Summary
표피 각질 형성 세포 (epidermal keratinocytes)는 기능적인 피부 장벽을 형성하고 외부 환경 모욕에 대한 숙주 방어의 최전선에 위치하고 있습니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 표피 각질 형성 세포를 분리하고 1 차 배양하고 각질 세포에서 최종 분화 및 UVB 유발 염증 반응을 유도하는 방법을 설명합니다.
Abstract
keratinocyte (KC)는 피부의 가장 바깥 쪽 레이어 인 표피의 주된 세포 타입입니다. 표피 KCs는 UVB 조사 또는 병원체와 같은 환경 모욕에 대하여 온전한 피부 장벽을 형성하고 또한 그 모욕에 염증 반응을 개시해서 피부 방위를 제공에있는 긴요 한 역할을한다. 여기에서는 신생아 마우스 피부 및 성인 마우스 꼬리 피부에서 KC를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 cheleed 태아 소 혈청 (cFBS)에 비해 정의 성장 보조제 (dGS)를 사용하여 culturing 조건을 설명합니다. 기능적으로, 우리는 신생아 및 성인 KC 모두가 높은 칼슘 - 유도 된 말단 분화, 단단한 접합 형성 및 층화에 매우 반응한다는 것을 보여준다. 또한, 배양 된 성인 KC는 UVB에 의해 유발 된 세포 사멸에 민감하며 UVB 조사시 다량의 TNF를 방출 할 수 있습니다. 함께 여기에 설명 된 방법 은 체외 모델의 설정에 대한 연구자에게 유용 할 것입니다신생아 마우스 및 / 또는 성인 마우스에서 표피 생물학을 연구합니다.
Introduction
피부는 신체에서 가장 큰 기관이며 표피는 바깥쪽에 가장 많이 있습니다. 표피는 신체와 환경을 분리하기 위해 손상되지 않은 표피 장벽을 형성하는데 결정적인 역할을하므로 물 손실을 방지하고 알레르기 항원, 병원체 및 UVB 노출과 같은 환경 모욕으로부터 보호합니다. 표피는 미분화 된 기저 각질 세포 (KCs)의 단일 층에서부터 기저층, 가시 돌기 층, 과립층 및 각질층으로 구성된 다층 층상 상피로 발전한다. 표피 줄기 세포와 중계 증폭 세포로 구성된 기초 KC는 증식 성이 있고 미분화되어있다. 기초 KC가 세포주기를 빠져 나감에 따라, 세포는 분화를 결정하고 세포 - 세포 접합의 성숙과 표피 투과성 장벽 (epidermal permeability barrier, EPB)의 형성과 함께 표피 표면을 향해 서서히 이동한다. 가시 광선 층의 KC는 초기 별 차이를 표현합니다.케라틴 10 (K10)과 같은 이온 마커; KCs가 세분화 된 층으로 이동함에 따라 세포는 Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) 및 Involucrin (INV)과 같은 후기 분화 마커를 발현합니다. 각질층에서 KC는 말단 분화 된 각질 세포가되어 새로운 세포가 그들을 대체 할 때 결국 박리를 통해 흘러 나온다.
칼슘은 표피에서 가장 생리적 인 작용제로 간주 되며 in vitro 및 in vivo 에서 유사한 방식으로 분화 를 유발합니다. 정상 피부 표피에서는 칼슘 이온이 피부 표면을 향한 농도가 증가하는 특징적인 "농도 구배"를 형성합니다 1 , 2 , 3 . 칼슘 농도는 가장 낮은 층 (기저부 및 가시 돌기)의 낮은 수준에서 상부의 과립층의 첨단으로 상승한 다음 가장 표면적인 층 (각질층)에서는 무시할 수있는 수준으로 떨어집니다. 칼슘 구배는 성분 투과성 장벽의 출현과 동시에 발생하며 칼슘 신호 전달이 KC 분화의 중요한 역할을한다는 것을지지합니다. 시험 관내 에서 낮은 칼슘 (0.02-0.1 mM)은 단일 층으로서 기저부 KCs의 증식을 유지하지만, 높은 칼슘 (> 0.1 mM)은 단단 - 접합 형성 및 유도에 의해 입증 된 바와 같이 말단 분화에 대한 세포의 신속하고 돌이킬 수없는 공약을 유도한다 기초 칼슘 4 , 5 에 대한 높은 칼슘 처리시 LOR 및 INV
장벽 형성 외에도 표피 KC는 피부의 타고난 면역계의 중요한 구성 요소입니다. UVB 조사 또는 손상시 방출되는 병원균 또는 손상 관련 분자 패턴 (DAMP)에 대한 반응으로 KC는 TNFα, IL6 및 IFNβ와 같은 염증성 사이토 카인을 대량 생산하여 면역계 활성화를 유도합니다> 6 , 7 , 8 , 9 . 병원균 제거를 위해서는 KC로부터의 적절한 염증 신호가 필요하지만 통제되지 않은 염증 반응은 건선이나 주사와 같은자가 염증성 피부 질환의 발병을 유발할 수 있습니다 6 , 8 .
