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Behavior

颅脑损伤后大鼠行为缺陷的检测

Published: January 30, 2018 doi: 10.3791/56044
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

在这里提出的行为测试的目的是检测脑外伤后大鼠的功能性缺损。四具体的测试表明, 检测行为的缺陷, 以反映对特定脑区的损害, 有时延长到一年后受伤。

Abstract

随着创伤性颅脑损伤在平民和军人中的发病率不断上升, 脑外伤现在被认为是一种慢性疾病;然而, 很少有研究对损伤的长期影响的啮齿动物模型的创伤。这里所示的行为措施是在创伤后早期研究中建立的, 如两周, 直到两个月。这些方法中的一些以前被用于损伤后的后期, 长达一年, 但很少实验室。这里展示的方法是一个简短的神经学评估, 以测试反射, 平衡木平衡测试平衡, 光束步行到测试平衡和马达协调, 和工作记忆版本的莫里斯水迷宫, 可以敏感的赤字引用内存。在接受旁液体撞击伤 (外国证券) 或假损伤之前, 对雄性大鼠进行了神经、平衡和运动协调试验的处理和预训练。大鼠可以在短神经学评估 (neuroscore), 平衡木平衡, 和梁走多次, 而在水迷宫测试只能做一次。这种差异是因为老鼠能记住这项任务, 因此如果在同一动物身上反复试验, 就会混淆结果。在受伤后的一到三天的测试中, 在所有三非认知任务中检测到显著的差异。然而, 在以后的时间点 (3 月后), 光束行走任务的差异是不可探测的。在3月的平衡木平衡和6月的 neuroscore 中发现了赤字。在受伤后的12月内, 工作记忆中的赤字被检测出来, 而在12月的时间里, 一个参考记忆的缺陷就出现了。因此, 标准行为测试可以是有效的措施, 持续行为赤字后, 外国证券投资。

Introduction

本文所提出的方法是为了检测大鼠脑外伤实验模型诱发的大脑特定区域的功能缺损。四不同的行为测试将被描述。首先, 短神经学评估, 称为 neuroscore, 可以在不需要任何专门设备的情况下进行, 但需要实践;这个测试检测反射的缺陷。其次, 平衡木平衡测试检测到平衡能力的缺陷。此任务要求处理程序根据序号比例对 rat 进行评分, 并需要对处理程序进行一些培训。平衡木平衡测试需要一个狭窄的光束, 并且对前庭系统的缺陷很敏感。第三个测试评估 vestibulomotor 协调。这项试验被称为 "波束行走" 任务, 虽然需要对大鼠进行一些预训练, 但这一过程比前两种方法更客观, 因为通过光束的潜伏期是不依赖于主观评分的客观措施。这种差异是因为测量了穿过窄光束到达一个安全箱的时间。光束行走试验需要比光束平衡更长的光束, 以及一个逃生箱。这项测试测量两种运动协调和平衡的缺陷, 因此对小脑和与运动神经相关的脑区的损伤敏感。工作记忆版本的莫里斯水迷宫 (MWM-WM) 主要测试海马功能和与前额叶皮质或执行功能的整合。所示的莫里斯水迷宫的版本也可以用来检测参考内存中的缺陷1。

这些方法是根据他们在文献中建立的良好记录而选择的。每一个都是有效的, 从不同的实验室与多个品系的大鼠在许多年的研究。然而, 在过去, 受伤后长达两周的伤害措施被认为是 "慢性" 时间点。因此, 为研究鼠脑外伤的慢性影响, 建立行为技术, 这些众所周知的方法需要评估灵敏度, 以检测损伤后较长时间点的创伤后诱发缺损。目前已有几种啮齿类动物模型, 该模型是应用最广泛的一种, 并在本研究中得到运用。此模型在1950的2中首次发布, 此后, 超过1000篇论文在大鼠中使用了 "3"。这种类型的伤害的神经病已经很好地描述了我们的4和其他5,6,7。简言之, 在损伤后的短时间内, 海马神经元的损伤表现为剂量依赖性,即, 24-48 小时;虽然严重萎缩和空化包括内囊和皮质的变薄, 在受伤后一年报告6,7。

