Summary
Эта рукопись описывается утилита УЗИ на самок крыс в разработке экспериментальной модели для репродуктивного и гинекологических расследования. Приводится подробное объяснение о том, как выполнять ультрасонографическая оценки.
Abstract
С развитием вспомогательных репродуктивных технологий и этических ограничений исследований на людях крыса Животные модели широко используются в репродуктивной медицине. В прошлом изучение развития репродуктивной системы у грызунов была основана на одноразовый гистологическом подакцизным тканей. Недавно с развитием разрешением трансабдоминального ультразвука, сонография высокого качества теперь могут быть выполнены для оценки репродуктивных органов у крыс, позволяя новый метод для изучения репродуктивной системы. Изображения были получены с помощью систему с высоким разрешением эндокринологом. Гинекологическое УЗИ была проведена 28 8 недельных небеременных крыс и 5 беременных крысах Sprague-Dawley. Мы опишем, как признать органов репродуктивной системы и связанные с ними структуры в типичных представлениях на различных этапах эструса цикла. Цвет потока Doppler был использован для измерения потока крови маточной артерии и оценки матки шаблон изменения кровотока на различных стадиях беременности. Мы продемонстрировали, что ультразвуковое исследование является полезным методом для оценки изменений в внутренних половых органов. Его применение повышает возможность проведения дополнительных экспериментов, в том числе медицинские или хирургические процедуры и предоставляет возможность контролировать сонографические изменения внутренних органов без ущерба для животных.
Introduction
Крыса Животные модели широко используются в репродуктивной медицине, в том числе эмбриона и яичников трансплантации1,2. Однако в прошлом, изучение развития репродуктивной системы у грызунов была основана на одноразовый гистологическом подакцизным тканей и продольное исследование изменения повседневной репродуктивный орган не удалось в крыс3. УЗИ широко использовался в вспомогательных репродуктивных технологий в организме человека на протяжении более 30 лет, но это ценные технологии только был применен к крысам недавно.
Наша цель заключалась в создании ультрасонографическая подхода для оценки репродуктивных органов крысах Sprague-Dawley для разработки экспериментальных моделей для репродукции и гинекологии расследования и чтобы продемонстрировать порядок, потому что наши знания, Существует нет текущий визуализированных публикаций относительно этой процедуры. Мы описываем процедуры ультрасонографическое обследование женского пола крыса репродуктивной системы и настоящем ультрасонографическая выводы по анатомии и маточные артерии кровотока с помощью ультразвука высокой четкости. Мы мониторинг характеристики эндометрия, яичников и маточных артерий кровотока в небеременных животных на разных этапах цикла эструса оценить значительные различия в толщине эндометрия, яичников морфология и матки кровотока в различные этапы цикла эструса, похож на женщин. Мы использовали высококачественные ультразвуковое оборудование с частотой 70 МГц и уровнем резолюции 30 мкм. Наша цель заключалась в оценке изменений в сопротивлении матки кровотока в беременных крыс. Эта техника позволяет для изучения ежедневных изменений в репродуктивных органов без ущерба для животных.
Существует несколько технических трудностей в использовании ультразвука на крыс. Эти трудности включают в себя: Крыса эндометрия намного тоньше, чем человеческий девушки4. Трудности в imaging яичников у крыс было обусловлено толще кожи и мышц брюшной стенки у крыс, которые привели к почти полной затухания ультразвука5, и маточных артерий является гораздо более сложным найти в небеременных крысы. Мы решили многие технические проблемы с процедурой, и для тех проблем, которые остаются, мы покажем, как их минимизации.
Успешное мониторинг сонографические изменений в репродуктивных органах крыс без необходимости приносить в жертву животных будет открыта возможность строительства будущего животных моделей репродуктивной медицины и других хирургических процедур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями руководства для ухода и использования лабораторных животных национальных институтов здоровья и в соответствии с прибытия (животное исследования: отчетности в Vivo эксперименты) руководящие принципы. Протокол получил лицензию для соблюдения директивы 2010/63/ЕС с номером авторизации A13170404 (Anexo 1) экспериментов на животных. Все эксперименты проводились в Европейский союз сертифицированные лаборатории после национальные руководящие принципы этического ухода за животными (RD 53/2013, директива ЕС 63/2010). Протокол был одобрен Комитетом по этике животных эксперименты Университета Мурсии.
1. животных подготовка
Примечание: Все эксперименты были поддержаны животных экспериментов раздел Университета Мурсии и акушерства и гинекологии департамента Мурсия университета.
- Используйте 8 недели старый Sprague-Dawley крысы (28 самок крыс) весом 200-250 г в всех экспериментов.