전반적으로, KC는 손상되지 않은 피부 장벽을 유지하고 병원균 침입 또는 환경 모욕시 면역 반응을 시작하는 데 중요한 역할을합니다. 그러므로 상피 세포의 일차 배양은 상피 생물학, KC 분화 및 KC 자극에 의한 타고난 면역 반응을 연구하는데 유용한 기술이다. 주요 마우스 표피 KC의 분리 및 배양은 KC의 다양한 자각 감수성 및 감수성으로 인해 어려운 과정이 될 수 있습니다. 여기에서 우리는 신생아 마우스 피부에서 KCs를 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다성인 마우스 꼬리 피부. 성인 KC 격리의 경우, 우리는 다음과 같은 이유로이 조직에서 생존 가능한 KC를 충분히 분리하기가 어려울 수 있으므로 마우스 등쪽 피부를 사용하지 않습니다. 첫째, 모발주기 (휴지기)의 휴지기에있는 성인의 지느러미 피부는 얇은 표피는 단지 1-2 층의 세포로 이루어지기 때문에 낮은 세포 수율과 표피와 진피의 비효율적 인 분리가 이루어 지는데, 이것은 성공적인 KC 격리를위한 중요한 단계입니다. 둘째로, 성인의 지느러미 피부에 존재하는 높은 모낭 밀도는 진피에서 표피를 분리하는 어려움에 더 기여합니다. 대신, 우리는 일상적으로 꼬리 피부를 성인 마우스 KCs의 공급원으로 사용합니다.이 상피는 표피 KC 3-5 층으로 두껍습니다. 또한 모낭의 밀도가 낮아 표피 분리를 방해하지 않으므로 마우스의 나이와 머리카락 순환 단계에 관계없이 성인 마우스 꼬리 피부와 KC 격리가 가능합니다. 고립 된 신비탈크 KC는 젤라틴 코팅 배양 접시에 뿌리는 반면, 콜라겐 코팅 배양 접시는 성숙한 세포가 신생아 대응 물과 비교할 때 손상된 능력 때문에 분리 된 성인 KC를 배양하는데 사용됩니다. 마우스 KC를 배양하기 위해 저칼슘 기저 배지에는 표피 성장 인자 (EGF), 소 트랜스페린, 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF1), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 소 혈청 알부민 (BSA) 및 하이드로 코르티손이 포함 된 dGS가 보충된다. 초기 도금 후 2-4 일 사이에 대부분의 분화 된 KC는 매일 중간 배양 중에 씻겨 나갈 수 있고 나머지 접착 세포는 전형적인 조약돌 형태 4를 나타내며 증식하고 초기 분화 마커 K10을 발현하지 않습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 UCSD 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 신생아 피부로부터의 일차 마우스 KC 분리 및 배양
- C57B / 6 wildtype 마우스의 출생 후의 0-2 신생아를 가위로 목을 베고 희생시킵니다. 손목과 발목 관절 바로 위의 팔다리를 잘라 낸 다음 작은 구멍을 남기고 꼬리를 완전히 잘라냅니다.