大脑功能的最有意义的表现是通过在实验性脑损伤后使用行为结果测量来评估的。然而, 绝大多数的外国证券投资试验使用行为的结果, 使措施相对较早, 通常从1到14天后受伤。使用此处演示的方法, 某些行为缺陷可以在损伤后12月内检测到1。神经功能, 总 vestibulomotor 功能, 和精细运动协调评估后受伤天数 (pid) 1-3 和在 3, 6, 和12月后, 手术, 使用短期神经评估 (Neuroscore; 从 Schallert 修改8),平衡木平衡任务, 和光束遍历任务9,10,11。参考和工作记忆使用的工作记忆版本的莫里斯水迷宫1,12,13。

Protocol

所有动物实验都是由德克萨斯大学医疗科的机构动物保育和使用委员会批准的, 这是由美国国立卫生研究院关于实验室动物的护理和使用指南 (第八版,国家研究委员会)。

1. 外科手术和液体撞击

  1. 获得成年男性300克大大鼠从供应商和房子两个每笼与食物和水的ad 随意在一个 vivarium 的恒定条件: 光周期 (600 小时到1800小时), 温度 (21 ° c 到23° c), 和湿度 (40-60%)。
  2. 手术前, 处理三至五天的大鼠, 然后训练大鼠的 Neuroscore, 平衡木平衡, 和光束行走的程序, 从一个到三天之前, 基线评估。在手术前一天或早上进行基线评估。
    注意: 总是准备控制大鼠, 如假手术或手术的天真大鼠, 与那些将受到伤害的方式一样, 无论是随机或平衡的方式, 将大鼠分成治疗组。
  3. 在无菌条件下进行手术 (无菌器械、清洁的手术服、无菌手套、口罩和头罩)。
  4. 麻醉鼠使用异氟醚在4% 的诱导和 1.5-2% 的维护。气管插管和机械通气大鼠 (在空气中使用异氟醚: 氧气 (70:30) 和准备旁流体-打击伤害, 如先前所描述的14,15。
  5. 在从麻醉苏醒之前, 先在缝合前插入 0.10% bupivicane 的伤口部位, 然后放入直肠扑热息痛栓剂 (120 毫克/千克)。在恢复期和次日监测大鼠至少4小时的感染体征、严重神经损伤 (如麻痹) 或严重不适 (如持续睡鼠位置)。
    注: 出现上述任何症状的老鼠应被安乐死 (4% 异氟醚在麻醉室, 其次是斩首)。

2. Neuroscore 培训和测试

  1. Neuroscore 培训
    1. 对于已知为实验性幼稚的大鼠进行训练, 按以下顺序运行测试 (步骤 2.2. 1-2. 2.5) 从开始到结束, 返回到家笼为1分钟, 然后重复直到达到零分。
    2. 在评分表上标明每只老鼠的训练试验记录。训练后, 在同一天或次日执行一个测试会话 (见下文)。
      注意: 如果测试会话没有为基线生成零分, 训练和测试可能会重复, 或者可能被转到非行为实验中。
  2. Neuroscore 测试
    注: 按以下顺序运行测试, 返回主笼1分钟, 然后重复两次, 总共三次。
    1. 前肢屈曲试验
      1. 抬起老鼠的尾巴, 在桌子表面上方保持大约 6-12 英寸。
      2. 观察老鼠是否伸展或弯曲前肢。评分的存在屈曲 (1) 或缺席 (0)。
        注意: 屈曲是不正常的。可能的比分 1 x 3 = 3 (总可能 = 3)。
    2. 后肢屈曲试验
      1. 抬起老鼠的尾巴, 在桌子表面上方保持大约 6-12 英寸。
      2. 观察鼠是否延伸或弯曲后肢。评分的存在屈曲 (1) 或缺席 (0)。
        注意: 屈曲是不正常的。可能的比分 1 x 3 = 3 (累计总可能 = 6)。
    3. 视觉触发的放置测试
      1. 用尾巴把老鼠抬起来。
      2. 慢慢地把老鼠放到桌子的边缘, 直到鼻子从边缘10厘米左右。
      3. 移动鼠慢慢向边缘 (不允许胡须触摸边缘)。
      4. 观察老鼠是否到达并向桌子延伸前爪。得分的存在 (0) 或缺席 (1) 的扩展前爪。
        注意: 到达表格是为了响应视觉提示是正常的。可能的比分 1 x 3 = 3 (累计总可能 = 9)。
    4. 触点触发放置测试
      1. 握住老鼠, 手里拿着身体, 平行于桌边和前肢自由。
      2. 慢慢地把老鼠放到桌边, 直到一侧的胡须接触到桌子的边缘。
      3. 观察老鼠是否在胡须接触的同时, 将前肢延伸到与桌子边缘接触的胡须上。
        注意: 这一反应的启发需要大量的实践, 研究人员需要经过良好的训练才能始终如一地执行这个测试。
      4. 得分的存在 (0) 或缺席 (1) 接近表。
        注意: 对触觉刺激的反应是正常的。可能的比分 1 x 3 = 3 (总可能 = 12)。
      5. 重复步骤 2.2. 4.1-2.2. 4.4 对另一侧。可能的比分 1 x 3 = 3 (累计总可能 = 15)。
    5. Hindpaw 抓取反射试验
      1. 一只手用拇指和食指握住老鼠的前肢。
      2. 用另一只食指轻轻触碰 hindpaw 的手掌。
      3. 观察老鼠是否掌握食指。得分的存在 (0) 或缺席 (1) 的抓取。
        注意: 抓取是正常的。可能的比分 1 x 3 = 3 (总可能 = 18)。
      4. 重复步骤 2.2. 5.1-2.2. 5.3 对另一侧。可能的比分 1 x 3 = 3 (总可能 = 21)。
    6. 得分
      1. 对可能累积的 7 x 3 = 21 的总分求和。分数为零是正常的。