Примечание: Здесь, мы также использовали 5 беременных крыс. - Чтобы получить беременных крыс, клетки 8 недельных женщин и плодородные самцов крыс и мат с 17:00 -23:00 ч. Идентификация вагинальных свечей на следующее утро было истолковано как спаривания успех. Рассмотрим 1 день гестации, следующий день после того, как они были вязка.
- Проведение экспериментов на 9, 15 и 18 дней гестации.
- Дом крысы в группах по два с свободный доступ к продовольствию и воде и поддерживать на очередной 12 h свет/темно циклов.
- После акклиматизации к условиям объекта как минимум две недели, используйте ежедневно утром вагинальной цитологии для оценки частоты эструса и регулярности.
Примечание: Двадцать восемь крыс с обычный 4-5 день течки этапа были отобраны для включения в исследование.
2. Подготовка крыс для изображений
Примечание: Изображения были получены с помощью разрешением трансабдоминального ультразвукового исследования. Фазы эстрального цикла были определены мазок вагинальной цитологии.
- До исследования изображений анестезировать плотины в зале индукции с 2-3% изофлюрановая газом.
- Удаление животных и немедленно поместить морду в носовой конус, подключенный к системе анестезии и поддерживать животное на 1,5-2% изофлюрановая во время ультразвукового обследования.
- Удалите мех из реберную маржа в хвостовой части живота с Клипперс и депиляционный крем.
- Место наркотизированных крыс в лежачем положении на таблицу с подогревом для обеспечения крыса и обеспечения оптимального комфорта и поддержания физиологических параметров для продолжительности обработки изображений сессии. Все физиологические параметры должны быть интегрированы с изображениями и данные регистрируются в режиме реального времени через применение ультразвука.
- Аккуратно вставьте ректальный датчик (после смазывания) для мониторинга температуры тела (37,5 ° C ± 0,5 ° C).
- Датчика (30 Гц) в стационарных держателя и перемещать его вдоль вертикальной и горизонтальной оси (вперед назад и side-to-side) с помощью ручного джойстик или вручную.
- Применить на нефтяной основе офтальмологических бальзам для глаз крысу, чтобы избежать высыхания во время процедуры.
3. Экспертиза
Примечание: Анатомия rats´ репродуктивных органов: влагалище лежит спинной мочевого пузыря и делится на два рога матки, расширяющие сторону почки. Яичников связаны маточные рожки через яйцеводов (рис. 1). Матки расположен в регионе кзади почки.
-
Идентификация матки
- С помощью мочевого пузыря как ориентир для поиска шейки матки, следуйте шейки матки найти ветви левой и правой маточные рожки.
- Перейти к двумерной просмотра/видео, выбрав «B-режим». Измерьте Антеро задний диаметр каждого рога матки в регионе середине наружного на изображении сагиттальной срединной линии. Обнаружить измерений с помощью ультразвука системного программного обеспечения.
- Измерьте эндометрия толщиной от эхогенная границы до границы эхогенная через полости эндометрия на изображении сагиттальной срединной линии в режиме «B-».
- Изменить на Цветной Допплер режим, выбрав «Цветные Doppler». Используйте цвет Доплера для выявления кровоснабжение эндометрия и измерить кровоток эндометрия. В Цветной Допплер режим выберите следующие параметры: ВЧ-фильтр установлен на 4 Гц, набор частоты импульсного повторения между 4 и 48 кГц и Импульсный Допплер ворота от 0,2 до 0,5 мм.
-
Определение потока крови маточных артерий
- Получите доплеровских сигналов в маточные артерии вблизи боковой уступает маржа стыке маточно-шейки матки около подвздошных артерии с каждой стороны.
- Используйте следующие параметры в режиме Допплер: ВЧ-фильтр установлен на 6 Гц, набор частоты импульсного повторения между 4 и 48 кГц и Импульсный Допплер ворота от 0,2 до 0,5 мм.
- Позаботьтесь, чтобы выровнять поток крови и Doppler луч к минимуму Doppler угол. Запись угол между Doppler луча и судна. Значения, взятые за углом 60° являются неточными и следует избегать6.
- Измерьте пиковой систолической скорости (ПСВ) и конечного диастолического скорости (EDV) из трех последовательных циклов. Затем вычислите систолическое диастолическое (S/D) соотношение (ПСВ/EDV) и индекс сопротивления (РИ) ([ПСВ-EDV] / ПСВ) значения для каждого рога матки.
- Измерения потока крови маточной артерии 5 беременных крыс во время 9-й, 15-й, 18-й день беременности.
