochromes diferentes (01:10 diluição) à temperatura ambiente por 15-30 min.
- Lavar com 1 mL de 1X PBS + 1% de BSA, Centrifugar as células a 400-500 x g por 5 min e ressuspender as células em ~ 200 µ l de PBS.
- Adquirir as amostras de células por citometria de fluxo e analisar para a pureza das células B. A pureza é principalmente > 90% por esse método (Figura 3).
3. desenvolvimento do modelo de Mouse de enxerto heterólogo
- Suspenda ~ 40-60 x 106 células em 150-200 µ l de PBS 1x (volume necessário para injetar por rato).
- Injetar 150 µ l de suspensão de células por via intravenosa (i.v.) em cada veia da cauda de camundongos imunodeficientes 6-7 semanas da gama (NSG) do scid NOD independentemente do gênero (Figura 4A).
- Permitir que os ratos desenvolver linfoma humana para ~ 10 semanas.
Nota: Células do linfoma primário de humano leva muito mais tempo para desenvolver o tumor, em comparação com linhas de células do linfoma humano (~ 3 semanas). - Quando os animais começam a apresentar sintomas de doença fatal, como a perda de peso, cabelo babado, paralisia dos membros posteriores, diminuição da atividade, etc., sacrificar os ratos por CO2 asfixia seguida por punção cardíaca coração para obter sangue.
- Coletamos diferentes órgãos como a medula óssea, baço e fígado dissecando os ratos e coletar sangue periférico por sangue de desenho do coração no momento do sacrifício para análise de enxertia do tumor (Figura 4B -F).
4. quimerismo análise de células de Tumor incorporada em diferentes órgãos
- Depois de coletar os diferentes órgãos, processá-los por ruptura mecânica para gerar suspensões única célula após a lise de células vermelhas do sangue (RBC) usando 200 µ l de tampão de potássio de cloreto de amónio 1x para o sangue e medula óssea, 500 µ l para o baço e 2 mL para o fígado .
- Contar e mancha as células usando anticorpos específicos de célula B humana, ou seja, anti-CD19, anti-CD20 e anti-CD45.
Nota: Ratos NSG carecem de células B e, portanto, para análise, células estão manchadas com marcadores de célula B específico humana. - Analise as células derivadas de cada órgão, por citometria de fluxo, por retenção de células B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).
- Quantificar as células do tumor engrafted em diferentes órgãos derivados de ratos MCL injetado baseados em células fechadas conforme indicado no passo 4.3 (Figura 4).
Nota: Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes.
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Representative Results
O manuscrito descreve um protocolo otimizado para o desenvolvimento bem sucedido de um modelo de mouse de enxerto para enxertia das células MCL. Preparação de uma população celular puro (en este caso MCL células), é muito crítico para desenvolver bem sucedidas xenografts MCL. A Figura 1 representa as etapas preparativa para isolamento de células mononucleares do sangue do paciente MCL pela separação de gradiente de densidade. As células mononucleares são transformadas, posteriormente, para obter células de B puras usando um kit de enriquecimento negativo da pilha de B para obter uma população celular puro para injeção de enxerto heterólogo em camundongos. Deve ter cuidado para obter a máxima pureza para poder ter sucesso enxertia MCL. A pureza obtida com este método é geralmente > 90%. As células restantes foram principalmente monócitos e algumas células T (dados não mostrados).
A Figura 2 representa as diferentes etapas do protocolo de purificação de células B, conforme descrito na seção de métodos. As células enriquecidas analisam-se ainda mais para sua pureza pelo citômetro de fluxo utilizando diferentes marcadores (CD45, CD19, CD20, CD23, CD200, CD5, kappa e lambda). Gating sequencial como mostrado na Figura 3 permite a caracterização de células MCL: CD45 +, CD19 +, CD20 +, CD5 +, CD23− e CD200− são selecionados. Compensação para coloração multicolor foi realizada usando controles manchadas único para cada um dos fluorochromes usados, de acordo com a configuração padrão de citometria.
Figura 3E G representa o enredo típico ponto de células B, antes e depois de enriquecimento. Neste caso, > 95% das células enriquecidas usando este kit são células B. As células são suspensas em PBS em uma concentração de 40-60 × 106 células em 150-200 µ l PBS como mencionado no protocolo. Eles foram imediatamente injetados i.v. para ratos NSG. Depois de 10 semanas, > 90% do linfoma injetado animais desenvolvidos mostra sinais de doença terminal (perda de peso, babados de cabelo, diminuição da atividade, etc.). Após o sacrifício, baço e fígado são removidos e processados para obter suspensões celulares único por ruptura mecânica (Figura 4, F); sangue é desenhado cuidadosamente por punção cardíaca do coração e da medula óssea é processada por um corte de ambas as extremidades do fêmur e rubor-lo usando uma seringa de 2ml preenchida com meio RPMI ou PBS (Figura 4). As células são transformadas posteriormente por citometria de fluxo utilizando marcadores específicos de célula B humana como CD19/CD20 e CD45. Nós usamos marcadores específicos de célula B humana aqui porque a cepa de rato destinatário (NSG) carece de células B. Figura 4B - F representa a coleção de órgãos após o sacrifício e as etapas de processamento adicional. O grau de enxertia de MCL células derivadas de dois pacientes é representado na Figura 4. O padrão de enxertia em diferentes órgãos e entre pacientes pode ser comparado a seguir esta técnica.