- 전체 피부를 벗기기 위해서는 먼저 날카로운 가위를 꼬리 부분의 구멍을 통해 삽입하고 몸의 등쪽 중간 선을 따라 피부를 목에있는 구멍으로 자릅니다. 다음으로, 한 포셉을 사용하여 노출 된 몸체와 다른 포셉을 잡고 피부를 잡아 당기고 몸 전체의 피부를 부드럽게 껍질을 벗기고 다리 운동을하면서 하나의 연속 동작으로 껍질을 벗깁니다.
- 손상되지 않은 부분으로 피부를 떼어 내고 피부를 부러지지 않도록주의하십시오. 그러면 디스펜스 단계에서 세포가 손실 될 수 있습니다.
<li> 10cm 페트리 접시에 멸균 PBS 15 ML로 벗겨 피부를 씻어 다음 KC 성장 매체에 4 MG / ML dispase를 포함 얼음 차가운 dispase 소화 버퍼로 가득 2 ML 튜브에 각 강아지의 피부를 놓으십시오 (KC 기초 배지는 0.06 mM의 CaCl2를, DGS, 및 항생제 / 항진균제를 갖는다). - 피부가 접히지 않도록주의하십시오. 접힌 부위가 dispase 용액에 충분히 노출되지 않습니다.
- 다음날 (12-18 시간 후) 디스 페아 제 용액과 함께 피부를 페트리 접시에 옮기십시오. 여분의 dispase 멀리 씻어 15 ML 멸균 PBS와 새로운 페트리 접시에 각 조직 조각을 전송하십시오.
- 포셉의 두 쌍을 사용하여, PBS에서 피부를 파악,피부를 들어 올리고 표피면을 아래로하고 진피면을 위로하여 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 조심 스레 피부 주름을 스트레치하여 페트리 접시에서 완전히 확장되도록하십시오.
- 새로운 페트리 접시에 각 피부에 대한 트립신 기반 소화 솔루션 500 μL를 놓으십시오. 겸자를 사용하여 천천히 표피를 아래로 들어 올리면서 표피를 들어 올리십시오. 진피를 생물학적 위험 물질로 폐기하십시오. 분리 된 표피를 옮기고 기본 층이 아래쪽에있는 트립신 용액의 각 방울에 부유시킨다.
- 표피가 트립신 솔루션에 접혀 있다면, 상피에서 기본 KCs의 효율적인 소화를 보장하기 위해 집게를 사용하여 모든 주름을 제거합니다.
- 20 분 동안 온화한 교반과 수평 쉐이크에 실온 (뚜껑을 덮은 상태로) 트립신 솔루션의 페트리 접시에 피부를 품어.
- 표피 당 보충 된 KC 성장 배지 2 mL를 첨가한다.표피)를 배양 접시에 첨가 하였다. 겸자를 사용하여 표피를 잡고 앞뒤로 활발히 표피를 문질러 표피 시트에서 단일 세포를 릴리스하십시오.
- 세포가 표피에서 분리되면 서서히 흐려지는 것을보십시오. 페트리 접시를 기울여 접시에 남아있는 표피 시트를 떠나는 새로운 튜브에 세포 현탁액을 수집하고 전송하십시오.
- 2 ML KC 성장 매체를 추가 한 후 표피 시트의 마찰을 두 번 더 반복하고 같은 튜브에 세포 suspensions를 결합.
- 적절한 혈청 피펫을 사용하여 세포 덩어리를 깰 수 있도록 세포 솔루션을 부드럽게 몇 번 피펫 쳐서 새로운 50 mL 원심 튜브에 100 μm 필터를 통과시킵니다.
- 180 X g에서 5 분 동안 여과 된 세포를 원심 분리하십시오.
- 뜨는에서 대기음과 부드럽게 1 ML 차가운 KC 성장 매체 / 표피에있는 세포 펠렛을 resuspend.
- hemocytometer로 세포를 센다.
- 세포 부착을 촉진 세포 외 매트릭스 (ECM) 제품으로 미리 코팅 문화 요리에 KC 성장 매체 5 X 10 4 / cm 2 의 밀도로 세포를 씨앗.
