Summary
Epidermal keratinocytter danner en funktionel hudbarriere og er placeret på forsiden af værtsforsvaret mod eksterne miljøbelastninger. Her beskriver vi metoder til isolering og primærkultur af epidermale keratinocytter fra neonatal og voksen museskind og induktion af terminal differentiering og UVB-udløst inflammatorisk respons fra keratinocytter.
Abstract
Keratinocyten (KC) er den overvejende celletype i epidermis, det yderste lag af huden. Epidermal KC'er spiller en afgørende rolle for at yde hudforsvar ved at danne en intakt hudbarriere mod miljøbelastninger, såsom UVB-bestråling eller patogener, og også ved at starte en inflammatorisk reaktion på disse fornærmelser. Her beskriver vi metoder til at isolere KC'er fra neonatal museskind og fra voksen musestikhud. Vi beskriver også dyrkningsbetingelser ved anvendelse af definerede væksttilskud (dGS) i sammenligning med chelexed føtalt bovint serum (cFBS). Funktionelt viser vi, at både neonatale og voksne KC'er er yderst lydhøre over for høj calciuminduseret terminal differentiering, tæt krydsdannelse og stratificering. Derudover er kultiverede voksne KC'er modtagelige for UVB-udløst celledød og kan frigive store mængder TNF ved UVB-bestråling. Sammen vil de her beskrevne metoder være nyttige for forskere til opsætningen af in vitro- modellerS at studere epidermisk biologi i neonatalmusen og / eller den voksne mus.
Introduction
Huden er det største organ i kroppen med epidermis som det yderste lag. Den epidermis spiller en afgørende rolle for at danne en intakt epidermal barriere for at adskille kroppen fra miljøet og forhindrer dermed vandtab og giver beskyttelse mod miljøbelastninger, såsom allergener, patogener og UVB-eksponering. Epidermis udvikler sig fra et enkelt lag af udifferentierede basale keratinocytter (KC'er) ind i et flerskiktsstratificeret epitel, der består af et basal lag efterfulgt af et spinous lag, granulært lag og stratum corneum. Basal KC'er, der består af både epidermale stamceller og transiteringsforstærkende celler, er proliferative og udifferentierede. Når basale KC'er forlader cellecyklussen, forpligter cellerne sig til differentiering og gradvist migrere mod overfladen af epidermis, ledsaget af modning af cellecelleforbindelser og dannelse af en epidermal permeabilitetsbarriere (EPB). KC'erne ved spinouslaget udtrykker tidligt differentierIonmarkører såsom Keratin 10 (K10); Når KC'erne migrerer til det granulære lag, udtrykker cellerne sen differentieringsmarkører såsom Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) og Involucrin (INV). Ved stratum corneum bliver KC'erne terminalt differentierede corneocytter, som til sidst udvises ved desquamation, idet nye celler erstatter dem.
Calcium betragtes som det mest fysiologiske middel i epidermis og udløser differentiering in vitro og in vivo på en lignende måde. I normale hudepidermier danner calciumioner en karakteristisk "koncentrationsgradient", der stiger i koncentration mod hudoverfladen 1 , 2 , 3 . Kalciumkoncentrationen stiger fra lave niveauer i de laveste underlag (basale og spinøse lag) til en top i det øvre granulære lag og derefter falder til ubetydelige niveauer i det mest overfladiske lag (stratum corneum). Kalciumgradienten udvikler sig også tilfældigt med fremkomsten af en komponentpermeabilitetsbarriere, hvilket understøtter, at calciumsignaler spiller en kritisk rolle for KC-differentiering. In vitro opretholder lavt calcium (0,02-0,1 mM) proliferationen af basale KC'er som et monolag, hvorimod højt calcium (> 0,1 mM) inducerer en hurtig og irreversibel forpligtelse af cellerne til terminal differentiering som demonstreret ved tæt krydsningsdannelse og induktion Af LOR og INV på høj calciumbehandling til de basale KCs 4 , 5 .
Ud over barrieredannelse er epidermale KC'er også en vigtig bestanddel af hudens medfødte immunsystem. Som reaktion på patogener eller beskadigede associerede molekylære mønstre (DAMP'er), der frigives ved UVB-bestråling eller -skade, kan KC'er producere store mængder inflammatoriske cytokiner, såsom TNFa, IL6 og IFNβ, hvilket fører til immunsystemaktivering> 6 , 7 , 8 , 9 . Selvom der kræves korrekt inflammatorisk signalering fra KC'er til patogen clearance, kan ukontrolleret inflammatorisk respons udløse udviklingen af autoinflammatoriske hudsygdomme, såsom psoriasis og rosacea 6 , 8 .
