Summary
Os queratinócitos epidérmicos formam uma barreira funcional da pele e são posicionados na linha de frente da defesa do hospedeiro contra insultos ambientais externos. Aqui descrevemos métodos para isolamento e cultura primária de queratinócitos epidérmicos de pele de rato neonatal e adulta e indução de diferenciação terminal e resposta inflamatória desencadeada por UVB de queratinócitos.
Abstract
O queratinócito (KC) é o tipo de célula predominante na epiderme, a camada mais externa da pele. Os KC epidérmicos desempenham um papel crítico no fornecimento de defesa da pele ao formar uma barreira da pele intacta contra insultos ambientais, como a irradiação UVB ou patógenos, e também iniciando uma resposta inflamatória sobre esses insultos. Aqui descrevemos métodos para isolar KCs de pele de rato neonatal e de pele de rabo de rato adulto. Também descrevemos condições de cultura usando suplementos de crescimento definidos (dGS) em comparação com o soro fetal bovino chelexado (cFBS). Funcionalmente, mostramos que os KCs neonatais e adultos são altamente responsivos à alta diferenciação terminal induzida por cálcio, formação de junção apertada e estratificação. Além disso, os KCs adultos cultivados são suscetíveis à morte celular desencadeada por UVB e podem liberar grandes quantidades de TNF após a irradiação UVB. Juntos, os métodos descritos aqui serão úteis aos pesquisadores para a configuração do modelo in vitroS para estudar biologia epidérmica no rato neonatal e / ou no rato adulto.
Introduction
A pele é o maior órgão do corpo com a epiderme como a camada mais externa. A epiderme desempenha um papel crítico na formação de uma barreira epidérmica intacta para separar o corpo do meio ambiente e, assim, evita a perda de água e fornece proteção contra insultos ambientais, como alérgenos, agentes patogênicos e exposição a UVB. A epiderme desenvolve a partir de uma única camada de queratinócitos basais indiferenciados (KCs) em um epitélio estratificado de várias camadas, consistindo de uma camada basal, seguida por uma camada espinhosa, camada granular e estrato córneo. Os KCs basais, que consistem em células-tronco epidérmicas e células amplificadoras de trânsito, são proliferativos e indiferenciados. À medida que os KC basais saem do ciclo celular, as células comprometem-se a se diferenciar e migram gradualmente para a superfície da epiderme, acompanhada pela maturação das junções célula-célula e na formação de uma barreira de permeabilidade epidérmica (EPB). Os KCs na camada espinhosa expressam diferenciais iniciaisMarcadores de iões tais como queratina 10 (K10); À medida que os KCs migram para a camada granular, as células expressam marcadores de diferenciação tardia, como Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) e Involucrin (INV). No stratum corneum, os KCs se tornam corneócitos terminalmente diferenciados, que eventualmente são lançados através da descamação, à medida que novas células os substituem.
O cálcio é considerado o agente mais fisiológico na epiderme e desencadeia a diferenciação in vitro e in vivo de maneira similar. Na epiderme de pele normal, os íons de cálcio formam um "gradiente de concentração" característico, aumentando a concentração para a superfície da pele 1 , 2 , 3 . A concentração de cálcio aumenta de níveis baixos nas subcamadas mais baixas (camadas basais e espinhosas) até um pico na camada granular superior e depois cai para níveis insignificantes na camada mais superficial (estrato córneo). O gradiente de cálcio também se desenvolve coincidentemente com o surgimento de uma barreira de permeabilidade de componentes, que apóia que a sinalização de cálcio desempenha um papel crítico na diferenciação de KC. In vitro , baixo teor de cálcio (0,02-0,1 mM) mantém a proliferação de KCs basais como monocamada, enquanto que o alto teor de cálcio (> 0,1 mM) induz um comprometimento rápido e irreversível das células para a diferenciação terminal, como demonstrado pela formação e indução da junção apertada De LOR e INV após alto tratamento de cálcio com os KC basais 4 , 5 .
Além da formação de barreiras, os KC epidérmicos também são um componente importante do sistema imune inato da pele. Em resposta a patógenos ou padrões moleculares associados danificados (DAMPs) liberados após irradiação UVB ou lesões, os KCs podem produzir grandes quantidades de citocinas inflamatórias, como TNFα, IL6 e IFNβ, levando a ativação do sistema imunológico> 6 , 7 , 8 , 9 . Embora seja necessária uma sinalização inflamatória adequada de KCs para a depuração de patógenos, a resposta inflamatória descontrolada pode desencadear o desenvolvimento de doenças de pele auto-inflamatórias, como psoríase e rosácea 6 , 8 .
