Summary
Este protocolo foi desenvolvido para identificar quantitativamente os componentes do microambiente tumoral em resecções do paciente com glioblastoma usando imuno-histoquímica cromogênica e ImageJ.
Abstract
Com o crescente interesse no microambismo do tumor, buscamos desenvolver um método para determinar especificamente os componentes do microambiente dentro de amostras de pacientes com glioblastoma, o câncer cerebral mais mortal e invasivo. Não só os métodos quantitativos são benéficos para descrever com precisão os tecidos doentes, mas também podem contribuir para um prognóstico mais preciso, diagnóstico e desenvolvimento de sistemas e substituições de engenharia de tecidos. No glioblastoma, as células gliais, como a microglia e os astrócitos, foram correlacionadas de forma independente com um mau prognóstico com base na classificação de patologistas. No entanto, o estado dessas células e outros componentes das células gliais não foram bem descritos de forma quantitativa. Isso pode ser difícil devido aos grandes processos que marcam essas células gliais. Além disso, a maioria das análises histológicas se concentra na amostra de tecido geral ou apenas na maior parte do tumor, ao contrário de delinear as quantificações com base em regiõesSobre o tecido altamente heterogêneo. Aqui, descrevemos um método para identificar e analisar quantitativamente as populações de células gliais dentro do tumor a granel e regiões adjacentes de ressecções tumorais de pacientes com glioblastoma. Utilizamos imuno-histoquímica cromogênica para identificar as populações de células gliais em resecções tumorais do paciente e ImageJ para analisar a cobertura percentual de coloração para cada população glial. Com essas técnicas, podemos descrever melhor as células gliais em todas as regiões do microambiente do tumor de glioma.
Introduction
O glioblastoma (GBM), o câncer cerebral mais comum e maligno, é caracterizado por invasão altamente difusa do tumor primário para o parênquima 1 , 2 do cérebro circundante. Essa invasão difusa torna o tumor particularmente difícil de ressecar completamente, e as células cancerígenas invasoras que permanecem pós-terapia são a razão mais comum para recorrência inevitável 2 , 3 , 4 . Anteriormente, achamos inibir a invasão de células de glioma difuso para ser terapeuticamente benéfico 5 , porém pouco se sabe sobre os mecanismos complexos que contribuem para a invasão GBM. O microambiente do tumor, ou tecido que envolve o câncer, tem sido implicado na progressão de tumores em cânceres múltiplos 6 , 7 . O microambiente tumoral do glioblastoma, em pArticular, é relativamente pouco caracterizada e é exclusivamente complexa, composta de células gliais múltiplas, como astrocitos, microglia e oligodendrócitos, bem como matriz extracelular, fatores solúveis e fatores biofísicos. Experimentalmente, os astrocitos e a microglia demonstraram aumentar a progressão do glioma e a invasão 8 , 9 , 10 , mas a composição de todas as células gliais no microambiente do cérebro humano nativo é desconhecida.
Nós anteriormente mostramos componentes microambientais que podem prever a sobrevivência do paciente analisando quantitativamente os componentes celulares do microambiente do glioblastoma e incorporando nossas análises em um modelo de riscos proporcionais 11 . Aqui, descrevemos o método de análise quantitativa para identificar as populações de células gliais dentro do tumor a granel e regiões adjacentes de ressecções tumorais do paciente com glioblastomaS. Utilizamos imuno-histoquímica cromogênica para identificar as populações de células gliais e ImageJ para analisar a cobertura percentual de coloração para cada população glial. Avaliar a cobertura percentual cria uma medida simples para determinar as diferenças morfológicas das células, particularmente aquelas afetadas pelas interações com células cancerígenas. Estudos anteriores para quantificar a coloração histopatológica usam coloração padrão, como hematoxilina e eosina 12 ou tricromo 13 de Masson, que não aproveitam a especificidade da coloração imuno-histoquimica baseada em anticorpos. Nosso método foi desenvolvido para quantificar diretamente as populações gliais dentro das resecções tumorais do paciente com glioblastoma, que pretendemos usar para elucidar o microambiente do glioblastoma complexo.
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Protocol
Este protocolo identifica componentes celulares em amostras embutidas em parafina fixada em formalina (FFPE), como é típico para amostras de pacientes clínicas bancárias. A incorporação de parafina permite a melhor manutenção da morfologia celular e tecidual, além de ter uma melhor longevidade das seções. As amostras utilizadas para esta análise foram acessadas através da Universidade de Virginia Biorepository e Tissue Research Facility. As amostras de pacientes foram selecionadas por um neuropatologista com base em um diagnóstico definitivo de glioblastoma (astrocitoma, grau IV da OMS) que completaram ressecções tumorais na Universidade da Virgínia entre 2010 e 2013 e foram des-identificados antes dessa análise 11 .