Samlet set spiller KC'er en afgørende rolle for at opretholde den intakte hudbarriere og initierer et immunrespons ved patogeninvasion eller miljøbelastninger. Derfor er primærkultur af epidermale KC'er en nyttig teknik til at studere epitelbiologi, KC-differentiering, såvel som KC-stimulerede medfødte immunresponser. Isolering og kultur af primære musepidermuskulære KC'er kan være en udfordrende proces på grund af KCs modtagelighed og følsomhed over for forskellige eksterne stimulanter. Her beskriver vi en metode til at isolere og dyrke KC'er fra enten neonatal museskind ellerVoksen mus hale hud. Til voksen KC-isolering bruger vi ikke musens dorsale hud, fordi isolering af tilstrækkelige mængder levedygtige KC'er fra dette væv kan være svært af følgende grunde: Først består den voksne dorsale hud i hvilepasen af hårcyklusen (telogen) af en Tynde epidermier med kun 1-2 lag celler, hvilket fører til lav celleudbytte og ineffektiv adskillelse af epidermis fra dermis, hvilket er det kritiske trin for succesfuld KC-isolering. For det andet bidrager den høje hårfollikeldensitet, som er til stede på voksen dorsal hud, yderligere til vanskeligheden ved at adskille epidermier fra dermis. I stedet bruger vi rutinemæssigt halehud som kilde til voksne mus-KC'er, da dette epitel er tykkere med 3-5 lag epidermal KCs. Det har også en lavere hårfollikeltæthed, som ikke forstyrrer epidermiseparationen, hvilket tillader KC-isolering fra en hvilken som helst voksen musestikhud uanset musens alder og hårcyklusstadium. Den isolerede neonaTal KC'er er podet til gelatinebelagte kulturskåle, hvorimod kollagenbelagte skåle anvendes til at frø isolerede voksne KC'er på grund af den svækkede evne hos de voksne celler til at klæbe i forhold til deres neonatale modparter. Til dyrkning af mus-KC'er suppleres lavt calciumbasalt medium med dGS, som indeholder epidermal vækstfaktor (EGF), bovint transferrin, insulinlignende vækstfaktor1 (IGF1), prostaglandin E2 (PGE2), bovint serumalbumin (BSA) og hydrocortison. Mellem 2-4 dage efter den oprindelige plettering kan de fleste af de differentierede KC'er vaskes væk under daglige mediumændringer, og de resterende vedhæftende celler viser typisk brostenmorfologi 4 , prolifererer og udtrykker ikke den tidlige differentieringsmarkør K10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg er godkendt af UCSD Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Primær mus KC-isolering og kultur fra neonatal hud
- Opfylde postnatale dag 0-2 nyfødte fra C57B / 6 vildtype musestammen ved afkapning ved anvendelse af saks. Afskær lemmerne lige over håndled og ankelledder, og afskær derefter halen helt og efterlader et lille hul.
- For at fjerne hele huden skal du først indsætte en skarp saks gennem hulet ved halen og skære huden langs kroppens dorsale midterlinie til åbningen på nakken. Brug derefter en tang til at tage fat på den eksponerede krop og de andre tænger til at forstå huden og forsigtigt skræl hele huden ud af kroppen og over benstubene med en kontinuerlig bevægelse.
- Afskal huden som et intakt stykke og pas på, at du ikke brækker huden i stykker, da dette vil resultere i celletab under dispaseringstrinnet.
<Li> Skyll den skrællede hud med 15 ml sterilt PBS i en 10 cm petriskål, og læg derefter huden fra hver hvalp i et 2 ml rør fyldt med iskold dispenseringsfordøjelsesbuffer, som indeholder 4 mg / ml dispas i KC vækstmedium (KC basalmedium har 0,06 mM CaCl2, DGS og antibiotika / antimykotika). - Sørg for, at huden ikke er foldet i røret, da dette vil resultere i utilstrækkelig eksponering af det foldede område til dispasopløsningen.
- På den næste dag (efter 12-18 timer i dispase) overfør huden sammen med dispasopløsningen til en petriskål. Overfør hvert vævsstykke til en ny Petri-skål med 15 mL sterilt PBS for at vaske overskydende dispensation væk.
