Summary
Epidermale Keratinozyten bilden eine funktionelle Hautbarriere und sind an der Frontlinie der Wirtsverteidigung gegen äußere Umweltbeleidigungen positioniert. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Primärkultur von epidermalen Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Maushaut und Induktion der terminalen Differenzierung und UVB-ausgelösten Entzündungsreaktionen von Keratinozyten.
Abstract
Der Keratinozyt (KC) ist der vorherrschende Zelltyp in der Epidermis, der äußersten Schicht der Haut. Epidermale KCs spielen eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von Hautverteidigung durch die Bildung einer intakten Hautbarriere gegen Umwelt-Beleidigungen, wie UVB-Bestrahlung oder Pathogene, und auch durch die Einleitung einer entzündlichen Reaktion auf diese Beleidigungen. Hier beschreiben wir Methoden, um KCs von der neonatalen Maushaut und von der erwachsenen Mausschwanzhaut zu isolieren. Wir beschreiben auch Kultivierungsbedingungen mit definierten Wachstumsergänzungen (dGS) im Vergleich zu Chelex-fötalem Rinderserum (cFBS). Funktionell zeigen wir, dass sowohl neonatale als auch erwachsene KCs in hohem Maße auf eine hohe Calcium-induzierte terminale Differenzierung, eine enge Kreuzungsbildung und -schichtung ansprechen. Darüber hinaus sind kultivierte erwachsene KCs anfällig für UVB-ausgelösten Zelltod und können große Mengen an TNF bei UVB-Bestrahlung freisetzen. Gemeinsam sind die hier beschriebenen Methoden für Forscher für den Aufbau des In-vitro- Modells von NutzenS, um die epidermale Biologie in der neonatalen Maus und / oder der erwachsenen Maus zu studieren.
Introduction
Die Haut ist das größte Organ im Körper mit der Epidermis als die äußerste Schicht. Die Epidermis spielt eine entscheidende Rolle bei der Bildung einer intakten epidermalen Barriere, um den Körper von der Umwelt zu trennen und verhindert so Wasserverlust und schützt vor Umweltbeleidigungen wie Allergenen, Krankheitserregern und UVB-Exposition. Die Epidermis entwickelt sich aus einer einzigen Schicht von undifferenzierten basalen Keratinozyten (KCs) zu einem mehrschichtigen, geschichteten Epithel, bestehend aus einer Basalschicht, gefolgt von einer Dornschicht, einer körnigen Schicht und einem Stratum corneum. Basale KCs, bestehend aus epidermalen Stammzellen und transitverstärkenden Zellen, sind proliferativ und undifferenziert. Da die Basal-KCs den Zellzyklus verlassen, begehen die Zellen der Differenzierung und wandern allmählich zur Oberfläche der Epidermis, begleitet von der Reifung von Zellzellübergängen und der Bildung einer epidermalen Permeabilitätsbarriere (EPB). Die KCs an der Dornschicht drücken früh differenz ausIonenmarker wie Keratin 10 (K10); Wenn die KCs zur körnigen Schicht wandern, exprimieren die Zellen späte Differenzierungsmarker wie Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) und Involucrin (INV). Bei dem Stratum corneum werden die KCs endlich differenzierte Corneozyten, die schließlich durch Abschuppung abgebaut werden, da neue Zellen sie ersetzen.
Calcium gilt als das physiologischste Mittel in der Epidermis und löst die Differenzierung in vitro und in vivo in ähnlicher Weise aus. Bei normaler Hautepidermis bilden Calciumionen einen charakteristischen "Konzentrationsgradienten", der sich in der Konzentration auf die Hautoberfläche 1 , 2 , 3 erhöht. Die Calciumkonzentration steigt von niedrigen Niveaus in den untersten Teilschichten (Basal- und Dornschichten) bis zu einem Peak in der oberen Granulatschicht und fällt dann in der oberflächlichen Schicht (Stratum corneum) zu vernachlässigbaren Niveaus. Der Kalziumgradient entwickelt sich auch zufällig mit der Entstehung einer Komponentenpermeabilitätsbarriere, die die Calcium-Signalisierung eine kritische Rolle der KC-Differenzierung spielt. In vitro behält das niedrige Kalzium (0,02-0,1 mM) die Proliferation von basalen KCs als Monoschicht bei, während ein hohes Kalzium (> 0,1 mM) eine rasche und irreversible Verpflichtung der Zellen zur terminalen Differenzierung induziert, wie durch eine enge Kreuzung und Induktion gezeigt wird Von LOR und INV bei hoher Kalziumbehandlung zu den basalen KCs 4 , 5 .