Figura 1: isolamento de PBMC do sangue inteiro. Sangue de um paciente MCL é diluído 1:1 em meio RPMI (A) e colocado cuidadosamente sobre a camada de mídia gradiente de densidade (B) sem misturar o sangue para essa mídia de gradiente de densidade (C). Centrifugação a 400 x g, durante 45 min separa as células mononucleares, que aparecem como anel esbranquiçado (a seta indica a camada de células mononucleares) (D). Esta camada é pipetada suavemente sem mistura com outras camadas em um tubo limpo para processamento adicional (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: enriquecimento de B células de PBMC. PBMC isolado por centrifugação gradiente de densidade é lavado duas vezes com PBS. Usando o negativo B célula kit de enriquecimento e, seguindo o protocolo do fabricante, uma população pura de células B é obtida (1–4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: FACS análise de células MCL e pureza de B células antes e após enriquecimento. As células mononucleares do MCL caracterizam-se pela análise de FACS utilizando diferentes marcadores como CD45, CD19, CD20, CD23, CD200, CD5, kappa e lambda. As células que são positivas para CD45, CD19, CD20, CD5 e negativo para CD23 e CD200 são selecionadas (A–F). G representa a população celular após enriquecimento usando o kit de seleção negativa em relação ao E, que é antes de enriquecimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: ratos NSG como um modelo de transplante para enxertia das células MCL. Células B derivadas de pacientes MCL foram injetadas intravenoso através da veia lateral da cauda de ratos NSG (A). Após permitir vários dias para o tumor de engraft, os ratos foram sacrificados e dissecados (B) para coletar diferentes órgãos como a medula óssea (C), baço (D), (E) de sangue periférico (desenhados por punção cardíaca coração), e fígado (F). Estes órgãos foram processados e analisados por citometria de fluxo para a presença de células B. G representa o padrão de enxertia das células MCL em diferentes órgãos derivados MCL injetaram ratos NSG. São mostrados os resultados de dois pacientes. Dados são apresentados como média ± SEM, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ensaios clínicos são possíveis para drogas que estão em um estágio avançado de desenvolvimento, mas não podem ser usadas para a descoberta de medicamentos. Os esforços para desenvolver animais destinatários para xenotransplante de células humanas para testar drogas cedo do palco há muito tem sido exercidos. Aqui nós apresentamos um modelo animal que evita a rejeição do enxerto humano e pode estabelecer um modelo para doenças humanas, tais como MCL. Este é actualmente um modelo de transplante do estado da arte para estudar os mecanismos de enxertia de tumor humano e crescimento do tumor. Aqui usamos ratos NSG, um dos modelos mais imunes deficiente do rato até à data, a fim de alcançar o maior sucesso de enxertia de linfoma. Os ratos NSG faltam maduras células T, células B e células NK. Eles também têm prejudicado a citocinas sinalização e defeitos na resposta imune inata.
Preparação de linfócitos da amostra primária MCL por gradiente de densidade é um passo importante para remover outros tipos de células como glóbulos vermelhos e plaquetas. Tradicionalmente, uma centrifugação gradiente de densidade permite isolamento bem sucedido de linfócitos. Transformação destes linfócitos para enriquecer a população de células B é atingida pelo uso de um kit de enriquecimento de células B seguindo o protocolo como descrito dentro deste manuscrito. Deve ter cuidado para atingir um grau de pureza elevado de populações de linfócitos B para alcançar o ideal enxertia das células de linfoma. As células MCL são injetadas por via intravenosa (pelo menos 40-60 x 106 células/rato) através da cauda lateral veia e os ratos foram autorizados a desenvolver linfoma até 10 semanas. Os ratos foram examinados atentamente todos os dias para os sintomas da doença, incluindo a perda de peso, arrepiou o cabelo, diminuição da atividade, paralisia dos membros posteriores, etc. análise dos diferentes órgãos como baço, fígado, medula óssea e sangue por citometria de fluxo revelou MCL enxertia. Recentemente, demonstrou-se que células primárias do MCL engraft na medula óssea e baço de ratos irradiados de NSG de 20 semanas de injeção9. Independente desta conclusão, com sucesso desenvolvemos nosso próprio modelo de enxerto de MCL primário com mais rápida formação de tumor.