- Brug to par tænger, tag fat i huden fra PBS,Løft huden og overfør til en ny petriskål med den epidermale side ned og dermisiden opad. Stræk hudfolderne forsigtigt, så den er helt udstrakt på petriskålen.
- Placer 500 μL af en trypsinbaseret fordøjelsesopløsning for hver hud i en ny Petri-skål. Ved hjælp af tang, løft langsomt dermis op og væk fra epidermis, mens du holder epidermis nede. Bortskaf dermis som biologisk skadeligt materiale. Overfør den adskilte epidermis og flyd på hver dråbe trypsinopløsning med basallaget nedad.
- Hvis epidermis foldes på trypsinopløsningen, fjern eventuelle folder med tang for at sikre effektiv fordøjelse af basale KC'er fra epitelet.
- Inkuber huden på en petriskål i trypsinopløsning ved stuetemperatur (med låget dækket) på en vandret ryster med forsigtig omrøring i 20 minutter.
- Tilsæt 2 ml suppleret KC vækstmedium pr. Epidermis (ca. 1 cm i størrelse prEpidermis) til petriskålen. Tag fat i epidermierne ved hjælp af tang og kraftigt gnid epidermis frem og tilbage for at frigive enkeltceller fra det epidermale ark.
- Se mediet bliver mere uklart, da cellerne løsnes fra epidermis. Tilt Petri-skålen for at samle og overføre cellesuspensionen til et nyt rør, der efterlader det resterende epidermale ark på fadet.
- Gentag to gange mere gnidningen af det epidermale ark efter tilsætning af 2 ml KC vækstmedium og kombinere cellesuspensionerne i det samme rør.
- Pipet celleopløsningen op og ned forsigtigt et par gange for at bryde nogen celleklumper ved hjælp af den passende serologiske pipette, og send det gennem et 100 μm filter til et nyt 50 ml centrifugerør.
- Centrifuger de filtrerede celler i 5 minutter ved 180 x g.
- Aspirer af supernatanten og forsigtigt resuspender cellepellet i 1 ml koldt KC vækstmedium / epidermis.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
- Pode cellerne i en tæthed på 5 x 10 4 / cm2 i KC vækstmedium i dyrkningsskåle pre-belagt med en ekstracellulær matrix (ECM) produkt som fremmer cellevedhæftning.
BEMÆRK: Vi bruger en kommerciel tilgængelig (fx vedhæftningsfaktor, som er et gelatinebaseret belægningsmateriale (se Materialebordet for detaljer). Celler blev dyrket i befugtet inkubator med 5% CO 2 ved 37 ° C og frisk medium blev Genopfyldes hver anden dag.- Til belægning belægge kulturskålene med cellefastgørelsesbelægningsmaterialet opvarmet til stuetemperatur i 10 minutter til 2 timer forud for cellesædningen. Fjern vedhæftningsfaktoren lige førTilsætning af celle suspensionen.
- Skift mediet 24 timer efter den indledende belægning for at fjerne ubindede celler og ændre mediet dagligt, indtil cellerne når den ønskede konfluens før eksperimentet.
BEMÆRK: Flere hudisolater kan kombineres og inkuberes i et 15 ml rør (op til 5 skind pr. Rør) indeholdende 12 ml dispasopløsning. Inkubér hudrøret natten over i et 4 ° C køleskab på en rotator.
2. Primær mus KC-isolering fra voksenhalehud
- Opdrage en voksen C57BL / 6-mus (helst mellem 6-15 uger, hverken mand eller kvinde) i henhold til dyreanlægsreglerne. Afskær halen ud af kroppen fra halen, og afskærer ~ 2 mm af halepinden, så der er et synligt hul på spidsen.
- For at skræl halen af huden skal du først bruge et skarpt blad til at skære langs halehuden fra bunden til halepinden. Brug derefter en tang til at tage fat på den udsatte haleben og de andre tænger for at få fat i huden, og skyll forsigtigt halen fra benet med en kontinuerlig bevægelse. Skær den skrællede hud fra midterlinjen, så hver del er mindre end 2-3 cm lang.
- Skyl den skrællede hud hvidH 15 ml sterilt PBS i en 10 cm petriskål, og læg derefter huden fra hver hale ind i et 2 ml rør fyldt med iskold dispenseringsfordøjelsesbuffer (4 mg / ml dispas i KC vækstmedium).
BEMÆRK: Flere hudstykker kan også kombineres og inkuberes i et 15 ml rør (op til 5 haler pr. Rør) indeholdende 12 ml dispasopløsning.- Inkubér hudrøret natten over i et 4 ° C køleskab på en rotator.