Neben der Barrierebildung sind auch epidermale KCs ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems der Haut. Als Reaktion auf Pathogene oder beschädigte assoziierte molekulare Muster (DAMPs), die bei UVB-Bestrahlung oder Verletzung freigesetzt werden, können KCs große Mengen an entzündlichen Zytokinen wie TNF & agr ;, IL 6 und IFN & bgr; erzeugen, was zu einer Aktivierung des Immunsystems führt> 6 , 7 , 8 , 9 Obwohl eine korrekte entzündliche Signalisierung von KCs für die Pathogen-Clearance erforderlich ist, kann eine unkontrollierte Entzündungsreaktion die Entwicklung von entzündungshemmenden Hauterkrankungen wie Psoriasis und Rosacea 6 , 8 auslösen.
Insgesamt spielen KCs eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der intakten Hautbarriere und initiieren eine Immunantwort auf Pathogeninvasion oder Umweltbeleidigungen. Daher ist die primäre Kultur der epidermalen KCs eine nützliche Technik, um die Epithelbiologie, KC-Differenzierung sowie KC-stimulierte angeborene Immunantworten zu untersuchen. Die Isolierung und Kultur der primären Maus epidermalen KCs kann ein anspruchsvoller Prozess aufgrund der KC-Anfälligkeit und Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen externen Stimulanzien sein. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultur von KCs aus der neonatalen Maushaut oderErwachsene Maus Schwanz Haut. Für die erwachsene KC-Isolation verwenden wir keine Maus-Dorsal-Haut, da die Isolierung von ausreichenden Mengen an lebensfähigen KCs aus diesem Gewebe aus folgenden Gründen schwierig sein kann: Erstens besteht die erwachsene Dorsalhaut in der Ruhephase des Haarzyklus (Telogen) aus a Dünne Epidermis mit nur 1-2 Schichten von Zellen, was zu einer niedrigen Zelle Ausbeute und ineffiziente Trennung der Epidermis aus der Dermis, die der kritische Schritt für eine erfolgreiche KC-Isolation ist. Zweitens trägt die hohe Haarfollikeldichte, die auf der erwachsenen Dorsalhaut vorhanden ist, weiter zur Schwierigkeit bei der Trennung der Epidermis von der Dermis bei. Stattdessen verwenden wir routinemäßig die Schwanzhaut als Quelle für erwachsene Maus-KCs, da dieses Epithel mit 3-5 Schichten epidermalen KCs dicker ist. Es hat auch eine niedrigere Haarfollikel-Dichte, die nicht mit der epidermalen Trennung stört, so dass KC-Isolierung von jeder erwachsenen Maus Schwanz Haut unabhängig von der Alter und Haare Radfahren Stadium der Maus. Die isolierte neonaTal KCs werden zu gelatinebeschichteten Kulturschalen ausgesät, während kollagenbeschichtete Schalen verwendet werden, um isolierte erwachsene KCs zu säen, da die beeinträchtigten Fähigkeiten der erwachsenen Zellen im Vergleich zu ihren neonatalen Gegenstücken haften. Zur Kombination von Maus-KCs wird ein niedriges Calcium-Basalmedium mit dGS ergänzt, das epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Rindertransferrin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor c1 (IGF1), Prostaglandin E2 (PGE2), Rinderserumalbumin (BSA) und Hydrocortison enthält. Zwischen 2-4 Tagen nach der anfänglichen Beschichtung können die meisten der differenzierten KCs während der täglichen mittleren Veränderungen weggewaschen werden, und die verbleibenden adhärenten Zellen zeigen eine typische Kopfsteinmorphologie 4 , sind proliferierend und exprimieren nicht den frühen Differenzierungsmarker K10.