주 : 우리는 ()를 참조 물질의 표를 참조 젤라틴 계 도료는 상용 가능한 (예를 들어 부착 요소를 사용하여 세포를 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 배양기에서 배양하고, 새로운 배지이었다. 격일로 보충했다.- 코팅을 위해, 세포 시딩 이전에 10 분 내지 2 시간 동안 실온으로 가온 된 세포 부착 코팅 물질로 배양 접시를 코팅한다. 직전에 부착 요소를 제거하십시오.세포 현탁액을 추가.
- 초기 도금 후 매체를 변경하여 연결되지 않은 세포를 제거하고 세포가 실험 전에 원하는 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체를 교체하십시오.
참고 : 다중 피부 분리 물을 혼합하여 12 mL 디스펜스 용액이 들어있는 1 개의 15 mL 튜브 (튜브 당 최대 5 개의 스킨)에서 배양 할 수 있습니다. 회 전자에 4 ° C 냉장고에서 하룻밤 피부 튜브를 품어.
2. 성인 꼬리 가죽으로부터의 일차 마우스 KC 격리
- 동물 시설 규정에 따라 성인 C57BL / 6 마우스 (바람직하게는 6 ~ 15 주 사이, 남성 또는 여성)를 희생하십시오. 꼬리 받침에서 몸통의 꼬리를 잘라내어 꼬리 끝 부분에 가시 구멍이 생길 수 있도록 꼬리 끝의 ~ 2mm를 자릅니다.
- 꼬리 가죽을 벗겨 내려면 먼저 날카로운 날을 사용하여 꼬리 선단을 꼬리 끝 부분까지 자릅니다. 다음, 하나의 포셉을 사용하여 노출 된 꼬리뼈와 다른 포셉을 잡아서 피부를 잡아 당기고 꼬리뼈를 부드럽게 하나의 연속 동작으로 껍질에서 벗겨냅니다. 껍질을 벗긴 피부를 밋밋 라인에서 잘라내어 각 조각의 길이가 2-3cm 미만이되도록하십시오.
- 껍질을 벗긴 피부를 헹구십시오.10cm 페트리 접시에 멸균 PBS 15 ML의 다음 얼음 차가운 dispase 소화 버퍼 (KC 성장 매체에 4 MG / ML dispase) 가득한 2 ML 튜브에 각 꼬리에서 피부를 놓으십시오.
참고 : 여러 개의 피부 조각을 결합하여 12 mL의 디스 페스 용액이 들어있는 1 개의 15 mL 튜브 (튜브 당 최대 5 개의 꼬리)에 배양 할 수 있습니다.- 회 전자에 4 ° C 냉장고에서 하룻밤 피부 튜브를 품어.
- 꼬리 표피에서 단일 세포 현탁액을 분리하기 위해 1.4에서 1.13 단계를 수행하십시오.
- 콜라겐으로 사전 코팅 문화 요리에 KC 성장 매체에서 10 x 10 4 / cm 2 (hematocytometer로 계산)의 밀도로 성인 세포를 씨앗.
참고 : 우리는 시판되는 콜라겐 기반 코팅 키트를 사용합니다 (자세한 내용은 표 참조). 세포를 5 % CO 2 , 37 ℃의 가습 된 배양기에서 배양하고, 매일 새로운 배지를 보충 하였다. 일반적으로 c궁극적 인 요리는 세포 파종 전에 30 분 ~ 1 시간 동안 콜라겐으로 코팅해야합니다. 우리는 젤라틴 기반의 코팅 물질 인 부착 인자와 비교하여 콜라겐으로 코팅 된 경우 요리에 성인 KC 부착이 유의하게 증가한다는 것을 관찰했다. - 초기 도금 후 매체를 변경하여 연결되지 않은 세포를 제거하고 세포가 실험 전에 원하는 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체를 교체하십시오.
3. 고 칼슘에 의한 KCs의 체외 분화
- 말단 분화를 유도하기 위해, 배지에 0.2 mM의 CaCl2를 추가.
- 또는 높은 칼슘을 첨가하기 전에 저칼슘 KC 기저 배지에서 성장 보조제없이 일일 배양 된 KC를 굶기십시오.