-
Идентификация завязи и кровотока яичников артерии
Примечание: Женского пола крыса яичников расположены боковые почки по обе стороны от животного и проживают в жировых отложений, нашли в конце рога матки (рис. 1).- Для изображений яичников, начните с зонд в поперечной плоскости и поместите его на боковой аспект животного чуть ниже ребер. Почки и жировой ткани имеют вид гиперэхогенные по сравнению с яичника.
- Измерьте внешней границы завязи и фолликулов. Цифры на шкале для каждого изображения находятся в миллиметрах, с шагом 0,1 мм.
Примечание: Цветной Допплер режим и Допплер режим визуализации помогает с идентификации яичников интенсивность и направление потока.
4. Дизайн исследования
- Проверка цикла эструса по цитологии вагинальный мазок.
- Разделите всех крыс в двух группах. Для группы 1 или предварительно плодородные (или periovulatory) включают крысы, которые были в proestrus и эструса фазы цикла. Для группы 2 или после плодородные включают крысы, которые были в начале диэструса и конце диэструса фазы цикла.
- Отслеживать и сравнивать Антеро задний диаметр каждого рога матки в регионе середине наружного групп 1 и 2.
- Мониторинг и Сравнение толщины эндометрия и характеристики эндометрия в группах 1 и 2.
- Отслеживать и сравнивать размер (максимальные диаметры) и характеристики яичников, локализовать любой periovulatory фолликулов в обоих яичников в группах 1 и 2.
- Отслеживать и сравнивать маточной артерии кровотока в группах 1 и 2.
- Отслеживать и сравнивать маточной артерии поток крови беременных крыс в различных стадиях беременности (дней 9, 15 и 18 гестации).
- Выполнить используя SPSS статистический анализ. Представить данные как среднее ± стандартное отклонение (SD) или медиана с межквартильный диапазон. Анализировать результаты, используя t тест Стьюдента между различными группами. P-значение менее чем 0,05 считался статистически значимой разницы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Там было без значительных различий в рога матки кзади Антеро диаметров или толщины эндометрия между двумя сторонами рога матки (Таблица 1). По сравнению с группой 2, средняя толщина эндометрия в группе 1 был толще, но не значительные различия (P > 0,05) были найдены между двумя группами (рис. 3). Тем не менее мы нашли жидкости внутри матки (в 8 из 28 крыс) вблизи цикл эструса, связанные с изменениями в эндометрии морфологии (рис. 2).
Доплеровского исследования также показали никаких существенных изменений в потоке скорость волны узоров в каждой стороне рога матки или в различных этапах цикла эструса у небеременных крыс (таблицы 1 и 2, рис. 4A). Однако у беременных крыс, как беременности дополнительно, пик систолического и диастолического конце скоростей, значительно увеличилось и индекс расчетные сопротивления значительно сократилось (Таблица 3, рис. 4B).
Средний диаметр яичник не был существенно разные (Таблица 1). При морфологией завязи в сравнении между двумя группами, periovulatories фолликулов и жидкости вокруг яичника были замечены после овуляции ( Рисунок 2,Таблица 2).
Рисунок 1 : Анатомия Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Измерение толщины эндометрия (B-режиме). Толщина эндометрия (синяя линия) (A). (B) цикл Антеро заднего рога матки диаметров (большая синяя линия) и толщина эндометрия (короткие синяя линия) во время течки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : (A) Измерение диаметра левого яичника; (B) завязи и фолликулов во время течки фазы.
Рисунок 4 : Измерение потока крови маточной артерии. (A) маточных артерий кровотока в небеременных крыс. (B) маточных артерий кровотока в 15- й день беременных крыс.
(P > 0,05, никакого существенного различия в каждой группе). SD: Стандартный DesviationPSV: пиковая систолическая velocityEDV: конец диастолическое velocityS/D: систолическое к диастолическое ratioRI: индекс сопротивления. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)
|
Переменная (mm±SD) |
Левая сторона | Правая сторона | P. значение |
| Рога диаметр (мм) | 1.78±0.24 | 1.73±0.28 | 0.626 |
| Толщина эндометрия (мм) | 0.75±0.06 | 0.76±0.05 | 0.752 |
| Завязь диаметр (мм) | 3.69±0.52 | 3.62±0.32 | 0.107 |
| Фолликул размер (мм) | 1.68±0.31 | 1.74±0.29 | 0,859 |
| ПСВ (мм/сек) | 91.52±17.91 | 93.07±22.87 | 0,055 |
| EDV (мм/сек) | 34.18±9.36 | 36.67±11.14 | 0,178 |
| S/D | 2.78±0.59 | 2.62±0.50 | 0,294 |
| РИ | 0.62±0.08 | 0.60±0.08 | 0.876 |
| (P > 0,05, никакого существенного различия в каждой группе). | |||
| SD: Стандартный Desviation | |||
| ПСВ: пиковая систолическая скорость | |||
| EDV: конечного диастолического скорость | |||
| S/D: систолического, диастолического соотношения | |||
| RI: индекс сопротивления. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV) | |||
Таблица 1: Различия в Рог левой и правой матки и яичников.