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Protocol
Alle Tierversuche werden vom UCSD Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Primäre Maus KC Isolierung und Kultur aus neonatalen Haut
- Opfer der postnatalen Tag 0-2 Neugeborenen aus dem C57B / 6 Wildtyp-Maus-Stamm durch Enthauptung mit Schere. Schneide die Glieder kurz über dem Handgelenk und den Knöchelgelenken ab, schneide dann den Schwanz ab und läßt ein kleines Loch zu.
- Um die ganze Haut abzuschälen, schlage die scharfe Schere durch das Loch am Schwanz und schneide die Haut entlang der dorsalen Mittellinie des Körpers auf die Öffnung am Hals. Als nächstes verwenden Sie eine Pinzette, um den freiliegenden Körper und die andere Pinzette zu fassen, um die Haut zu fassen, und schütteln Sie sanft die ganze Haut vom Körper und über die Beinstümpfe mit einer kontinuierlichen Bewegung.
- Schälen Sie die Haut als ein intaktes Stück und achten Sie darauf, die Haut nicht in Stücke zu brechen, da dies zu Zellverlust während des Disposeschrittes führen wird.
<Li> Spülen Sie die geschälte Haut mit 15 ml sterilem PBS in einer 10 cm Petrischale und legen Sie dann die Haut von jedem Welpen in ein 2-ml-Röhrchen, gefüllt mit Eiskälteablagerungs-Verdauungspuffer, der 4 mg / mL Dispase in KC-Wachstumsmedium enthält (KC-Basalmedium hat 0,06 mM CaCl 2 , dGS und Antibiotika / Antimykotika). - Vergewissern Sie sich, dass die Haut nicht in der Röhre gefaltet ist, da dies zu einer unzureichenden Belichtung des gefalteten Bereichs zur Disposelösung führt.
- Am nächsten tag (nach 12-18 h in dispase), transportiere die haut zusammen mit der dispase lösung in eine petrischale Übertragen Sie jedes Gewebestück auf eine neue Petrischale mit 15 ml sterilem PBS, um überschüssige Disposition zu waschen.
- Mit zwei Pinzettenpaaren greife die Haut von PBS,Heben Sie die Haut und übertragen Sie eine neue Petrischale mit der epidermalen Seite nach unten und die Dermis nach oben. Die Hautfalten sorgfältig ausdehnen, damit sie auf der Petrischale vollständig ausgezogen ist.
- Platzieren Sie 500 μl einer Trypsin-basierten Aufschlusslösung für jede Haut in einer neuen Petrischale. Mit Pinzette, langsam heben Sie die Dermis auf und weg von der Epidermis, während die Epidermis nach unten halten. Die Dermis als biologisch gefährliches Material entsorgen. Übertragen Sie die getrennte Epidermis und schweben Sie auf jeden Tropfen Trypsin-Lösung mit der Basalschicht nach unten.
- Wenn die Epidermis auf die Trypsin-Lösung gefaltet ist, entfernen Sie alle Falten mit Pinzette, um eine effiziente Verdauung von basalen KCs aus dem Epithel zu gewährleisten.
- Die Haut auf einer Petrischale in Trypsinlösung bei Raumtemperatur (mit Deckel bedeckt) auf einem horizontalen Schüttler mit leichtem Rühren für 20 min inkubieren.
- Füge 2 ml des ergänzten KC-Wachstumsmediums pro Epidermis hinzu (ca. 1 Quadratzoll in der Größe proEpidermis) zur Petrischale. Fassen Sie die Epidermis mit Pinzette, und kräftig reiben die Epidermis hin und her, um einzelne Zellen aus dem epidermalen Blatt freizugeben.