Em geral, os KCs desempenham um papel vital na manutenção da barreira da pele intacta e no início de uma resposta imune após invasão de patógenos ou insultos ambientais. Portanto, a cultura primária de KCs epidérmicos é uma técnica útil para estudar a biologia epitelial, a diferenciação de KC, bem como as respostas imunes inatas estimuladas por KC. O isolamento e a cultura dos KCs epidérmicos de ratos primários podem ser um processo desafiador devido à susceptibilidade e sensibilidade de KC a vários estimulantes externos. Aqui descrevemos um método para isolar e cultura KCs de pele neonatal de mouse ouPele de cauda de rato adulto. Para o isolamento KC adulto, não usamos a pele dorsal do mouse porque o isolamento de quantidades suficientes de KC viáveis deste tecido pode ser difícil pelas seguintes razões: Primeiro, a pele dorsal adulta na fase de repouso do ciclo do cabelo (telógeno) consiste em um Epiderme fina com apenas 1-2 camadas de células, levando a um baixo rendimento celular e a uma separação ineficiente da epiderme da derme, que é o passo crítico para o sucesso do isolamento de KC. Em segundo lugar, a alta densidade folicular do cabelo que está presente na pele dorsal adulta contribui ainda mais para a dificuldade em separar a epiderme da derme. Em vez disso, usamos rotineiramente a pele da cauda como fonte de KCs para ratos adultos, pois esse epitélio é mais espesso com 3-5 camadas de KC epidérmico. Também possui uma menor densidade do folículo capilar, o que não interfere na separação epidérmica, permitindo o isolamento KC de qualquer pele de rabo de rato adulto, independentemente da idade e do estágio de ciclismo do mouse. A neona isoladaKCs são semeados para pratos de cultura revestidos com gelatina, enquanto que os pratos revestidos com colágeno são utilizados para semente KC adultos isolados devido à capacidade prejudicada das células adultas para aderir em comparação com as suas contrapartes neonatais. Para cultivar KCs de ratinho, o meio basal de baixo cálcio é suplementado com dGS, que contém o fator de crescimento epidérmico (EGF), a transferrina bovina, o fator de crescimento insulino-tipo1 (IGF1), a prostaglandina E2 (PGE2), a albumina de soro bovino (BSA) e a hidrocortisona. Entre 2-4 dias após o chapeamento inicial, a maioria dos KCs diferenciados podem ser lavados durante as mudanças diárias do meio, e as células aderentes restantes apresentam morfologia típica em paralelepípedos 4 , estão proliferando e não expressam o marcador de diferenciação inicial K10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSD.
1. Isolamento primário e cultura de KC do mouse por pele neonatal
- Sacrifique o nascimento pós-natal de 0 a 2 neonatos da cepa do mouse tipo selvagem C57B / 6 por decapitação usando tesoura. Corte os membros logo acima das articulações do pulso e do tornozelo, depois corte a cauda completamente, deixando um pequeno orifício.
- Para descascar a pele inteira, primeiro inserir tesoura afiada através do buraco na cauda e cortar a pele ao longo da linha dorsal do meio do corpo até a abertura no pescoço. Em seguida, use uma pinça para agarrar o corpo exposto e as outras fórceps para agarrar a pele e remova suavemente a pele inteira do corpo e sobre os tocos da perna com um movimento contínuo.
- Retire a pele como uma peça intacta e tenha cuidado para não quebrar a pele em pedaços, pois isso irá resultar em perda de células durante a etapa de dispase.
<Li> Enxágue a pele descascada com 15 mL de PBS estéril em uma placa de Petri de 10 cm e, em seguida, coloque a pele de cada cachorrinho em um tubo de 2 mL preenchido com tampão de digestão com dispersão gelada, que contém 4 mg / mL de dispersão em meio de crescimento de KC (KC meio basal tem 0,06 mM de CaCl2, DG, e antibióticos / antimicóticos). - Certifique-se de que a pele não está dobrada no tubo, pois isso irá resultar em exposição insuficiente da região dobrada à solução dispase.
- No dia seguinte (após 12-18 h em dispase), transfira a pele juntamente com a solução de dispersão para uma placa de Petri. Transfira cada peça de tecido para uma nova placa de Petri com 15 ml de PBS estéril para lavar o excesso de dispase.