1. Desparaffinização e Reidratação de Amostras FFPE
NOTA: Esta parte do protocolo é específica para amostras FFPE. Embora as amostras embutidas em parafina possam ser mais úteis para esta análise, devido à preservação de células e tQuestão de morfologia, esta análise também pode ser feita com seções congeladas. Se estiver usando seções congeladas, esta porção pode ser omitida e proceder diretamente à imuno-histoquímica cromogênica.
- Execute as seguintes lavagens por 5 minutos cada: Xileno, Xileno, 100% Etanol, 100% Etanol, 95% Etanol, 95% Etanol, 70% Etanol, Água desionizada, Água desionizada
2. Antigen Retrieval
NOTA: Esta porção do protocolo é necessária para quebrar pontes de metileno formadas durante a fixação de formalina de amostras de FFPE e expor sites de antígenos para anticorpos para se ligar.
- Diluir a solução de desmascaramento de antigénio de alto pH com base em Tris na recomendação do fabricante em água destilada.
- Execute a recuperação do antígeno mediada pelo calor usando um microondas. Outras formas de recuperação mediada pelo calor (como panela de pressão, vaporizador de vegetais ou água fervente) também seriam suficientes.
- Adicione a solução de desmascaramento diluída a um microondas não seladoembarcação. Coloque as lâminas na embarcação. Coloque as lâminas no microondas.
- Ferver durante 20 minutos com alta potência. Monitore os níveis de líquido para evaporação e reabasteça com água destilada conforme necessário.
- Permitir que as amostras esfriem em solução durante 1 h à temperatura ambiente.
3. Imunohistoquímica cromogênica
- Esboce uma amostra de tecido com uma caneta hidrofóbica para minimizar o volume de reagentes necessários para cobrir a amostra.
NOTA: Certifique-se de manter as amostras de tecido hidratadas e não as deixe secar, pois isso afetará a eficácia da coloração. - Pipetar uma solução de permeabilização suficiente (solução salina tamponada com Tris (TBS) + Triton-X a 0,01% para cobrir a amostra de tecido (tipicamente cerca de 100 a 200 μL).
- Remova e descarte a solução e repita o passo 3.2.
- Incubar amostras à temperatura ambiente com solução de bloqueio (2,5% de soro de cavalo + solução de permeabilização).
- Incubar amostras durante a noite em 4 ºC com anticorpos primários diluídosEm solução de bloqueio.
NOTA: Todos os anticorpos primários utilizados aqui são diluídos a 1: 200, mas as diluições ideais podem ser determinadas usando diluições em série, começando com a recomendação do fabricante. Informações detalhadas sobre os anticorpos usados neste protocolo foram previamente publicadas 11 . - Detectar anticorpos primários usando um reagente de polímero de peroxidase de rábano correspondente ao animal hospedeiro do anticorpo primário, seguindo o protocolo do fabricante.
- Pipetar solução de permeabilização suficiente para cobrir a amostra de tecido e incubar durante 5 min.
- Remova e descarte a solução e repita a Etapa 3.7.
- Incubar as lâminas em 0,3% de H 2 O 2 em 1x TBS durante 15 min.
- Desenvolva amostras com um substrato de peroxidase diaminobenzidina (DAB) durante 2 a 10 min até atingir a intensidade de mancha desejada.
- Contra-amostras para identificar núcleos celulares, como com hematoxilina, seguindo o protocolo do fabricante.
- Desidratar amostras com 100%Etanol e xileno.
- Monte amostras permanentemente com mídia de montagem.
4. Identificação das Regiões de Interesse
- Lâminas de imagem sob microscópio de campo brilhante capaz de imagens de alta resolução.
NOTA: use componentes celulares de imagem com uma resolução mínima de 20x. - Mova a câmera para regiões específicas de interesse em amostras de tecido.
- Salve imagens como arquivos TIFF para quantificação.
5. Análise de imagem
- Abra imagens no ImageJ para quantificar a cobertura percentual.
- Use o plug-in Limite de cor para remover a cor roxa dos núcleos corados com hematoxilina.
- Converta a imagem para 8 bits.
- Adicione um limite sem fundo escuro.
- Processe a imagem usando um dos 17 filtros de limiar ImageJ pré-carregados ( ou seja, MaxEntropy), de modo que apenas as porções coloridas DAB estão incluídas no limite.