- Beobachten Sie das Medium drehen zunehmend trübe, wie die Zellen von der Epidermis abgelöst werden. Kippen Sie die Petrischale, um die Zellsuspension zu einem neuen Röhrchen zu sammeln und zu transportieren, wobei das übrige Epidermisblatt auf dem Teller bleibt.
- Wiederholen Sie zwei weitere Male das Reiben der epidermalen Folie nach Zugabe von 2 ml KC-Wachstumsmedium und kombinieren Sie die Zellsuspensionen in der gleichen Röhre.
- Pipettieren Sie die Zelllösung vorsichtig ein paar Mal, um alle Zellklumpen mit der entsprechenden serologischen Pipette zu brechen und dann durch einen 100 μm Filter in ein neues 50 mL Zentrifugenröhrchen zu führen.
- Zentrifugieren der filtrierten Zellen für 5 min bei 180 x g.
- Den Überstand abtupfen und das Zellpellet vorsichtig in 1 ml kaltem KC-Wachstumsmedium / Epidermis resuspendieren.
- Zähle die Zellen durch ein Hämocytometer.
- Pflanzensamen , die Zellen in einer Dichte von 5 x 10 4 / cm 2 in Wachstumsmedium KC in Kulturschalen vorbeschichtet mit einem extrazellulären Matrix (ECM) Produkt , das der Zellanheftung fördert.
HINWEIS: Wir verwenden eine handelsübliche (zB Anbindungsfaktor, der ein Gelatine-basiertes Beschichtungsmaterial ist (siehe Tabelle der Materialien für Details). Die Zellen wurden im befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C kultiviert und es wurden frisches Medium Jeden zweiten Tag aufgefüllt- Zur Beschichtung die Kulturschalen mit dem Zellbefestigungsbeschichtungsmaterial auf die Raumtemperatur für 10 min bis 2 h vor dem Zellseeding aufwärmen. Entfernen Sie den Befestigungsfaktor kurz vorZugabe der Zellsuspension
- Ändern Sie das Medium 24 h nach der anfänglichen Beschichtung, um ungebundene Zellen zu entfernen, und ändern Sie das Medium täglich, bis die Zellen die gewünschte Konfluenz vor dem Experiment erreichen.
HINWEIS: Mehrere Hautisolate können kombiniert und in einem 15-ml-Röhrchen (bis zu 5 Skins pro Röhrchen) mit 12 ml Disposelösung inkubiert werden. Inkubieren Sie das Hautröhrchen über Nacht in einem 4 ° C Kühlschrank auf einem Rotator.
2. Primäre Maus KC Isolierung von Erwachsenen Schwanz Haut
- Opfer einer erwachsenen C57BL / 6-Maus (vorzugsweise zwischen 6-15 Wochen alt, entweder männlich oder weiblich) nach den Tierbestimmungen. Den Schwanz von der Schwanzbasis abschneiden und ~ 2 mm der Schwanzspitze abschneiden, so dass ein sichtbares Loch an der Spitze ist.
- Um die Schwanzhaut abzureißen, verwenden Sie zuerst eine scharfe Klinge, um die Schwanzhaut von der Basis bis zur Schwanzspitze zu schneiden. Als nächstes verwenden Sie eine Pinzette, um den freiliegenden Schwanzknochen und die andere Pinzette zu fassen, um die Haut zu fassen, und schütteln Sie die Schwanzhaut vorsichtig mit einer kontinuierlichen Bewegung vom Knochen ab. Schneide die geschälte Haut von der Mittellinie, so dass jedes Stück weniger als 2-3 cm lang ist.
- Spülen Sie die geschälte Haut WitzH 15 ml steriles PBS in einer 10 cm Petrischale, dann platziere die Haut von jedem Schwanz in ein 2 mL Röhrchen, gefüllt mit Eiskälteablagerung Verdauungspuffer (4 mg / mL Dispase in KC Wachstumsmedium).
HINWEIS: Mehrere Hautstücke können auch kombiniert und in einem 15-ml-Röhrchen (bis zu 5 Schwänze pro Röhrchen) mit 12 ml Disposelösung inkubiert werden.- Inkubieren Sie das Hautröhrchen über Nacht in einem 4 ° C Kühlschrank auf einem Rotator.