- Udfør trin 1.4 til 1.13 for at isolere enkeltcellesuspensionen fra haleepidermierne.
- Pode voksne celler med en densitet på 10 x 10 4 / cm2 (tælles af en hæmatocyto) i KC vækstmedium i dyrkningsskåle præ-coatet med collagen.
BEMÆRK: Vi bruger et kommercielt tilgængeligt kollagenbaseret belægningssæt (se Materialebladet for detaljer). Celler blev dyrket i fugtig inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C, og frisk medium blev genopfyldes hver anden dag. Generelt er cUlture retter skal være coatet med kollagen i 30 minutter til 1 time forud for cellesedningen. Vi bemærker, at der er en signifikant forbedring af voksen KC-fastgørelse til opskålen, når den er coatet med collagen sammenlignet med fastgørelsesfaktoren, hvilket er et gelatinebaseret overtrækningsmateriale. - Skift mediet 24 timer efter den indledende belægning for at fjerne ubindede celler og ændre mediet dagligt, indtil cellerne når den ønskede konfluens før eksperimentet.
3. In vitro Differentiering af KC'er med højt calcium
- For at inducere terminal differentiering, tilføje CaCI2 0,2 mM i dyrkningsmediet.
- Alternativt sulter de dyrkede KC'er natten over uden tilsatte væksttilskud i lavt calcium-KC basalt medium før tilsætning af højt calcium.
BEMÆRK: Vækstfaktor sult vil øge celleforpligtelsen til tidlig differentiering og induktionen af tidlige differentieringsmarkører, såsom K10 5
4. UVB-bestrålingsmedieret celledød og TNFa-frigivelse fra KC'er
- Kultur musen KC'er i KC vækstmedium (i befugtet inkubator med 5% CO 2 ved 37 ° C) med daglig mediumændring, indtil cellerne når sammenflydelse. Umiddelbart inden UVB-bestrålingen fjerner vækstmediet og erstattes med 500 μl PBS. Derefter udsættes cellerne for 25 mJ / cm 2 UVB eller mock control (ingen UVB).
BEMÆRK: UVB bestråling udføres ved brug af håndholdte UVB lamper med to 8 W pærer (312 nm) som tidligere beskrevet 10 . Efter UVB-bestråling suges PBS og frisk medium tilsættes. - Mål og kvantificer cellelevedygtigheden ved CCK-8-cellelevedygtighedsassayet ved 6, 8 og 24 timer efter UVB-behandling efter producentens anvisninger 11 .
- Saml det konditionerede medium fra KC'erne behandlet med UVB ved ønskede tidspunkter og måle den frigivne TNFaI det konditionerede medium ved hjælp af Mouse TNF (Mono / Mono) ELISA kit efter producentens anvisninger 7 , 12 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Højkalciuminduceret terminal differentiering af neonatale og voksne KC'er. Den primære muse epidermale KCS udpladet og opretholdt ved 0,06 mM CaCl2 voksede som et monolag, og individuelle celler havde en polygonal form med tydelig intercellulære rum, der viser en brosten udseende, når sammenflydende (figur 1A og figur 2A). Omring CaCI2 0,2 mM inducerede en hurtig morfologi ændring af cellerne. Inden for 8 timer efter den høje kalciumkontakt blev cellerne fladt, og det adskilte intercellulære rum blev mindre tydeligt, og ved 24 timer blev cellecelleadhæsionen med stramme krydsninger oplagt ( figur 1A og figur 2B ). Dannelsen af den cornified cellehylster og lodret cellestratifikation startede omkring 48-72 timer efter den høje calciumomskifter ( figur 2B). At analysere actin remodellering og celle-celle-tight junction dannelse under den højt calcium switch, KCS behandlet med 0,2 mM CaCl2 blev farvet med phalloidin (figur 1B) til måling af actin remodellering under KC differentiering 13. Dannelsen af de aktinfiberrige filopodiale fremspring mellem de tilstødende celler blev detekteret så tidligt som 3 timer efter kalciumomskifteren, og actinfiberreformeringen fortsatte yderligere mellem 6-24 timer og ved 48 timer blev cellestratifikationen fremtrædende ( figur 1B ).