참고 : 성장 인자 기아는 초기 분화 및 K10 5 와 같은 조기 분화 마커의 유도에 대한 세포 투입을 향상시킬 것입니다
4. UVB 조사에 의한 KC로부터의 세포 사멸 및 TNFα 방출
- 세포가 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체 변화와 KC 성장 매체 (37 % C 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서)에서 마우스 KCs를 문화. UVB 조사 직전, 성장 매체를 제거하고 PBS 500 μL로 교체하십시오. 그런 다음 세포를 25 mJ / cm 2 UVB 또는 모의 컨트롤 (UVB 없음)으로 처 리하십시오.
주 : UVB 조사는 이전 10 바와 같이 8 개의 W 전구 (312 ㎚)와 휴대용 UVB 램프를 사용하여 수행된다. UVB 조사 후 PBS를 흡인하고 새로운 배지를 첨가한다. - 측정 및 6, 8의 CCK-8 세포 생존 분석으로 세포 생존율을 정량화하고, 제조자의 지시 11 다음 24 시간 후 UVB 치료.
- 원하는 시점에서 UVB로 치료 KCs에서 조건 미디어를 수집하고 TNFα 릴리스를 측정제조사의 지시에 따라 마우스 TNF (Mono / Mono) ELISA kit에 의한 조건 매질에서 7 , 12 .
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Representative Results
신생아 및 성인의 KCs의 높은 칼슘 유도 된 말단 분화. 관세청 도금 및 0.06 mM의 CaCl2를 유지 일차 마우스 상피 세포는 단층으로 성장하고, 각 셀은 조약돌 모양을 나타내는, 구별 간 공간 다각형했을 때 합류 (도 1a 및도 2a). CaCl2를 행 0.2mM의 승강은 세포의 급격한 형태 변화를 유도. 높은 칼슘 스위치 후 8 시간 이내에 세포가 평평 해지고 뚜렷한 세포 간 공간이 덜 명확 해졌으며 24 시간이 지나면 단단한 접합점을 가진 세포 - 세포 접착이 분명 해졌다 ( 그림 1A 및 그림 2B ). 각질화 된 세포 외피의 형성과 수직 세포 층상 화는 고 칼슘 스위치 후 약 48-72 h에서 시작되었다 ( 그림 2B). 높은 칼슘 스위치 중 액틴 리모델링 및 세포 간 긴밀한 접합 형성을 분석 관세청 0.2 mM의 CaCl2를 처리는 KC 분화 13 일 동안 액틴 리모델링을 측정 팔로이 딘 (도 1B)으로 염색 하였다. 인접한 세포들 사이의 액틴 섬유가 풍부한 유 사형 돌기의 형성은 칼슘 전환 3 시간 후 조기 발견되었고 액틴 섬유 리모델링은 6-24 시간 사이에 더 진행되었고 48 시간에 세포 층화가 두드러졌다 ( 그림 1B ).
UVB 유발 성 세포 사멸 및 TNFα 방출에 대한 마우스 KCs의 감수성 . 배양 성인 마우스 관세청은 25 mJ의 / ㎠ UVB 조사에 노출시키고, 배양 배지에서 방출 된 세포 생존 및 TNFα를 분석 하였다. 위상차 영상 ( Figure 3A)뿐만 아니라 세포 생존능 분석 ( 그림 3B )에서 UVB는 KC의 시간 의존적 인 사망을 촉발시켰다. 24 시간까지, 대다수의 세포는 둥글게되고 접시로부터 분리되었다 ( 도 3A ). 세포 생존능 분석에 의해 정량화됨에 따라, UVB 처리 24 시간 이내에 세포의 ~ 90 %가 죽었다 ( 도 3B ; 일원 분산 분석 다중 비교 시험에 의해 계산 된 바와 같이 p <0.001). 마지막으로, 우리는 UVB에 의해 유도되고 UVB 조사 14에 따라 KC 세포 사멸을 유도하는 중요한 사이토 카인 인 TNFα가 배양 배지에서 풍부하게 분비되었다 (UVB 조사 24 시간 후 ~ 250 pg / mL; p <0.001) 시간 의존 방식으로 UVB 처리 된 KCs를 처리 하였다 ( 도 3C ).