3. 平衡木训练和测试

  1. 设备
    1. 使用60厘米长的光束, 1.75 厘米宽, 4.0 厘米高, 设置90厘米的地板, 有一个屏障30厘米的高度, 30 厘米宽。将横梁固定在带有障碍物的桌子上, 使50厘米的光束从障碍物凸出, 远离桌子。
    2. 在梁下放置一个软垫的安全箱, 以软化下降的老鼠的影响。
  2. 平衡木平衡训练
    1. 在手术前24-48 小时, 将老鼠放在横梁上进行六十年代的试验。
    2. 如果老鼠不能自己平衡, 让老鼠掉进安全箱。
    3. 当老鼠安全地放置在光束上时, 开始计时。
    4. 观察大鼠在六十年代期间和率它的表现根据以下标度: 1 = 显示稳定的平衡 (新郎, 步行, 试图攀登障碍), 2 = 显示摇晃的平衡 (掌握边横梁并且/或者有不稳定的运动), 3 = 设法平衡, 但滑动 or 在横梁上旋转, 通过拥抱横梁垂悬, 4 = 设法平衡, 但跌倒在十年代以后, 5 = 垂悬或从横梁和跌倒在十年代之下, 6 = 跌倒, 不努力平衡或垂悬对光束。
    5. 在工作表上记录分数。
    6. 允许鼠年休息十五年代在家里的笼子里, 然后重复步骤 3.2. 1-3. 2.5 直到老鼠达到三分数1或2。这只老鼠被认为是训练有素的。
    7. 在手术前24小时或手术当天进行一项预评估。
  3. 平衡木平衡测试
    1. 手术后24小时开始, 持续4天, 每天检查大鼠。
      1. 把老鼠放在横梁上, 开始计时。密切观察鼠年六十年代. 在工作表上记录分数。
      2. 把老鼠放回家里的笼子里休息一段时间 (1-3 分钟)。
      3. 重复步骤 3.3. 1.1-3.3. 1.2, 共三项测试。