Følsomhed af mus-KC'er til UVB-udløst celledød og TNFa-frigivelse . De dyrkede voksne mus KCS blev eksponeret for 25 mJ / cm2 UVB-bestråling, og cellelevedygtigheden og TNFa frigives i dyrkningsmediet blev analyseret. Som vist af fasekontrastbillederne ( figRe 3A) såvel som cellelevedygtighedsassayet ( figur 3B ) udløste UVB en tidsafhængig død af KC'erne. Efter 24 timer blev størstedelen af cellerne afrundet og blev afskåret fra parabolen ( figur 3A ). Som kvantificeret ved cellelevedygtighedsassayet, var 90% af cellerne døde inden for 24 timer efter UVB-behandling ( Figur 3B ; p <0,001 som beregnet ved envejs ANOVA multiple sammenligningstest). Endelig viste vi, at TNFa, et vigtigt cytokin, der induceres af UVB og driver KC-apoptose efter UVB-bestråling 14 , blev rigeligt udskilt (~ 250 pg / ml inden for 24 timer efter UVB-bestråling, p <0,001) i dyrkningsmediet af UVB-behandlede KC'er på en tidsafhængig måde ( figur 3C ).
Figur 1: Primær kultur af neonatale mus-KC'er og højkalciuminduceret terminaldifferentiering og stram cellecelleforbindelsesdannelse. ( A ). Primære neonatale mus KCS blev behandlet med højt calcium (0,2 mM CaCl2), og fasekontrast billeder på 4X forstørrelse blev taget ved 0 time (ctrl) og ved 8 timer efter behandling. Skalestang = 100 μm. ( B ). Neonatale KCS blev differentieret i nærvær af 0,2 mM CaCl2, og cellerne blev farvet med phalloidin (rød) til at visualisere dannelsen af actin fiberrige filopodial fremspring mellem de tilstødende celler under differentiering. Nuclei blev modstregnet med DAPI, og actinfibre blev farvet med rhodaminphalloidin. Skalbjælke = 25 μm. Billeder blev taget ved 20X forstørrelse ved anvendelse af et fluorescensmikroskop sat til DAPI-kanalen (for kernefarvning) og RFP-kanal (til aktinfarvning). Lank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Primær kultur og højkalciuminduceret terminaldifferentiering af voksne mus-KC'er. ( A ). Fasekontrastbilleder ved 10x forstørrelse af primære voksne mus-KC'er på 8 timer, 1 dag, 2 dage og 3 dage efter den oprindelige plettering. Det øverste panel repræsenterer celler dyrket i dGS, og det nedre panel repræsenterer celler dyrket i 10% chelexed FBS (cFBS) med 8 ng / ml rekombinant mus EGF. Målestang = 100 μm. ( B ). Sammenflydende voksne mus KCS blev differentieret i nærvær af 0,2 mM CaCl2 og fasekontrast billeder ved 10X forstørrelse blev taget ved 0 (ctrl), 8, 24, 48 og 72 timer efter højt calcium switch. Målestang = 100 μm.Nk "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Primær kultur af voksne mus-KC'er og susceptibilitet af voksne KC'er til UVB-induceret celledød og frigivelse af TNFa. Primære voksne mus KCS blev dyrket til konfluens, derefter udsat for 25 mJ / cm2 UVB-bestråling. ( A ) Fasekontrastbilleder ved 10X forstørrelse taget ved 12 og 24 timer efter UVB-eksponering viste en tidsafhængig UVB-induceret celledød. Skalestang = 100 μm. ( B ) Celle-levedygtigheden blev kvantificeret ved CCK-8-celledannbarhedsassayet ved 6, 8 og 24 timer efter UVB-behandling. ( C ) UVB-induceret frigivelse af TNFa til mediet ved angivne tidspunkter blev målt ved ELISA. Alle fejlstænger angiver middel ± SEM. P-værdierne blev beregnet ved en-vejs ANOVA-multipel sammenligningTest (***, p <0,001) Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hudens epidermis fungerer som en kritisk barriere for at adskille og beskytte kroppen udefra og beskadige vandfald, patogener, varme og UV-bestråling. KC'erne er epidermis fremherskende cellelinie, og primære kulturer af epidermale KC'er er et nyttigt redskab til at studere og forstå de biologiske processer af barrieredannelse og KCs reaktion på miljøbelastninger in vitro .