|
Переменная (mm±SD) |
Стадии эструса (Группа 1) |
Non эструса фаза (Группа 2) |
P.Value |
| Рога диаметр (мм) | 1.71±0.18 | 1.83±0.23 | 0.433 |
| Толщина эндометрия (мм) | 0.78±0.04 | 0.72±0.05 | 0,168 |
| Завязь диаметр (мм) | 3.71±0.56 | 3.66±0.47 | 0.515 |
| ПСВ (мм/сек) | 92.05±17.93 | 94.15±20.62 | 0.886 |
| EDV (мм/сек) | 37.81±9.64 | 34.72±5.38 | 0.096 |
| S/D | 2.61±0.58 | 2.77±0.44 | 0.249 |
| РИ | 0.60±0.08 | 0.63±0.06 | 0.232 |
| (P > 0,05, никакого существенного различия в каждой группе). | |||
| SD: Стандартный Desviation | |||
| ПСВ: пиковая систолическая скорость | |||
| EDV: конечного диастолического скорость | |||
| S/D: систолического, диастолического соотношения | |||
| RI: индекс сопротивления. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV) | |||
Таблица 2: Различия между различными эстральный цикл фазы в небеременных крыс.
| Переменная | D9 | D15 | D18 | Значение P |
| PSV(mm/s) | 111.08±5.93, б | 122.64±7.49c | 131.91±3.50 | < 0,05 |
| EDV(mm/s) | 38.80±3.37d, e | 56.43±3.10f | 79.29±5.47 | < 0,05 |
| S/D | 2.87±0.12g, h | 2.17±0.16я | 1.67±0.14 | < 0,05 |
| РИ | 0.65±0.02 j, k | 0.54±0.04L | 0.39±0.05 | < 0,05 |
| ПСВ = пиковой систолической скорости | ||||
| EDV = конец диастолической скорости. | ||||
| S/D = систолическое диастолическое соотношение (ПСВ/ЭДВ). | ||||
| РИ = индекс сопротивления ((RI) = ([ПСВ – EDV] / ПСВ). | ||||
| D9 = 9 день беременности | ||||
| D15 = 15 день беременности | ||||
| D18 = 18 день беременности | ||||
| SD: ошибки указывают на стандартное отклонение (±). | ||||
| (P < 0,05, никакого существенного различия в каждой группе) | ||||
| Значение P: D9 против D15 = 0,03; d = 0,001; g = 0.01; j = 0.01. D9 против D18 b = 0,003; e = 0,001; h = 0.01; k = 0,001. D15 против D18 c = 0,03; f = 0,001; я = 0,03; L = 0,04. |
||||
Таблица 3: Различия в маточных артерий кровотока в беременных крыс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Из-за процедурных изменений и устранения неполадок, что требуется в этом исследовании, несмотря на нашей целью выявления все стадии эструса цикла у крыс с помощью ультразвука мы не смогли найти каких-либо существенных различий. Мы предполагаем, что эти трудности могут быть потому что цикл эструса длится только несколько дней в крыс, в отличие от цикла у женщин. Мы уверены, что все измерения были сделаны в ровно в нужное время, чтобы определить какие-либо различия. Поэтому мы перегруппировались эструса фаз цикла только две фазы оценки для любых различий, но никто не наблюдались. Как и ожидалось, мы нашли никакого существенного различия между измерения каждого рога матки, которая позволит нам выбрать либо рога для выполнения измерений в будущем. Исследования о последствиях использования изофлюрановая грызунов являются противоречивыми. Это может быть тератогенными, но только если администрируется на концентрации анестетика для многих часов или несколько дней. В нашем эксперименте время обследования беременных крыс был менее чем за 30 минут, поэтому мы не нашли каких-либо неблагоприятных эффектов в любом беременных крыс или их потомство.
Мы хотели бы, чтобы нашли больше сходства с УЗИ оценки репродуктивного тракта у женщин, в которых есть четкие эхогенная различия между фолликулярной фазы, periovulatory и секреторной фазы, но такие изменения не были замечены в крыса модели. Этот факт можно объяснить, потому что этапы только последние четыре-пять дней цикла эструса крыса. Короткие эструса фазы цикла и периоды беременности делают крыса идеальным животным для исследований на воспроизведение5. Тем не менее, этот факт может быть причиной, почему существует никаких существенных различий в диаметре рога матки, эндометрия толщины и диаметра яичников на этапах эструса и не течки. Это трудно принять измерений в ровно в нужное время для выяснения различий, и несмотря на проведение измерений каждый день, мы не обнаружили существенных изменений.