그림 1 : 신생아 마우스 KCs의 주요 문화, 그리고 높은 칼슘 유도 터미널 분화 및 단단한 세포 - 셀 접합 형성. ( A ). 일차 신생아 마우스 KCs는 높은 칼슘 (0.2 MM CaCl 2 )로 치료하였고, 4X 배율의 위상차 영상을 0 시간 (ctrl) 및 치료 8 시간 후 촬영 하였다. 스케일 바 = 100 μm. ( B ). 신생아 관세청은 0.2mM의 염화칼슘 (2)의 존재하에 분화시키고, 세포 분화 중에 인접 셀 사이 액틴 섬유 풍부한 filopodial 돌기의 형성을 시각화 팔로이 딘 (적색)으로 염색 하였다. 핵은 DAPI로 대조 염색되었으며, 액틴 섬유는 rhodamine phalloidin으로 염색되었다. 스케일 바 = 25 μm. DAPI 채널 (핵 염색의 경우)과 RFP 채널 (액틴 염색의 경우)에 설정된 형광 현미경을 사용하여 20X 배율로 이미지를 촬영했습니다. lank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 일차 배양과 고 칼슘은 성숙 마우스 KC의 터미널 분화를 유도했습니다. ( A ). 초기 도금 후 8 시간, 1 일, 2 일 및 3 일에 1 차 성숙 마우스 KCs를 10 배 확대 한 위상 대비 영상. 상부 패널은 dGS에서 성장한 세포를 나타내고 하부 패널은 8 ng / mL 재조합 마우스 EGF를 갖는 10 % chelexed FBS (cFBS)에서 성장한 세포를 나타낸다. 스케일 바 = 100 μm. ( B ). Confluent adult mouse KCs는 0.2 mM CaCl 2 존재 하에서 분화되었고, 10X 배율에서의 위상차 영상은 고 칼슘 전환 후 0, 10, 8, 24, 48, 72 시간에 측정되었다. 스케일 바 = 100 μm.nk ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 성체 마우스 KC의 일차 배양 및 UVB로 유도 된 세포 사멸 및 TNFα 방출에 대한 성숙한 KCs의 감수성. 1 차 성숙한 마우스 KCs는 confluency로 배양되었고, 25 mJ / cm 2 UVB 조사에 노출되었다. ( A ) UVB 노출 후 12 시간과 24 시간에 촬영 한 10X 배율의 위상차 영상은 시간 의존적 인 UVB 유발 세포사를 보였다. 스케일 바 = 100 μm. ( B ) 세포 생존 능력은 UVB 치료 후 6, 8 및 24 시간에 CCK-8 세포 생존능 분석에 의해 정량화되었다. ( C ) 지시 된 시점에서 UVB- 유도 된 TNFα의 배지로의 방출을 ELISA로 측정 하였다. 모든 오차 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다. p- 값은 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 다중 비교에 의해 계산되었다test (***, p <0.001) 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
피부 표피는 몸을 외부 환경으로부터 분리 및 보호하고 수분 손실, 병원체, 열 및 자외선 조사로 인한 손상을 방지하는 중요한 장벽으로 작용합니다. KC는 표피의 주된 세포 계통이며 표피 KC의 일차 배양은 장벽 형성의 생물학적 과정과 in vitro에서의 환경 모욕 에 대한 KCs의 반응을 연구하고 이해하는 데 유용한 도구입니다.
여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 일차 표피 KC를 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 일차 마우스 KC는 신생아 마우스 피부에서 편리하게 분리 될 수 있지만, 성숙한 KC의 격리 및 성공적인 배양은 표피의 얇아짐 및 성인 마우스 등쪽 피부의 높은 모근 밀도로 인해 어렵다고 간주됩니다. 여기에 설명 된 방법은 기본 KC의 편리하고 풍부한 출처로 성인 마우스 꼬리 피부를 사용합니다. 두꺼운 표피 및 낮은 것의 존재 때문에 꼬리 피부의 모낭 밀도가 낮아지면 표피를 진피에서 분리하여 KC를 분리하는 중요한 단계는 하룻밤 동안 꼬리 피부를 소화시킨 후에 가능합니다. 대조적으로,이 프로토콜을 사용하여 성인 지느러미 피부에서 KCs를 분리하려는 우리의 시도는 성공하지 못했고, 격리 후 세포 수율이 낮아지고 도금 후 세포 부착이 낮아졌습니다. 그러나, 성인 등의 피부에서 관세청의 성공적인 고립과 문화는 혼자 디스 파제는 성인 지느러미 피부의 진피에서 난포 관세청를 추출하기에 충분하지 않을 수 있습니다 제안, 털없는 피부 (15)의 하룻밤 트립신 소화 한 후보고 된 바있다.