Her beskriver vi metoder til at isolere og dyrke primære epidermale KC'er fra neonatal og voksen museskind. Selvom primære mus-KC'er kan isoleres bekvemt fra neonatal museskind, anses isoleringen og den vellykkede kultur af voksne KC'er vanskelige på grund af udtyndingen af epidermis og den høje hårfollikeldensitet af den voksne mus-dorsalhud. Den her beskrevne metode anvender voksen mushalehud som en bekvem og rigelig kilde til basale KC'er. På grund af tilstedeværelsen af en tyk epidermis og lav Hårfollikeldensitet i halehuden bliver det kritiske trin til isolering af KC'er ved at adskille epidermis fra dermis mulig efter efterfølgende dispensering af halehuden. I modsætning hertil var vores forsøg på at isolere KC'er fra voksen dorsal hud ved anvendelse af denne protokol ikke succesfuld, hvilket resulterede i lav celleudbytte efter isolering og lav cellefastgørelse efter plating. Imidlertid er vellykket isolering og kultur af KC'er fra voksen dorsal hud blevet rapporteret efter natten over trypsinfordøjelse af den pelsfrie hud 15 , hvilket tyder på, at dispase alene ikke kan være tilstrækkelig til at ekstrahere follikulære KC'er fra dermis af den voksne dorsale hud.
I denne protokol blev de primære KC'er dyrket i lavt calciummedium suppleret med dGS i stedet for den calcium-udarmede chelexed-FBS, der blev udbredt i flere tidligere publicerede mus KC-kulturprotokoller 4 , 15 , "> 16 , 17 , 18. I dette studie observerede vi, at dGS er bedre end chelexed FBS til dyrkning af voksne mus-KC'er og at opretholde KC's basalcellemorfologi ( Figur 2A ). Det er imidlertid sandsynligt, at effektiviteten af chelexed-FBS At opretholde KCs basale morfologi kan afhænge af det FBS-parti, der anvendes i hver undersøgelse.
Ved at anvende de her viste metoder viste vi, at både epidermal KCs fra neonatal og voksen mus reagerede på højkalcium-udløst terminal differentiering, tæt celleforbindelsesdannelse og stratificering ( Figur 1 Og figur 2 ). I almindelighed hæver det ekstracellulære calciumniveau til større end 0,1 mM trigger terminal differentiering af basale KCs 4 , 5 , 17 ,Ass = "xref"> 19. Det er blevet rapporteret, at et mellemliggende niveau af calcium (0,1-0,16 mM) inducerede i det væsentlige ekspressionen af tidlige differentieringsmarkører, såsom K1 og K10, i løbet af de første 24 timer på calcium-omskifter, hvorimod K1 og K10 kun blev induceret i en lille Fraktion af celler, når de behandles med højere calciummedium (1 mM) 19 , 20 . Det højere calciummedium (≥1 mM) er imidlertid blevet anvendt bredt i mange andre undersøgelser for hurtig og robust at fremkalde KC-stratificering og ekspressionen af sen differentieringsgener, såsom INV og LOR 4 , 21 , 22 , 23 . Baseret på vores erfaring, et mellemliggende niveau af calcium, såsom 0,2 mM CaCl2, fører til en gradvis og langsommere indtræden af terminal differentiering, mens et højere niveauer calcium (≥1 mM) drastisk fremskynde indtræden af KC teRminal differentiering, hvilket fører til et kortere tidsvindue til at studere de cellulære ændringer under differentiering. Derfor anvendte vi 0,2 mM CaCl2 til at inducere KC terminal differentiering, og vi har vist, at dette mellemprodukt calcium niveau førte til en gradvis ændring af basal celle morfologi til en lagdelt corneocyt morfologi inden 72 timer efter calcium kontakten (figur 2B).
Vores gruppe har tidligere vist, at epidermale KC'er også spiller en vigtig rolle for at initiere inflammatoriske reaktioner på patogener eller DAMP'er, der frigives under skade og / eller UVB-bestråling 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . I overensstemmelse med disse in vivo observationer viste vi her, at dyrkede voksne mus-KC'er var yderst modtagelige for UVB-udløst celledød, og UVB-behandlede KC'er frigjorte en storMængde af TNFa, som er et nøglebetændende inflammatorisk cytokin, som aktiverer immunsystemet.
Sammenfattende tilvejebringer den primære musepidermal KC-cellekultur en nyttig in vitro- model til undersøgelse af epidermal barrieredannelse og medfødt immunrespons af KC'er, og de her beskrevne metoder vil være af interesse for forskere, der forfølger studier i kutan biologi i neonatalmusen som Såvel som i den voksne mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NATIONAL INSTITUT OF ARTHRITIS AND MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES grant (R01AR069653 til Zhang LJ) og National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 til CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).