4. 光束行走训练和试验

  1. 设备
    1. 使用100厘米长的木梁, 宽2.5 厘米, 高4.0 厘米。
    2. 准备一个可调节的立场, 一个可调节的表, 和四钉, 2 厘米高, 和一个黑色的目标框28厘米长, 18 厘米的高度, 和18厘米的宽度, 一个开放的一端足够大的老鼠通过。
    3. 将光束的目标端连接到位于可调表上的目标框的开边。在光束的起始端附近放置明亮的光和白噪声发生器。梁的起始端固定在可调的支架上, 因此横梁和箱体处于同一水平, 地板上方约1米。
  2. 光束步行训练
    1. 手术前24-48 小时开始训练
    2. 把老鼠放在球门箱里1分钟。1分钟后, 取出鼠, 开始试验。
    3. 要开始试验, 打开灯和白色的噪音, 并放置在梁的位置上的 peg 孔最接近目标框, 让老鼠进入目标框。
    4. 当老鼠的前足越过球门框的门槛时, 立即关掉光源和噪声源 (这是一个试验的结束)。
    5. 允许老鼠在每个试验之间的三十年代的目标框中休息。
    6. 重复步骤 4.2. 3-4. 2.5 两次在每个 peg 位置和从起始位置。插入孔中的销子, 并运行一个完整的光束-步行与钉到位。
    7. 运行三定时光束行走试验。
      1. 把老鼠从球门盒里移开。打开灯和白色的噪音, 并启动秒表时, 放置在梁上的老鼠。当老鼠的前脚越过球门框的门槛时, 立即停止观看, 然后立即关掉灯和噪音。
      2. 记录工作表上的时间。
      3. 重复步骤 4.2. 7.1-4.2. 7.2 直到大鼠达到三秒或更少。这只老鼠现在被认为是训练有素的。
  3. 梁式行走基线评估
    1. 在手术前的一天或早上, 做三定时试验与钉到位。
    2. 首先把老鼠放到三十年代的目标盒子里. 将老鼠从球门盒中取出, 打开白色的噪音和光线。把老鼠放在梁的开始端, 同时开始停止观看。当老鼠的前足越过球门框的门槛时, 立即关掉灯和噪声源, 停止计时器。
    3. 记录工作表上的时间。让老鼠留在三十年代的目标框里。
    4. 重复步骤 4.3. 2-4. 3.3 直到在工作表上记录三延迟。在三定时试验完成后, 将鼠返回到主笼中。
  4. 光束行走试验
    1. 检查大鼠每天24小时后开始手术, 持续4天。执行三次计时试验, 如步骤4.3 所示。

5. 工作记忆水迷宫

  1. 设备
    1. 使用一个装满水的水箱, 高度为28厘米, 保持在26±1° c。
    2. 使用一个透明的丙烯酸玻璃平台, 是10厘米直径在一个立场26厘米高。
      注: 平台的顶部表面应涂上带有 X 的圆的形状的硅。这使得老鼠爬上平台, 并给他们牵引, 所以他们不会溜走。
    3. 收集一个秒表, 一个热灯, 一次性毛巾, 吸水垫, 额外的笼子, 和一个小的, 长期处理鱼缸鱼网。使用计算机视频跟踪系统, 连接到摄像机, 记录鼠游泳和发送数据到计算机。保存计算机上的视频和数据以便以后进行分析。
  2. 工作记忆水迷宫测试
    1. 给老鼠四对试验每天连续五天, 安置平台在每个四个象限并且开始老鼠从每个四出发点 (N, S, E, W) 如下所述。
    2. 首先定义在整个实验中使用的起始位置-平台对。
      注意: 平台所在的象限的顺序和使用的起始点需要在五天游泳的每一个不同的顺序, 但同样为每只老鼠。
      1. 使用四起始点 (N、S、E 或 W) 和四平台位置 (象限1、2、3或 4;图 1)。例如, (N, 2;E, 4;S, 1;W, 3;请参见图 1)。计划一个平衡的顺序 (不是随机的), 以避免起点太接近平台 (没有起点是同一个象限作为平台位置)。使用平台象限和四起始点设置数据表。
      2. 为视频跟踪软件编写一个协议, 用于视频的老鼠游泳和收集指定的数据 (例如, 游泳的时间, 速度, 在找到平台之前旅行的距离)。
        注意: 跟踪软件将在指定的持续时间后自动停止记录。该协议应允许指定平台的放置位置、每种动物要运行多少次试验以及每个会话将测试多少动物以及允许的最大持续时间 (例如、120s)。
      3. 每届试验4-6 只老鼠。
        注: 超过6只老鼠在老鼠之间产生了一个问题, 并可能导致处理错误。变暖的箱子也变得拥挤不堪。
    3. 试用1
      1. 打开视频跟踪软件并加载正确的协议, 包括水迷宫地图。
      2. 将平台放置在指定的位置 (例如, 2;图 1)并检查它是否与软件中的地图匹配。当老鼠进入摄像机视野时, 准备追踪软件开始。
      3. 将鼠置于所指定位置的壁面上 (例如, N;图 1)并立即启动计时器。
      4. 让老鼠120s 找到平台。当老鼠找到平台时, 停止计时器并记录工作表上的时间。如果老鼠找不到站台, 用手把它带到平台上, 并记录 120s. 允许鼠年十五年代留在平台上。
    4. 试用2
      1. 检查软件是否已准备好试用2。将鼠放回同一起始位置 (N) 的水箱中。重复步骤5.2.3.4。
    5. 试验2后, 将大鼠放在加热箱内4分钟, 将平台移至第二位置 (4;图 1), 并检查它是否与软件中的映射匹配。
    6. 重复试验1和2程序 (步骤 5.2. 3-5. 2.4), 直到所有四起始位置/平台配对完成。