- Usando dois pares de pinças, segure a pele do PBS,Levante a pele e transfira para uma nova placa de Petri com o lado epidérmico para baixo e a derme para cima. Estique cuidadosamente as dobras da pele de modo a que ela seja totalmente estendida na placa de Petri.
- Coloque 500 μL de uma solução de digestão à base de tripsina para cada pele em uma nova placa de Petri. Usando fórceps, levante lentamente a derme para cima e afastar-se da epiderme, enquanto mantém pressionada a epiderme. Descarte a derme como material biológico perigoso. Transfira a epiderme separada e flutue em cada gota de solução de tripsina com a camada basal para baixo.
- Se a epiderme é dobrada na solução de tripsina, remova as dobras usando fórceps para garantir uma digestão eficiente de KCs basais do epitélio.
- Incube a pele em uma placa de Petri em solução de tripsina à temperatura ambiente (com a tampa coberta) em um agitador horizontal com agitação suave durante 20 min.
- Adicione 2 mL de meio de crescimento de KC suplementado por epiderme (cerca de 1 polegada quadrada de tamanho porEpiderme) para a placa de Petri. Segure a epiderme usando fórceps e esfregue vigorosamente a epiderme para trás e para trás para liberar células únicas da folha epidérmica.
- Observe que o meio se torna cada vez mais turvo à medida que as células são separadas da epiderme. Incline a placa Petri para recolher e transferir a suspensão celular para um novo tubo, deixando a folha epidérmica restante no prato.
- Repita mais duas vezes o esfregamento da folha epidérmica após a adição de 2 mL de meio de crescimento KC e combine as suspensões celulares no mesmo tubo.
- Pipetar a solução celular de forma ascendente e descendente suavemente algumas vezes para quebrar qualquer aglomerado celular usando a pipeta serológica apropriada e passá-lo através de um filtro de 100 μm para um novo tubo de centrífuga de 50 mL.
- Centrifugar as células filtradas durante 5 min a 180 x g.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender gentilmente o sedimento celular em 1 mL de meio de crescimento KC frio / epiderme.
- Conte as células por um hemocitômetro.
- Semear as células a uma densidade de 5 x 10 4 / cm 2 em meio de crescimento KC em placas de cultura pré-revestida com um produto de matriz extracelular (ECM) que promove a fixação das células.
NOTA: Usamos um comercial disponível (por exemplo, fator de fixação, que é um material de revestimento à base de gelatina (veja a Tabela de Materiais para detalhes). As células foram cultivadas em incubadora humidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C e meio fresco Reabastecido todos os dias.- Para o revestimento, revestir os pratos de cultura com o material de revestimento de fixação celular aquecido até a temperatura ambiente durante 10 min a 2 h antes da semeadura celular. Remova o fator de anexo imediatamente antesAdicionando a suspensão celular.
- Mude o meio 24 h após o revestimento inicial para remover as células não ligadas e mude o meio diariamente até as células chegarem à confluência desejada antes da experiência.
NOTA: vários isolados de pele podem ser combinados e incubados em um tubo de 15 mL (até 5 peles por tubo) contendo 12 mL de solução de dispase. Incubar o tubo de pele durante a noite em um refrigerador de 4 ° C em um rotador.
2. Isolamento primário KC do mouse da pele de cauda adulta
- Sacrifique um mouse adulto C57BL / 6 (de preferência entre 6-15 semanas de idade, masculino ou feminino) de acordo com os regulamentos da instalação animal. Corte a cauda do corpo da base da cauda e corte ~ 2 mm da ponta da cauda para que haja um orifício visível na ponta.
- Para descascar a pele da cauda, primeiro use uma lâmina afiada para cortar a pele da cauda da base até a ponta da cauda. Em seguida, use uma pinça para agarrar o osso da cauda exposto e as outras fórceps para agarrar a pele e remova suavemente a pele da cauda do osso com um movimento contínuo. Corte a pele descascada da linha média para que cada peça tenha menos de 2-3 cm de comprimento.
- Enxágüe a pele de pele sagacidadeH 15 mL de PBS estéril em uma placa de Petri de 10 cm, em seguida coloque a pele de cada cauda em um tubo de 2 mL preenchido com tampão de digestão com dispersão gelada (4 mg / mL de dispersão em meio de crescimento de KC).