NOTA: Selecione o filtro de limite pré-carregado ótimo que minimizouÉ inclusão de coloração de fundo. Isso pode depender da qualidade da coloração e especificidade do anticorpo. Use o mesmo limite para todas as repetições técnicas dentro de cada amostra de paciente. - Aplicar limite.
- Medir a área de porcentagem da imagem limite.
- Cobertura de área percentual média para múltiplas regiões dentro de cada amostra.
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Representative Results
Para esta análise, duas regiões de interesses dentro de nossas ressecções tumorais - o tumor primário e as regiões adjacentes, principalmente composta de tecido saudável com células invadidas de câncer invasivo ( Figura 1A , 1B ) - foram identificadas por neuropatologistas colaboradores em hematóxilina e paciente com corante de eosina Amostras. Dentro de cada amostra de paciente, identificou-se a coloração positiva para astrocitos ( Figura 1C ), microglia ( Figura 1D ) e oligodendrócitos ( Figura 1E ) através de imuno-histoquímica cromogênica. Essas populações foram identificadas utilizando anticorpos primários ALDH1L1, Iba1 e Oligodendrocyte-Specific Protein (OSP1), respectivamente 11 . Recomenda-se a otimização das diluições de anticorpos, bem como a consulta com os protocolos do fabricante para confirmar se a coloração é precisa e positiva ( Figura 2 ). Por exemplo, realizamos manchas sem anticorpo primário para um controle negativo ( Figura 2A ), o fabricante recomendou ( Figura 2B ) e diluições adicionais ( Figura 2C , 2D ) antes de se estabelecer na diluição 1: 200 ( Figura 2C ) devido a Coloração positiva ótima do corpo celular e processos com minimização de fundo para o anticorpo anti-ALDH1L1.
Usando ImageJ, a cobertura percentual da coloração com oligodendrócitos OSP1 + foi quantificada para comparar as diferenças em nossas regiões de interesse ( Figura 3A ). Removemos os núcleos contra-cortados da imagem usando o plug-in Threshold Color para avaliar exclusivamente a coloração DAB positiva ( Figura 3B ). Depois de converter a imagem para 8 bits (Ss = "xfig"> Figura 3C), aplicamos o limiar padrão MaxEntropy para a coloração DAB positiva restante ( Figura 3D ). Aqui, usamos o padrão de limite de MaxEntropy porque esse limite padrão padrão melhor capturou nossa mancha positiva ao mesmo tempo em que minimizou o plano de fundo, mas diferentes limiares podem ser usados para garantir a análise da população de interesse. Uma vez que o limiar apropriado foi aplicado à imagem ( Figura 3E ), a porcentagem de cobertura do limiar pode ser medida ( Figura 3F ) e comparada para vários pacientes. Aqui, quantificamos 3 a 5 áreas dentro de cada região de interesse, dependendo da área total da região de interesse, e comparamos grupos usando testes t pareados com o software GraphPad Prism. Também comparamos nossas análises GBM com a coloração correspondente encontrada no tecido cerebral saudável no banco de dados Atlas Protein ( Figura 3F ). Na nossa Publicação prévia, utilizamos esta análise para múltiplos componentes microventivos (astrocitos, microglia, oligodendrócitos e vasos sanguíneos) em 33 pacientes para desenvolver um modelo de riscos proporcionais para prever a sobrevivência geral do paciente 11 .
Figura 1 : Comparação de Tumor Bulk e Tumor Adjacent Regions of Interest para Glial Cells.
A) Amostras de tumores inteiros do paciente 63 coradas com hematoxilina e eosina com regiões a granel e adjacentes indicadas. B) Hematoxilina e coloração com eosina, C) ALDH1L1 + astrócitos, D) Iba1 + microglia e E) Oligodendrócitos específicos Protein-1 (OSP1) + oligodendrócitos. Barra de escala = 100 μm. 25fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2 : Exemplo de titulação do anticorpo anti-ALDH1L1.
A) Controle negativo, B) diluição da recomendação do fabricante 1:70 do estoque, C) diluição 1: 200 do estoque e D) diluição 1: 400 do estoque. A diluição 1: 200 foi utilizada para coloração e análise devido à coloração positiva ótima do corpo celular e processos com minimização de fundo. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3 : análise e quantificação ImageJ da cobertura da área para Oligodendrócitos.