- Führen Sie die Schritte 1.4 bis 1.13 aus, um die Einzelzellsuspension von der Schwanz-Epidermis zu isolieren.
- Saatgut , die adulte Zellen in einer Dichte von 10 x 10 4 / cm 2 (von einer Zählkammer gezählt) in Wachstumsmedium KC in Kulturschalen vorbeschichtet mit Kollagen.
HINWEIS: Wir verwenden ein handelsübliches kollagenbasiertes Beschichtungskit (siehe die Tabelle der Materialien für Details). Die Zellen wurden in befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C kultiviert, und frisches Medium wurde jeden zweiten Tag aufgefüllt. Im allgemeinen ist die cGeiergerichte sollten mit Kollagen für 30 min bis 1 h vor der Zellsäen beschichtet werden. Wir beobachten, dass es eine signifikante Verbesserung der erwachsenen KC-Anlagerung an die Schale gibt, wenn sie mit Kollagen beschichtet ist, verglichen mit dem Bindungsfaktor, der ein Gelatine-basiertes Beschichtungsmaterial ist. - Ändern Sie das Medium 24 h nach der anfänglichen Beschichtung, um ungebundene Zellen zu entfernen, und ändern Sie das Medium täglich, bis die Zellen die gewünschte Konfluenz vor dem Experiment erreichen.
3. In vitro Differenzierung von KCs durch High Calcium
- Um eine terminale Differenzierung zu induzieren, fügen Sie CaCl 2 zu 0,2 mM im Kulturmedium hinzu.
- Alternativ verhungern die kultivierten KCs über Nacht ohne Zusatzwachstumsergänzungen in niedrigem Calcium-KC-Basalmedium vor der Zugabe von hohem Kalzium.
HINWEIS: Wachstumsfaktor Hunger wird die Zellverpflichtung zur frühen Differenzierung und die Induktion von frühen Differenzierungsmarkern, wie K10 5, verbessern
4. UVB-Bestrahlung vermittelter Zelltod und TNF & agr; Freisetzung von KCs
- Kultur die Maus KCs im KC-Wachstumsmedium (im befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C) mit täglichem Medium wechseln, bis die Zellen Konfluenz erreichen. Unmittelbar vor der UVB-Bestrahlung das Wachstumsmedium entfernen und mit 500 μl PBS ersetzen. Dann die Zellen auf 25 mJ / cm 2 UVB oder Mock Control (kein UVB) unterziehen.
HINWEIS: Die UVB-Bestrahlung erfolgt mit handgehaltenen UVB-Lampen mit zwei 8 W-Glühlampen (312 nm) wie zuvor beschrieben 10 . Nach UVB-Bestrahlung wird PBS aspiriert und frisches Medium zugegeben. - Messen und quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit durch den CCK-8-Zelllebensfähigkeitstest nach 6, 8 und 24 h nach der UVB-Behandlung nach der Anweisung des Herstellers 11 .
- Sammeln Sie das konditionierte Medium aus den mit UVB behandelten KCs zu gewünschten Zeitpunkten und messen Sie das freigesetzte TNFαIm konditionierten Medium mit dem Maus-TNF (Mono / Mono) ELISA-Kit nach der Anleitung des Herstellers 7 , 12 .