NOTA: várias peças de pele também podem ser combinadas e incubadas em um tubo de 15 mL (até 5 caudas por tubo) contendo 12 mL de solução de dispersão.- Incubar o tubo de pele durante a noite em um refrigerador de 4 ° C em um rotador.
- Execute os passos 1.4 a 1.13 para isolar a suspensão de célula única da epiderme da cauda.
- Semente as células adultas com uma densidade de 10 x 10 4 / cm 2 (contada por um hematocitômetro) em meio de crescimento KC em pratos de cultura pré-revestidos com colágeno.
NOTA: Utilizamos um kit de revestimento baseado em colágeno comercialmente disponível (veja a Tabela de Materiais para obter detalhes). As células foram cultivadas em incubadora humidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C, e o meio fresco foi reabastecido todos os dias. Em geral, o cOs pratos ulture devem ser revestidos com colágeno durante 30 min a 1 h antes da semeadura celular. Observamos que há um aprimoramento significativo da aderência KC adulta ao prato quando revestido com colágeno em comparação com o fator de fixação, que é um material de revestimento à base de gelatina. - Mude o meio 24 h após o revestimento inicial para remover as células não ligadas e mude o meio diariamente até as células chegarem à confluência desejada antes da experiência.
3. Diferenciação in vitro de KCs por alto cálcio
- Para induzir a diferenciação terminal, adicionar CaCl 2-0,2 mM no meio de cultura.
- Alternativamente, fome os KCs cultivados durante a noite sem suplementos de crescimento adicionados em meio basal de baixo teor de cálcio KC antes da adição de alto teor de cálcio.
NOTA: A fome do fator de crescimento aumentará o comprometimento celular para a diferenciação precoce e a indução de marcadores de diferenciação precoce, como o K10 5
4. Mortalidade celular mediada por irradiação UVB e liberação de TNFα de KCs
- Cultive os KCs do mouse no meio de crescimento KC (em incubadora humidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C) com mudança média diária até as células chegarem à confluência. Imediatamente antes da irradiação UVB, remova o meio de crescimento e substitua-o por 500 μL de PBS. Em seguida, submeta as células a 25 mJ / cm 2 UVB ou controle de simulação (não UVB).
NOTA: A irradiação UVB é realizada usando lâmpadas UVB portáteis com duas lâmpadas de 8 W (312 nm) como descrito anteriormente 10 . Após a irradiação UVB, o PBS é aspirado e o meio fresco é adicionado. - Medir e quantificar a viabilidade celular pelo teste de viabilidade CCK-8 a 6, 8 e 24 h após o tratamento com UVB seguindo as instruções do fabricante 11 .
- Recolher o meio condicionado dos KCs tratados com UVB nos pontos de tempo desejados e medir o TNFα liberadoNo meio condicionado pelo kit ELISA do TNF (Mono / Mono), seguindo as instruções 7 , 12 do fabricante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alta diferenciação terminal induzida por cálcio de KC neonatal e adulto. O primário epidérmico do rato KCs plaqueadas e mantidas a 0,06 mM de CaCl2 cresceu como uma monocamada, e as células individuais tinham uma forma poligonal com espaço intercelular distintas, que mostra o aspecto de paralelepípedos quando confluentes (Figura 1A e Figura 2A). Elevando o CaCl 2-0,2 mM induziu uma morfologia mudança rápida das células. Dentro das 8 h após o alto interruptor de cálcio, as células ficaram achatadas e o espaço intercelular distinto tornou-se menos aparente e, por 24 h, a adesão célula-célula com junções apertadas tornou-se óbvia ( Figura 1A e Figura 2B ). A formação do envelope celular cornificado e a estratificação celular vertical começaram em torno de 48-72 h após o alto interruptor de cálcio ( Figura 2B). Para analisar a remodelação da actina e formação de ligações firmes célula-célula durante o interruptor de alta cálcio, KCs tratados com 0,2 mM de CaCl2 foram coradas com faloidina (Figura 1B) para medir a remodelação da actina durante a diferenciação KC 13. A formação das projeções filopodiais ricas em fibras de actina entre as células adjacentes foi detectada tão cedo quanto 3 horas após o intercâmbio de cálcio, e a remodelação da fibra de actina avançou ainda mais entre 6-24 h e, por 48 h, a estratificação celular tornou-se proeminente ( Figura 1B ).