6. 数据分析

  1. Neuroscore
    1. 手动将手写结果传送到计算机电子表格。
    2. 总结每项试验的结果, 每只老鼠每天获得三分。
    3. 将数据的格式设置为统计分析 (以长或宽格式, 具体取决于软件首选项)。
      注意: 长格式有一个处理的单列 (在这种情况下, 用 "天真", "假", 或 "脑外伤"), 一列的一天 (在这种情况下, "0", "1", "2" 或 "3"), 和一个单列的审判 (或 "1", "2" 或 "3")。宽格式有一列为每个因素水平的组合 (因此一列为天真, 天 0, 试验 1, 另一列为天真, 天 0, 试验 2,等等)
    4. 平均每只动物每天的得分。由于每天都有三项试验, 每只动物每天有三项价值。
    5. 评估数据是否正常分布。使用非参数统计 (例如, 克鲁斯卡尔-瓦利斯) 测试来分析每一天的分数是否在不同的组之间。在这种情况下, 由于这些数据不是连续的, 所以它们通常不会被分发。
    6. 若要确定差异所在的位置, 请执行后期测试, 如 Tukey 的后 hoc分析。
      注: 在这里, R 统计软件包16, 克鲁斯卡尔, 测试 () 函数和 posthoc.kruskal.nemenyi.test 函数在对平均秩包 (PMCMR)17的配对多个比较中使用。
    7. 此外, 测试每个组中的天数是否存在差异。
      注: 例如, 要查看假动物在0天的行为是否与1天、2天或3天的不同。为此, 请运行单向重复测量方差分析。这可以在 R 中使用 ezANOVA 函数在 ez 包中完成。
    8. 要运行重复测量方差分析, 首先检查关于度的假设。
      注: 在这里, 数据表明, 内因子 (天) 确实符合度的假设为天真和假, 但不是为脑外伤。因此, 对幼稚或虚假的更正是不必要的。对于脑外伤的数据, 使用温室 Geisser 校正。
    9. 如果发现了显著的差异, 请运行后 hoc测试以确定差异所在。这是在 R 中使用配对t测试函数实现的。将结果绘制为方框图, 如代表性结果 (图 2) 所示。
  2. 光束平衡
    1. 手动将手写分数转换为计算机电子表格。格式化数据进行统计分析 (以长或宽的格式, 具体取决于软件偏好)。请参见步骤6.1.3 中的注释。
    2. 平均每只老鼠每天的得分, 这样每只老鼠每天就会有一个分数。要测试每天的分数是否与天真、虚假和创伤性脑损伤不同, 评估数据是否正常分布。
      注意: 在这种情况下, 由于数据不是连续的, 这些数据通常不会被分发。因此, 使用非参数统计测试 (例如, 克鲁斯卡尔-瓦利斯测试)。
    3. 要确定差异所在, 请执行后 hoc测试,例如、Tukey 的后 hoc分析。若要测试每个治疗组内天数之间的差异, 请运行单向重复测量方差分析 (请参见步骤 6.1.7)。检查关于度的假设。
      注: 在本研究中, 数据表明, 内因子 (天) 不符合度假设的任何组, 因此使用的连续性修正。使用温室格里尔的连续性校正。
    4. 按代表性结果 (图 3) 中显示的方框图绘制结果。
  3. 光束行走
    1. 手动将手写结果传输到计算机电子表格。平均每只动物每天三束行走的潜伏期。为统计分析设置数据格式 (参见步骤 6.1.3)。
    2. 评估数据是否正常分布。
      注意: 在这种情况下, 数据是连续的, 并且通常是分布的。因此, 使用单向方差分析来确定是否每天的延迟在天真、虚假和创伤性脑损伤之间是不同的。
    3. 要查看治疗组内天数是否有差异, 请运行单向重复测量方差分析。首先检查关于度的假设。