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Representative Results
Hohe Calcium-induzierte terminale Differenzierung von neonatalen und erwachsenen KCs. Die primäre Maus epidermalen KCs ausplattiert und gehalten bei 0,06 mM CaCl 2 wuchs als Monoschicht, und einzelne Zellen hatten eine polygonale Form mit deutlichen Interzellularraum, zeigt einen Pflasterstein Aussehen , wenn konfluent (1A und 2A). Anheben des CaCl 2 bis 0,2 mM induziert eine rasche Änderung der Morphologie der Zellen. Innerhalb von 8 h nach dem hohen Kalzium-Schalter wurden die Zellen abgeflacht und der deutliche interzelluläre Raum wurde weniger offensichtlich, und um 24 h wurde die Zell-Zell-Adhäsion mit engen Verknüpfungen offensichtlich ( Abbildung 1A und Abbildung 2B ). Die Bildung der verhornten Zellhülle und der vertikalen Zellschichtung begannen um 48-72 h nach dem hohen Kalziumschalter ( Abbildung 2B). Zur Analyse der Aktin-Remodellierung und der Zell-Zell-Enge-Junction-Bildung während des hohen Calcium-Schalters wurden KCs, die mit 0,2 mM CaCl 2 behandelt wurden, mit Phalloidin gefärbt ( 1B ), um die Aktin-Remodellierung während der KC-Differenzierung 13 zu messen. Die Bildung der Aktin-Faser-reichen filopodialen Projektionen zwischen den benachbarten Zellen wurde bereits nach 3 h nach dem Calcium-Schalter nachgewiesen und die Aktin-Faser-Remodellierung ging weiter zwischen 6-24 h fort, und um 48 h wurde die Zellschichtung signifikant ( Abbildung 1B ).
Anfälligkeit von Maus-KCs zu UVB-ausgelöstem Zelltod und TNFα-Freisetzung . Die kultivierten erwachsenen Maus-KCs wurden einer 25 MJ / cm 2 UVB-Bestrahlung ausgesetzt, und die Zelllebensfähigkeit und TNF & agr ;, die in dem Kulturmedium freigesetzt wurden, wurden analysiert. Wie aus den Phasenkontrastbildern hervorgeht ( AbbRe 3A) sowie der Zelllebensfähigkeitstest ( Abbildung 3B ), löste das UVB einen zeitabhängigen Tod der KCs aus. Nach 24 h wurde die Mehrheit der Zellen abgerundet und von der Schale abgelöst ( Abbildung 3A ). Wie durch den Zelllebensfähigkeitstest quantifiziert, waren ~ 90% der Zellen innerhalb von 24 h nach der UVB-Behandlung tot ( Abbildung 3B , p <0,001, berechnet durch Einweg-ANOVA-Mehrfachvergleichstest). Schließlich zeigten wir, dass TNF & agr ;, ein wichtiges Zytokin, das durch UVB induziert wird und die KC-Apoptose nach der UVB-Bestrahlung 14 antreibt, in dem Kulturmedium von 24 h nach der UVB-Bestrahlung (& ndash; 250 & mgr; UVB-behandelten KCs zeitabhängig ( Abbildung 3C ).
Zahl 1: Primäre Kultur von neonatalen Maus-KCs und hoher Calcium-induzierter terminaler Differenzierung und fester Zell-Zell-Junction-Bildung. ( A ). Primäre neonatale Maus KCs wurden mit hohem Calcium (0,2 mM CaCl 2) behandelt, und die Phasenkontrastbilder mit 4 - facher Vergrößerung wurden bei 0 Stunden entnommen (ctrl) und bei 8 h nach der Behandlung. Maßstab = 100 μm. ( B ). Neonatale KCs wurden in Gegenwart von 0,2 mM CaCl 2 differenziert, und die Zellen wurden mit Phalloidin (rot) gefärbt, um die Bildung von aktinfaserreichen filopodalen Projektionen zwischen den benachbarten Zellen während der Differenzierung zu visualisieren. Die Nuklei wurden mit DAPI gegengefärbt, und Aktinfasern wurden mit Rhodaminphalloidin gefärbt. Maßstab = 25 μm. Die Bilder wurden bei 20facher Vergrößerung unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops auf den DAPI-Kanal (für die Kernfärbung) und den RFP-Kanal (für Aktin-Färbung) eingestellt. Lank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Primäre