Несмотря на вышеупомянутые ограничения мы предлагаем использование УЗИ для мониторинга изменений в репродуктивной системе, включая толщину и морфология репродуктивных органов. Мы можем подтвердить это использование УЗИ, потому что толщина эндометрия в 8-недельных Sprague-Dawley крысы как измеряется histopathologically (один слой 359.13 ± 49.70 мм), Цзин и др. 7 похож на результаты здесь. Несмотря на различные методы для измерения толщины эндометрия, histopathologically и sonographically мы получили аналогичные результаты. Хотя сила Doppler и цветные Doppler были использованы на беременных крыс за несколько лет8,9, там было несколько расследований, измерения потока крови маточных артерий в небеременных крыс. Сейчас с развитием УЗИ, мы можем воспользоваться этой техники для мониторинга изменений в репродуктивного тракта во время каждой другой стадии, даже в самом начале беременности.
Будущего применения ультразвука может включать изучение механизма имплантации эмбриона и лечения тонких эндометрия в животных моделях крыса. Кроме того путем наблюдения за характеристики развивающихся фолликулов, мы можем получить более всесторонние знания об их функции в модели яичников трансплантации. В настоящее время есть несколько исследований, с использованием 3D визуализации и молекулярных УЗИ органов репродуктивной системы крыс10, и мы будем применять эту технику на тонком эндометрии модели в будущем.
Мы можем сделать вывод, что крыса является подходящей модели для изучения динамики репродуктивный орган, с помощью чрескожной УЗИ био микроскопия, которая не требует жертву животного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано животных экспериментов раздел Университета Мурсии и акушерства и гинекологии департамента Мурсия университета. Мы благодарим всех техников, работающих в CEIB (экспериментальный центр Ан Investigaciones Biomédicas), в разделе экспериментов на животных Университета Мурсии, которые сотрудничали на этот проект.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo3100 high-resolution in vivo micro-imaging system* | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Vevo integrated rail system including physiological monitoring unit. | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| MX400 Transducter | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Vevo Lab Software | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| HSD: Sprague Dawley SD | Envigo, inc. | Rat strain | |
| Lubricating Gel | General Supply | ||
| CIBERTEC CA-EAC20 Anesthesia Trolley System | Cibertec S.A | Anesthesia Machine | |
| Ecogel 100 ultrasound gel | Eco-Med Pharmaceuticals Inc. | ||
| Hair removal lotion (Nair) | General Supply | ||
| Isoflurane | Esteve Veterinaria | Inhalatory anesthesia | |
| * Required software is Vevo software including B-Mode application, pulse wave Doppler application, and vascular strain analysis tools package. |
References
- Hunter, R. K. II, et al. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cell Effects on a Rodent Model of Thin Endometrium. PLoS ONE. 10 (12), e0144823 (2015).
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nat Rev Genet. 7 (3), 185-199 (2006).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. C. Murine Echocardiography and Ultrasound Imaging. J Vis Exp. (42), (2010).
- Lohmiller, J. J., Swing, S. P. Reproduction and Breeding. The Laboratory Rat. , 2nd, Elsevier Academic Press. 147-164 (2006).
- Jaiswal, R. S., Singh, J., Adams, G. P. High-resolution ultrasound biomicroscopy for monitoring ovarian structures in mice. Reprod Biol Endocrinol. 7 (69), (2009).
- Kim, G. H.
- Jing, Z., Qiong, Z., Yonggang, W., Yanping, L. Rat bone marrow mesenchymal stem cells improve regeneration of thin endometrium in rat. Fertil Steril. 101 (2), 587-594 (2014).
- Mu, J., Adamson, S. L. Developmental changes in hemodynamics of uterine artery, utero- and umbilicoplacental, and vitelline circulations in mouse throughout gestation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (3), H1421-H1428 (2006).
- Anderson, C. M., Lopez, F., Zhang, H. Y., Pavlish, K., Benoit, J. N. Reduced uteroplacental perfusion alters uterine arcuate artery function in the pregnant Sprague-Dawley rat. Biol Reprod. 72 (3), 762-766 (2005).
- Hongmei, L., et al. Ultrasound Molecular Imaging of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 Expression for Endometrial Receptivity Evaluation. Theranostics. 5 (2), 206-217 (2015).