      注: 在本研究中, 数据表明, 内因子 (天) 不符合度假设为我们的任何群体, 因此, 使用连续性校正。使用温室格里尔校正。
    4. 按代表性结果 (图 4) 中显示的方框图绘制结果。
  4. 工作记忆水迷宫
    1. 将数据从工作表或计算机跟踪程序传输到电子表格。选择要分析的结果。
      注意: 许多可能的结果可从计算机跟踪程序进行分析。选择用于分析的结果的示例可能包括: 滞后时间、路径长度、thigmotaxia 和游速。最常报告的结果是滞后时间, 如所提供的示例所示。
    2. 格式化数据进行统计分析 (以长或宽的格式, 具体取决于软件偏好)。
      注意: 长格式有一列用于治疗 (在这种情况下, 用 "天真", "假", 或 "脑外伤" 填充), 一天的单列 (在本例中为 "1"、"2"、"3"、"4" 或 "5") 和一列用于试用 ("1"、"2"、"3"、"4"、"5", "6", "7", 或 "8")。我们还需要一个额外的列来标识尝试 ("1" 或 "2")。宽格式有一列为每个因素水平的组合 (如此例如, 一列为天真, 天 1, 试验 1, 尝试 1, 另一列为天真, 天 1, 试验 2, 尝试 2)。此外, 试验1和试验2之间的差异可以计算每届会议和分析为一个差异评分。
    3. 要确定受伤组之间是否存在总体差异, 请执行以下步骤。
      1. 首先, 平均1天每种动物的水迷宫潜伏期。
        注: 每一天有四次疗程, 因此每种试验1和试验2每只动物的平均四值。对剩余天数也进行此计算。
      2. 为检查损伤的总体差异, 运行双向重复测量方差分析。有两个因素, 受伤和一天。伤害是一个群体因素和日之间的一个群体因素。注: 这里使用 R。
      3. 如果结果表明由于受伤而有显著差异, 则运行 Tukey 的后 hoc测试以查看差异所在。
    4. 为了查明在特定天数内受伤组之间是否有差异, 请执行以下步骤。
      注意: 以1天为例, 需要在接下来的几天中进行相同的分析。此外, 这项分析是以几种方式进行的, 首先是1审判, 第二次是审判 2, 第三个是审判1和审判2之间的差额。试用1作为一个例子;其他分析也需要使用相同的步骤。
      1. 首先, 平均1天每种动物的水迷宫潜伏期。因为每天有四重复的 "试验 1", 平均每种动物的四值。
      2. 评估数据是否正常分布。
        注意: 在这种情况下, 数据是连续的, 并且通常是分布的。因此, 使用单向方差分析来确定1天的水迷宫潜伏期是否不同于天真、虚假和创伤性脑损伤。R 统计软件包和 aov () 函数在这里使用。
      3. 使用5% 级的意义。如果生成的p值小于 0.05, 则组之间存在显著差异。
      4. 要确定这些差异所在的位置, 请使用 Tukey 的后 hoc测试。这是 R 中的 TukeyHSD () 函数。
    5. 要查明治疗组内天数是否有差异, 请按照下列步骤操作。
      1. 首先, 运行单向重复测量方差分析。这可以在 R 中使用 ezANOVA 函数在 ez 包中完成。
      2. 在运行重复测量方差分析之前, 首先检查关于度的假设。
        注意: 内因子 (天) 满足所有组的度假设, 因此不需要使用连续性更正。
      3. 如果发现天数之间的差异 (p-值小于 0.05), 则运行后 hoc测试以确定差异所在的确切位置。此步骤是在 R 中使用配对. t 测试函数实现的。
    6. 使用折线图 (图 5) 来绘制结果。此外, 试用 1-试用2可以图表。