A) Original OSP1 + coloração do paciente 52. B) Remoção de núcleos roxos usando Threshold_Colour plugin. C) Conversão para 8 bits. D) Limite MaxEntropy capturado e E) aplicado para minimizar a coloração de fundo. F) Comparação de regiões adjacentes e em massa em cinco amostras de pacientes, bem como tecido cerebral saudável através do Atlas de Proteínas, para cobertura de cobertura de OSP1 +. *** p <0,001, **** p <0,0001 através de testes t pareados. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso método aqui proposto é uma abordagem quantitativa para analisar amostras histológicas coradas usando imunohistoquímica cromogênica tradicional. A metodologia atual para este tipo de análise inclui protocolos de coloração semelhantes, seguidos pela classificação por patologistas independentes. Este método tem sido confiável, no entanto, para uma série de aplicações, é necessária uma compreensão mais precisa da maquiagem celular, como melhor compreensão da heterogeneidade associada aos tumores e recapitulação precisa de tumores para estudos in vitro.
Este protocolo demonstra uma técnica direta para analisar quantitativamente as populações de células gliais no microambiente do tumor cerebral. Esta técnica é amplamente adaptável e pode ser expandida para identificar muitos outros componentes do microambiente, tais como vasos sanguíneos, quimiocinas e muito mais, bem como outros tipos de câncer, como peito ou pancreático, onde as ressecções tumorais podem terRegiões parenquimatosas maiores. Além disso, esta técnica pode ser adaptada para adquirir outras medidas, tais como contagens e perímetro de células para avaliar a forma das células, além de resultados de morfologia mais complexos, isotropia, agrupamento, orientação e muito mais. Essas técnicas também não se limitam ao câncer, na medida em que essas metodologias de coloração e quantificação podem ser usadas para análises cerebrais, como demonstrado em nossa quantificação representativa do tecido proteico de Protein Atlas e nossa comparação previamente publicada com o tecido cerebral epiléptico 11 .
Os passos críticos dentro deste protocolo incluem incubação adequada e desenvolvimento do secundário cromogênico. Deve-se ter cuidado para que o corante cromogênico não se desenvolva excessivamente. Isso dificulta a diferenciação entre coloração positiva e fundo. O tempo de desenvolvimento varia de acordo com o reagente do substrato utilizado e a afinidade do anticorpo primário. Usamos campo brilhanteMicroscópio para monitorar o desenvolvimento para assegurar a coloração ideal, minimizando a coloração do fundo. Após a coloração, o limiar adequado durante a análise pode ajudar a diferenciar o plano de fundo da coloração positiva. Uma limitação importante para este método é a incapacidade de manchar vários componentes dentro da mesma amostra de tecido devido ao uso de desenvolvimento de coloração cromogênica. A análise de imunofluorescência pode ser realizada de forma semelhante, mas requer modificação das ferramentas discutidas neste método.
Especificamente para o glioblastoma, há uma série de marcadores e manchas celulares que foram utilizados para analisar amostras de pacientes. Estes incluem IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 como marcadores prognósticos, bem como CD11b e CD45 para microglia e macrófagos 18 , 19 . Nosso método expande esse tipo de análisePara o microambiente celular, um componente frequentemente negligenciado do microambiente tumoral no glioblastoma. Estudos analisaram a presença e densidade de microglia nos tumores 20 , 21 , 22 , bem como contribuições de astrocitos 9 , 23 , 24 . Aqui, desenvolvemos um protocolo que examina todos os glia - astrocitos, microglia e oligodendrócitos - no microambiente do tumor cerebral e para diferenciar as regiões adjacentes ou invasivas do tumor da massa tumoral, onde os marcadores são geralmente identificados nesses tumores. Ao fazer isso, acreditamos que podemos avaliar com mais precisão a situação do paciente porque determinamos a heterogeneidade intra-paciente e nossa publicação anterior mostrou que a análise desses locais e a inclusão em modelos estatísticos é mais forte na previsão de resultados do que qualquer localização aloAmostras gerais ou não 11 . Além disso, uma vez que a invasão do glioblastoma é tão difusa, tornando difícil ressecar completamente 1 , 2 , acreditamos que o tecido nas regiões adjacentes é mais representativo do tecido invasivo deixado após a ressecção, o que contribui para uma recorrência inevitável. Por conseguinte, uma melhor compreensão das regiões adjacentes pode dar mais informações sobre a recorrência da doença e o planejamento do tratamento do paciente, em oposição ao tecido em massa tradicionalmente estudado que é ressecado antes da terapia em pacientes com glioblastoma.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Os autores agradecem os Drs. Fahad Bafakih e Jim Mandell para aquisição e identificação de amostras de pacientes, Garrett F. Beeghly para assistência com imuno-histoquímica e o Centro de Pesquisa de Biorepositórios e Tecidos, Centro de Pesquisa Cardiovascular Center Histology Core e o Centro de Análise Biomolecular da Universidade da Virgínia para assistência com Aquisição de amostras, imuno-histoquímica e imagens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
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