Kultur und hohe Calcium-induzierte Terminaldifferenzierung von Erwachsenen-Maus-KCs. ( A ). Phasenkontrastbilder bei 10facher Vergrößerung der primären erwachsenen MauskCs bei 8 h, 1 Tag, 2 Tagen und 3 Tagen nach der Erstbeschichtung. Die obere Platte repräsentiert Zellen, die in dGS gezüchtet werden, und die untere Platte stellt Zellen dar, die in 10% Chelex-FBS (cFBS) mit 8 ng / ml rekombinantem Maus-EGF gezüchtet wurden. Maßstab = 100 μm. ( B ). Konfluente erwachsene Maus KCs wurden in Gegenwart von 0,2 mM CaCl 2 differenziert und Phasenkontrastbilder bei 10facher Vergrößerung wurden bei 0 (ctrl) genommen, 8, 24, 48 und 72 h nach dem hohen Calcium - Schalter. Maßstab = 100 μm.Nk "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Primäre Kultur von Erwachsenen Maus KCs und Anfälligkeit von Erwachsenen KCs zu UVB-induzierten Zelle Tod und Freisetzung von TNFα. Primäre erwachsene Maus-KCs wurden zu Konfluenz kultiviert und dann einer 25 mJ / cm 2 UVB-Bestrahlung ausgesetzt. ( A ) Phasenkontrastbilder bei 10facher Vergrößerung bei 12 und 24 Stunden nach der UVB-Exposition zeigten einen zeitabhängigen UVB-induzierten Zelltod. Maßstab = 100 μm. ( B ) Die Zelllebensfähigkeit wurde durch den CCK-8-Zelllebensfähigkeitstest bei 6, 8 und 24 h nach der UVB-Behandlung quantifiziert. ( C ) Die UVB-induzierte Freisetzung von TNF & agr; zu den Medien zu den angegebenen Zeitpunkten wurde durch ELISA gemessen. Alle Fehlerbalken geben Mittelwert ± SEM an. Die p-Werte wurden durch Einweg-ANOVA-Mehrfachvergleich berechnetTest (***, p <0,001) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Haut-Epidermis fungiert als eine kritische Barriere, um den Körper von der äußeren Umgebung zu trennen und zu schützen und Schäden durch Wasserverlust, Krankheitserreger, Hitze und UV-Bestrahlung. Die KCs sind die vorherrschende Zelllinie der Epidermis, und die Primärkultur der epidermalen KCs ist ein nützliches Werkzeug, um die biologischen Prozesse der Barrierebildung und die Reaktion von KCs auf Umweltbeleidigungen in vitro zu untersuchen und zu verstehen.
Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Kultur von primären epidermalen KCs aus neonatalen und erwachsenen Maushaut. Während primäre Maus-KCs bequem von der neonatalen Maushaut isoliert werden können, werden die Isolation und die erfolgreiche Kultur der erwachsenen KCs aufgrund der Ausdünnung der Epidermis und der hohen Haarfollikeldichte der erwachsenen Maus dorsalen Haut als schwierig angesehen. Die hier beschriebene Methode verwendet die erwachsene Maus-Schwanzhaut als eine bequeme und reichhaltige Quelle von basalen KCs. Wegen der Anwesenheit einer dicken Epidermis und niedrig Haarfollikeldichte in der Schwanzhaut, der kritische Schritt der Isolierung von KCs durch die Trennung der Epidermis von der Dermis wird nach der Überlagerung der Verdauung der Schwanzhaut möglich. Im Gegensatz dazu war unser Versuch, KCs von der erwachsenen dorsalen Haut unter Verwendung dieses Protokolls zu isolieren, nicht erfolgreich, was zu einer niedrigen Zellausbeute nach der Isolierung und einer niedrigen Zelladhäsion nach dem Plattieren führte. Jedoch wurde eine erfolgreiche Isolierung und Kultur von KCs von erwachsener dorsaler Haut nach über Nacht Trypsinverdauung der pelzfreien Haut 15 berichtet , was darauf hindeutet, dass die Disposition allein nicht ausreicht, um Follikel-KCs aus der Dermis der erwachsenen Dorsalhaut zu extrahieren.