Representative Results

neuroscore 过程的结果 (图 2) 显示了假阳性 (在0天) 的潜在可能性, 以及此检测对细微差异的敏感性。当老鼠不习惯于程序的时候, 就会出现假阳性, 所以不完全放松。0天是在手术之前, 因此, 理想的情况下, 所有的老鼠都应该达到0之前进入一个研究的评分标准。1-3 天演示了此测试的灵敏度, 以检测分数的细微变化。虽然有一个分数高达21的潜力, 在这个模型中, 分数高于3是不寻常的。在本例中, 重复测量方差分析显示天真 (p = 0.78) 或假 (p = 0.09) 之间的天数之间没有差异;然而, 对于脑外伤组, 天 (p < 0.05) 之间存在差异。后期配对比较表明0天与1、2和3天有很大的不同。这一结果表明, 损伤在神经学评估中产生了微小而显著的变化。

进一步分析使用克鲁斯卡尔-瓦利斯测试比较天真, 假, 和脑外伤的每一天, 其次是 Tukey 的后 hoc测试, 以确定确切的差异所在。在0天, 测试统计为 13.37, p = 0.001, 假与天真有明显的不同 (p = 0.008)。理想情况下, 0 天的组之间不应该有任何区别, 因为没有治疗或程序被管理。在这种情况下, 老鼠应进一步习惯于程序, 或转移到一个非行为研究。在1天, 测试统计为 32.39, p = 9.75e-8, 带有后 hoc测试, 表明假和脑外伤与天真 (p = 0.002、 p = 5.9e-7 分别) 有明显的不同。在2天, 测试统计为 23.39, p = 8.34e-6, 假和脑外伤与幼稚不同 (p = 0.002, p = 6.8e-5)。在3天, 测试统计为 38.4, p = 4.59e-9, 再一次, 假和脑外伤与幼稚有显著差异 (p = 0.001, p = 2.1e-8, 分别)。这些结果表明, 假制剂也产生一些缺陷的神经评估在早期的创伤后的时间。

典型的平衡木平衡结果 (图 3) 在损伤后不久 (图 3, 左) 和在损伤后的时间点 (图 3, 右) 显示平衡木平衡测试对赤字的敏感性。束平衡试验对脑损伤的敏感性随着时间的推移而减小, 因为当未受伤的大鼠老化和增重时, 它们在光束上的平衡增加了难度。在以后的时间点, 光束被转动, 因此老鼠是平衡在更宽的一侧的光束。然而, 在受伤后的6月, 这个测试不再对伤害的影响, 因为年龄和/或重量混淆执行任务的能力 (图 3, 右)。另外, 治疗可能发生在前庭系统, 这些数据准确地反映了大鼠的平衡能力达到与对照组相同的水平。

在比较天真、虚伪和脑外伤的每一天, 我们使用克鲁斯卡尔-瓦利斯测试。损伤后早期时间点的结果显示在图 3中, 左侧。在0天, 克鲁斯卡尔-沃利斯测试发现测试统计值为 6.81, p = 0.033。这些组之间有很大的差异, Tukey 的后 hoc测试表明, 天真的组不同于假 (p = 0.038);然而, 所有的三组都意味着远远低于 2.0, 这表明所有的老鼠都达到了继续的标准。最好在0天的组之间没有区别, 但由于所有组都低于 2, 他们可以继续在研究。在 PID 1 上, 克鲁斯卡尔-瓦利斯测试统计为 69.72, p = 7.25e-16。Tukey 的后发测试表明, 脑损伤组与天真和虚假组有显著差异 (p = 4.9e-14, p = 9.1e-08, 分别)。在2天, 克鲁斯卡尔-瓦利斯测试统计为 62.84, p = 2.26e-14, 具有后 hoc测试, 显示不同于天真和虚假 (p = 1.0e-10, p = 2.1e-10 分别) 的创伤。在3天, 克鲁斯卡尔-瓦利斯测试统计为 62.69, p = 2.44e-14。后 hoc测试显示了不同于天真和虚假的创伤, (p = 9.6e-12, p = 1.7e-08, 分别)。此外, 我们还查看了每个组中的天数是否有差异。使用重复的度量方差分析, 对于天真, 天之间没有区别 (p = 0.367)。对于假和脑外伤有不同的天数之间的差异 (p = 0.002, p = 3.90e-29, 分别)。为假1显示的后 hoc配对比较与2天和3天 (p = 0.001) 显著不同p = 0.01, 分别), 而对于脑外伤, 天0是显着不同的形式天 1, 2 和 3 (p < 2 e-16,p = 5.5e-16, 分别为p = 2.7e-13。1天也明显不同于3天 (p = 0.036)。

在受伤6月后, 每天使用克鲁斯卡尔-沃利斯测试 (图 3, 右) 对天真、虚假和脑外伤进行比较。在0天, 测试统计的值为 3.36, p = 0.187, 因此在0天没有差异。所有的方法都低于 2, 这表明所有的老鼠和团体都符合在研究中继续的标准。在 PID 1 上, 测试统计为 6.11, p = 0.047;但是, 使用 Tukey 的后 hoc测试的后 hoc分析表明, 在对多个假设测试进行核算时, 这些组都没有显著差异。在2天, 测试统计为 4.09, p = 0.13, ns, 在3天, 测试统计为 2.91, p = 0.23, ns。因此, 在任何一天的伤害组之间没有区别。