Susceptibilidade de KCs de mouse para morte celular ativada por UVB e liberação de TNFa . Os KCs adultos de ratos cultivados foram expostos a irradiação UVB de 25 mJ / cm 2 , e a viabilidade celular e TNFα liberados no meio de cultura foram analisados. Como mostrado pelas imagens de contraste de fase ( FiguRe 3A), bem como o ensaio de viabilidade celular ( Figura 3B ), o UVB desencadeou uma morte dependente do tempo dos KCs. Por 24 h, a maioria das células foram arredondadas e foram separadas do prato ( Figura 3A ). Conforme quantificado pelo ensaio de viabilidade celular, ~ 90% das células morreram dentro de 24 h após o tratamento com UVB ( Figura 3B ; p <0,001 como calculado pelo teste de comparação múltipla ANOVA unidirecional). Finalmente, mostramos que o TNFα, uma citoquina importante que é induzida por UVB e que acciona a apoptose KC após a irradiação UVB 14 , foi abundantemente segregada (~ 250 pg / mL dentro de 24 h após irradiação com UVB, p <0,001) no meio de cultura de KCs tratados com UVB de uma maneira dependente do tempo ( Figura 3C ).
Figura 1: Cultura primária de KCs de ratos neonatais e diferenciação de terminal induzido com alto teor de cálcio e formação de junção de célula-célula apertada. ( A ). KCs rato neonatal primários foram tratados com elevado teor em cálcio (0,2 mM de CaCl 2), e as imagens de contraste de fase a uma ampliação de 4X foram tiradas às 0 horas (ctrl) e a 8 h após o tratamento. Barra de escala = 100 μm. ( B ). KCs neonatais foram diferenciadas na presença de 0,2 mM de CaCl2, e as células foram coradas com faloidina (vermelho) para visualizar a formação de saliências filopoidais ricos em fibras de actina entre as células adjacentes durante a diferenciação. Os núcleos foram contrastados com DAPI, e as fibras de actina foram coradas com faloidina de rodamina. Barra de escala = 25 μm. As imagens foram tiradas com uma ampliação de 20X usando um microscópio de fluorescência configurado para o canal DAPI (para coloração de núcleos) e canal RFP (para coloração de actina). Lank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cultura primária e diferenciação do terminal induzido com alto teor de cálcio de KCs de ratos adultos. ( A ). Imagens de contraste de fase com uma ampliação de 10x de KCs de rato adulto primário às 8 h, 1 dia, 2 dias e 3 dias após o revestimento inicial. O painel superior representa células cultivadas em dGS, e o painel inferior representa células cultivadas em FBS 10% chelexed (cFBS) com 8 ng / mL de EGF recombinante de ratinho. Barra de escala = 100 μm. ( B ). Os KCs de ratos adulta confluentes foram diferenciados na presença de CaCl 2 0,2 mM, e as imagens de contraste de fase com ampliação de 10X foram tomadas a 0 (ctrl), 8, 24, 48 e 72 h após o alto permutador de cálcio. Barra de escala = 100 μm.Nk "> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cultura primária de KCs de ratos adultos e Susceptibilidade de KCs adultos à morte celular induzida por UVB e liberação de TNFα. Os KC de rato adultos primários foram cultivados em confluência, depois expostos a irradiação UVB de 25 mJ / cm 2 . ( A ) As imagens de contraste de fase com ampliação de 10X tomadas às 12 e 24 horas após a exposição a UVB mostraram uma morte celular induzida por UVB dependente do tempo. Barra de escala = 100 μm. ( B ) A viabilidade celular foi quantificada pelo teste de viabilidade celular CCK-8 aos 6, 8 e 24 h após o tratamento com UVB. ( C ) A libertação induzida por UVB de TNFa para a mídia nos pontos de tempo indicados foi medida por ELISA. Todas as barras de erro indicam média ± SEM. Os valores de p foram calculados pela comparação múltipla ANOVA unidirecionalTeste (***, p <0,001) Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A epiderme da pele funciona como uma barreira crítica para separar e proteger o corpo do ambiente externo e danos causados pela perda de água, patógenos, calor e radiação UV. Os KCs são a linhagem celular predominante da epiderme e a cultura primária de KC epidérmicas é uma ferramenta útil para estudar e compreender os processos biológicos de formação de barreiras e a resposta de KCs a insultos ambientais in vitro .