이 프로토콜에서 기본 KCs는 칼슘이 고갈 된 chelexed-FBS 대신 dGS가 보충 된 저 칼슘 배지에서 재배되었는데, 이는 이전에 발표 된 마우스 KC 배양 프로토콜 4 , 15 , "> (16), 본 연구에서는, 우리는 DGS 문화 성인 마우스 관세청에 FBS를 chelexed하고 KC의 기저 세포 형태 (그림 2A)을 유지하기 위해 한 단계 높은 것을 관찰 18. 17. 그러나, 그것은 가능성이 그 chelexed-FBS의 효과 KC의 기저 형태를 유지하는 것은 각 연구에 사용 된 FBS 로트에 달려있을 수 있습니다.
여기에 제시된 방법을 사용하여, 우리는 신생아 및 성인 마우스 표피 KC 모두가 높은 칼슘에 의한 말단 분화, 단단한 세포 접합 형성 및 층화에 반응한다는 것을 입증했다 ( 도 1 및 도 2 ). 일반적으로, 세포 외 칼슘 수준을 0.1 mM 이상으로 높이는 것은 기저부의 KC 4 , 5 , 17 ,ass = "xref"> 19. 중간 수준의 칼슘 (0.1 ~ 0.16 mM)이 칼슘 전환시 처음 24 시간 동안 K1 및 K10과 같은 초기 분화 마커의 발현을 실질적으로 유도하는 것으로보고되었지만 K1 및 K10은 작은 높은 칼슘 배지 (1 mM)로 처리했을 때의 세포 분율 19 , 20 . 그러나,보다 높은 칼슘 배지 (≥ 1 mM)는 KC 계층화와 INV 및 LOR 4 , 21 , 22 , 23 과 같은 후기 분화 유전자의 발현을 빠르고 강력하게 유도하기 위해 다른 많은 연구에서 널리 사용되어왔다. (MM ≥1) 높은 칼슘 농도가 급격히 KC TE의 발병을 가속화 반면 예컨대 0.2 mM의 CaCl2를 경험 같은 칼슘의 중간 레벨에 기초하여, 단말기의 점진적 분화 느린 발병을 초래분화 과정에서 세포 변화를 연구하는 데 더 짧은 시간 창으로 이어진다. 따라서 KC 단말 분화를 유도하기 위하여 0.2 mM의 CaCl2를 사용하고, 우리는 중간 칼슘 수준 칼슘 스위치 (도 2B) 후 72 시간 이내에 성층 각질 세포 형태로 기저 세포 형태의 점진적인 변화를 이끄는 것으로 나타났다.
우리 그룹은 표피성 KC가 손상 및 / 또는 UVB- 조사 6 , 7 , 8 , 9 , 10 동안 방출 된 병원균 또는 DAMP에 대한 염증 반응을 개시하는 데 중요한 역할을한다는 것을 이전에 입증했다. 생체 내 관찰 결과와 일치하여, 여기에서 우리는 배양 된 성숙한 마우스 KC가 UVB- 유발 된 세포 사멸에 매우 민감하고 UVB- 처리 된 KC가 큰면역계를 활성화시키는 주요 염증성 사이토킨 인 TNFα의 양.
요약하면, 1 차 마우스 표피 KC 세포 배양은 표피 장벽 형성 및 KCs의 타고난 면역 반응을 연구하는데 유용한 시험 관내 모델을 제공하며, 여기에 기술 된 방법은 신생아 마우스의 피부 생물학 연구를 추구하는 연구자들에게 흥미가있을 것이다. 성인 마우스에서와 마찬가지로.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 내과학 연구소 (R01AR069653 to Zhang LJ)와 국립 보건원 (National Institute of Health Support) (5T32AR062496-03 to CA)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
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