In diesem Protokoll wurden die primären KCs in einem niedrigen Calciummedium, das mit dGS ergänzt wurde, anstelle des mit Calcium abgereicherten Chelex-FBS gezüchtet, das in mehreren zuvor veröffentlichten Maus-KC-Kulturprotokollen 4 , 15 , "> 16 , 17 , 18. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass dGS dem Chelex-FBS überlegen ist, um erwachsene Maus-KCs zu kultivieren und die Basalzell-Morphologie von KC zu pflegen ( Abbildung 2A ). Allerdings ist es wahrscheinlich, dass die Wirksamkeit von Chelex-FBS Um die Basalmorphologie von KC aufrechtzuerhalten, kann von der in jeder Studie verwendeten FBS-Menge abhängen.
Unter Verwendung der hier vorgestellten Methoden haben wir gezeigt, dass sowohl die neonatalen als auch die erwachsenen Maus-Epidermis-KCs auf eine hohe Calcium-getriggerte terminale Differenzierung, eine enge Zellpunktbildung und -schichtung ( Abbildung 1) Und Fig. 2 ). Im Allgemeinen löst die Erhöhung des extrazellulären Calciumspiegels auf mehr als 0,1 mM die terminale Differenzierung der basalen KCs 4 , 5 , 17 ,Ass = "xref"> 19 Es wurde berichtet, dass ein Zwischenniveau von Calcium (0,1 & ndash; 0,16 mM) im Wesentlichen die Expression von frühen Differenzierungsmarkern, wie K1 und K10, während der ersten 24 h bei Calcium-Schalter induzierte, während K1 und K10 nur in einem kleinen induziert wurden Fraktion von Zellen bei der Behandlung mit höherem Calciummedium (1 mM) 19 , 20 . Allerdings ist das höhere Calciummedium (≥1 mM) in vielen anderen Studien weit verbreitet, um die KC-Stratifizierung und die Expression von späten Differenzierungsgenen, wie INV und LOR 4 , 21 , 22 , 23 , schnell und robust zu induzieren. Basierend auf unserer Erfahrung führt ein Zwischenniveau von Calcium, wie 0,2 mM CaCl 2 , zu einem allmählichen und langsamen Beginn der terminalen Differenzierung, während ein höherer Calciumgehalt (≥1 mM) den Beginn von KC te drastisch beschleunigtRminalen Differenzierung, was zu einem kürzeren Zeitfenster führt, um die zellulären Veränderungen während der Differenzierung zu untersuchen. Daher haben wir 0,2 mM CaCl 2 verwendet , um die KC-terminale Differenzierung zu induzieren, und wir haben gezeigt, dass dieser intermediäre Calciumspiegel zu einer allmählichen Veränderung der Basalzellmorphologie zu einer geschichteten Corneozytenmorphologie innerhalb von 72 h nach dem Calciumschalter führte ( 2B ).
Unsere Gruppe hat zuvor gezeigt, dass epidermale KCs auch eine wichtige Rolle spielen, um entzündliche Reaktionen auf Pathogene oder DAMPs zu initiieren, die bei Verletzungen und / oder UVB-Bestrahlung 6 , 7 , 8 , 9 , 10 freigesetzt werden. Im Einklang mit diesen in vivo Beobachtungen, hier zeigten wir, dass kultivierte erwachsene Maus KCs waren sehr anfällig für UVB-ausgelösten Zelltod und UVB-behandelten KCs veröffentlicht eine großeMenge an TNFα, die ein Schlüssel entzündliches Zytokin ist, das das Immunsystem aktiviert.
Zusammenfassend stellt die primäre Maus-Epidermis-KC-Zellkultur ein nützliches in vitro- Modell dar, um die epidermale Barrierebildung und die angeborene Immunantwort von KCs zu untersuchen, und die hier beschriebenen Verfahren werden für Forscher, die Studien in der Hautbiologie in der neonatalen Maus untersuchen, von Interesse sein Gut wie in der erwachsenen Maus.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NATIONAL INSTITUTE OF ARTHRITIS UND MUSKULOSKELETAL UND HAUTKRANKHEITEN gewährt (R01AR069653 bis Zhang LJ) und National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 bis CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
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