Aqui descrevemos métodos para isolar e cultivar KCs epidérmicos primários de pele de rato neonatal e adulta. Embora os KC primários de mouse possam ser convenientemente isolados da pele neonatal do mouse, o isolamento e a cultura de sucesso de KCs adultos são considerados difíceis devido ao amasso da epiderme e à alta densidade folicular do cabelo da pele dorsal do mouse adulto. O método descrito aqui usa a pele da cauda do rato adulto como uma fonte conveniente e abundante de KCs basais. Devido à presença de uma epiderme espessa e baixa Densidade do folículo capilar na pele da cauda, o passo crítico de isolar KCs, separando a epiderme da derme, torna-se viável após a digestão da pele da cauda durante a noite. Em contraste, nossa tentativa de isolar KCs da pele dorsal adulta usando este protocolo não foi bem sucedida, resultando em baixo rendimento celular após o isolamento e baixa ligação celular após o revestimento. No entanto, o isolamento e a cultura bem sucedidos de KCs da pele dorsal adulta foram relatados após a digestão da tripsina durante a noite na pele 15 , sugerindo que o dispase sozinho pode não ser suficiente para extrair KCs foliculares da derme da pele dorsal adulta.
Neste protocolo, os KCs primários foram cultivados em meio de cálcio baixo suplementado com dGS em vez de FBS chelexed empobrecido com cálcio, que foi amplamente utilizado em vários protocolos de cultura de KC de mouse publicados anteriormente 4 , 15 , "16 , 17 , 18. Neste estudo, observamos que dGS é superior ao FBS chelexed para cultivar KCs de ratos adultos e para manter a morfologia das células basais de KC ( Figura 2A ). No entanto, é provável que a eficácia do FBS chelexed Para manter a morfologia basal da KC pode depender do lote FBS usado em cada estudo.
Usando os métodos apresentados aqui, demonstramos que ambos os KCs epidérmicos de ratos neonatais e adultos responderam à diferenciação terminal de alto grau provocada por cálcio, formação de junção celular apertada e estratificação ( Figura 1 E Figura 2 ). Em geral, elevar o nível de cálcio extracelular para maior que 0,1 mM desencadeia a diferenciação terminal de KCs basais 4 , 5 , 17 ,Ass = "xref"> 19. Foi relatado que um nível intermediário de cálcio (0,1- 0,16 mM) induziu substancialmente a expressão de marcadores de diferenciação precoce, como K1 e K10, durante as primeiras 24 h após o interruptor de cálcio, enquanto que K1 e K10 foram induzidos somente em um pequeno Fração de células quando tratada com meio de cálcio superior (1 mM) 19 , 20 . No entanto, o maior meio de cálcio (≥1 mM) tem sido amplamente utilizado em muitos outros estudos para induzir rápida e fortemente a estratificação KC e a expressão de genes de diferenciação tardia, como INV e LOR 4 , 21 , 22 , 23 . Com base na nossa experiência, um nível intermédio de cálcio, tais como 0,2 mM CaCl 2, leva a um início gradual e mais lenta de diferenciação terminal, ao passo que um maior nível de cálcio (≥1 mM) drasticamente acelerar o início da KC teDiferenciação rminal, levando a uma janela de tempo mais curto para estudar as mudanças celulares durante a diferenciação. Portanto, usamos 0,2 mM de CaCl 2 para induzir a diferenciação do terminal KC, e mostramos que este nível intermediário de cálcio levou a uma mudança gradual da morfologia basal celular para uma morfologia de corneócitos estratificados dentro de 72 h após o interruptor de cálcio ( Figura 2B ).
Nosso grupo já demonstrou que os KC epidérmicos também desempenham um papel importante para iniciar respostas inflamatórias a agentes patogênicos ou DAMPs liberados durante lesão e / ou irradiação UVB 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . De acordo com as observações in vivo , aqui mostramos que os KCs adultos de ratos cultivados eram altamente suscetíveis à morte celular desencadeada por UVB e os KCs tratados com UVB liberaram um grandeQuantidade de TNFα, que é uma citocina inflamatória chave que ativa o sistema imunológico.
Em resumo, a cultura de células KC epidérmicas de rato primário fornece um modelo in vitro útil para estudar a formação de barreira epidérmica e a resposta imune inata de KCs, e os métodos aqui descritos serão de interesse para pesquisadores que pesquisam estudos em biologia cutânea no rato neonatal como Bem como no mouse adulto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela subvenção de INSTITUTO NACIONAL DE ARTRITE E MÚSICA MUSCULOSALELÉTICA E PELE (R01AR069653 a Zhang LJ) e Institutos Nacionais de Apoio à Saúde (5T32AR062496-03 a CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).