Este modelo de rato de enxerto heterólogo pode tornar-se uma ferramenta extremamente útil para o estudo da progressão da doença de tipos diferentes de linfoma. Modelos de enxerto heterólogo também fornecem ferramentas poderosas para executar testes pré-clínicos de drogas candidato para malignidades hematológicas como MCL, no entanto, com certas limitações, por exemplo, o clone dominante presente na recaída em um paciente não é necessariamente o clone emergentes na xenotransplantação10. Isto pode ser devido à pressão seletiva diferente que o enxerto sofre em sistemas de host diferente. A composição hematopoiética nesta estirpe não recapitular totalmente humano hematopoiese, assim, limitando a manutenção a longo prazo das células humanas. As vantagens em usar xenografts humanos tumor substitui as limitações como os resultados são obtidos em poucas semanas de uma biópsia de tumor humano em relação à resposta à terapia. Respostas de drogas muitas vezes não correlaciona com atividades clínicas em pacientes11 quando linhas de células humanas em vez de células de tumor primário são usadas como xenografts, mas eles ajudam a formar as bases para possíveis respostas terapêuticas. O uso de tumores primários como um enxerto Ortotrópico tem um valor preditivo de resposta mais forte, particularmente quando uma dose de droga clinicamente relevante é usado11,12,13. Hospedagens de células do linfoma de seus nichos é um pré-requisito importante para sobreviver e para estabelecer a enxertia de tumor. Este processo é muito regulamentado através do sistema linfático, e a entrada de linfócitos através da vênulas endoteliais altas em circulação mantém a homeostase de linfócitos nos linfonodos.
Circulação dos linfócitos B através de linfonodos requer travessia endotelial barreiras e migração celular quimiotático desencadeada pela interação coordenada com moléculas de adesão diferentes. Portanto, visando as moléculas que controlam a orientação dos linfócitos para seus nichos de sobrevivência poderia constituir uma nova estratégia de tratamento de linfomas de células B como eles se comportam semelhante para os linfócitos normais. Nosso objetivo era a molécula JAM-C, uma molécula de adesão, que está presente na MCL-alvo. Este modelo de enxerto será usado para estudar os efeitos terapêuticos da JAM-C anticorpo na orientação e enxertia de células do linfoma primário de seus nichos de sobrevivência. Recentemente mostramos um efeito de anticorpo anti-JAM-C em ratos que receberam uma linha de celular MCL, Jeko-114. Este anticorpo teve um efeito bloqueador na orientação das células Jeko-1 e também quando administrado em intervalos regulares, eficientemente impediu que a enxertia das células Jeko-1. Além de seu efeito na orientação, o tratamento de anticorpo erradicado a linfoma incorporada na maioria dos órgãos testados neste ratos14.
Tendo em conta a questão a ser tratada científica e clínica, estes tumores xenografted representam, actualmente, um modelo interessante para estudar o resultado terapêutico da MCL.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Ligue Genevoise contre le Cancer, Fondation Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 e 2914-02-2012 e o suíço nacional Science Foundation Grant 31003A_156760 e o 310030-153456.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-paque media | GE Healthcare | 17-1440-02 | for separation of mononuclear cells |
| RPMI Medium 1640 | Gibco-Life technologies | 61870-010 | for dilution of blood sample |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | washing of cells |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8412 | for preparation of PBS with 1% BSA used in washing cells during isolation |
| CD19-APC700 | Beckman Coulter | B49212 | human pan-B cell marker |
| CD20-APC | Beckman Coulter | A21693 | human pan-B cell marker |
| CD20-ECD | Beckman Coulter | IM3607 | human pan-B cell marker |
| CD5-PC 5.5 | Beckman Coulter | PN A70203 | human T cell marker |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | Cell surface protein typically absent in MCL |
| CD45 KO | Beckman Coulter | B36294 | Pan-leucocyte marker |
| CD200-PE | Pharmingen | 552475 | Cell surface protein typically absent in MCL |
| NOD scid gamma (NSG) mice | Charles River Laboratories | 5557 | used to develop MCL xenografts in this study |
| Easy sep Human B cell enrichment kit | Stem cell technologies | 19054 | used to enrich B cells to obtain pure cells for injecting into mice |
| FACS | Beckman Coulter | Navios | used to characterize MCL sample and to study the organs for MCL engraftment |
| 1X ammonium chloride potassium buffer | red blood lysis buffer (NH4Cl 8,024 mg/l; KHCO3 1,001 mg/l; EDTA.Na2·2H2O 3.722 mg/l ) |
References
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