此外, 观察治疗组内天数之间的差异, 反复测量方差分析显示, 天真、虚假和脑外伤的天数有显著差异 (p = 0.0003, p = 2.61e-5, p = 5.59e-7, 分别为:图 3, 右)。后 hoc测试演示了以下差异。对于天真来说, 0 天与1、2和3天有很大不同 (分别为p = 0.002、 p = 0.044、 p = 0.004。对于假, 所有的日子都有明显的不同: 天0是显着不同的天 1, 2, 和 3 (p = 0.0006, p = 0.001, p = 0.0006, 分别);1天与天2和3有明显不同 (分别为p = 0.031、 p = 0.0006);2天与3天显著不同 (p = 0.044)。对于脑外伤, 0 天是显着不同的天 1, 2 和 3 (p = 0.0005, p = 0.0008, p = 0.0005, 分别)。

光束遍历测试的结果显示在两个时间点 (图 4)。与平衡木的平衡类似, 这项测试在受伤后及早检测出赤字 (图 4, 左侧)。然而, 在受伤6月后, 各组之间没有显著差异 (图 4, 右), 建议在受伤组中发生愈合。这一结果可能反映了更先进的年龄和增加的体重的影响。

为了比较单纯的、假的和外伤后每天的脑外伤, 采用了单因子方差分析方法。在0天 (F = 0.859, p = 0.426) 上没有差异, 所有延迟都低于5秒, 这表明所有的老鼠都符合在研究中继续的标准。在 PID 1, 有一个重要的测试统计为 15.36, p = 1.18e-6。Tukey 的post测试表明了脑外伤和单纯性 (p = 0.000004) 和脑外伤和假 (p = 0.0001) 之间的显著差异。在2天, 组之间存在显著差异 (F = 9.49, p = 0.0002)。后 hoc测试揭示了脑外伤和单纯性 (p = 0.0002) 和脑外伤和假 (p = 0.005) 之间的差异。在3天, 总体测试统计值等于 6.27, p = 0.0025, 表示组之间存在差异。Tukey 的后 hoc测试显示, 脑外伤与单纯的和假的不同 (p = 0.003, p = 0.035, 分别)。

采用单向重复测量方差分析, 探讨治疗组内天数的差异。首先检查每个组的度的假设。内部因素 (天) 不符合度假定为天真或假小组, 因而连续更正, 温室-格里尔被申请了对那些小组。对于假, 在天之间没有区别 (p = 0.066), 为天真和脑外伤有 (p = 0.006, p = 2.89E-7, 分别)。后 hoc比较显示为天真, 差异介于0天和1天之间 (p = 0.003)。为创伤性脑损伤, 区别是在天0和天之间 1, 2 和 3 (p = 9.2e-6, p = 0.0005, p = 0.002, 分别), 并且有区别在天1和天3之间 (p = 0.018)。

在受伤后6月, 在任何一天 (天 0, F = 0.315, p = 0.732;1天, F = 0.336, p = 0.717;2天, F = 0.5, p = 0.61;3天, F = 1.17, p = 0.322;图 4, 右)。当比较每个组内天数之间的差异时, 在脑外伤组 (p = 0.026) 中有显著差异, 日0与1、2和3天不同 (p = 0.026, p = 0.002, p = 0.002)。对于天真或虚假的任何天数 (p = 0.104、 p = 0.063 分别) 没有任何区别。

来自莫里斯水迷宫工作记忆版本的数据可以用不同的方式绘制出来。在这里, 我们演示了3月的结果 (图 5, 左) 和12月 (图 5, 右) 受伤后使用两个折线图来表示时间过程, 并通过方框图来提供数据的总体汇总 (数字 5, 底部)。然后, 我们可以可视化试验1比较和试验2比较独立于每一天, 以及整体的差异, 由于伤害。试验1潜伏期表示参考记忆和试验2潜伏期描述工作记忆。

损伤后3月鼠的数据显示在图 5中, 左侧。对于试用 1 (图 5, 左上角), 当比较天真, 假, 和脑外伤, 只有4天显示的组之间的显著差异 (F = 4.12, p = 0.025), 与后 hoc Tukey 的测试表明, 脑外伤是不同于天真 (p = 0.019)。对于试用版 2 (图 5, 中左), 在1天 (F = 5.93, p = 0.006) 上有显著的差异, 并带有后 hoc分析, 表明与假 (p = 0.005) 不同。在3月 (p = 0.56) 中, 重复测量方差分析未发现损伤组之间的总体差异。这些结果表明, 这些大鼠有小而严重的赤字, 以及工作记忆在3月后的损伤。

在受伤后12月, 比较试验1天真, 假, 和颅脑外伤 (图 5, 右), 重复测量方差分析显示了一个重大的整体影响的伤害 (F = 3.94, p = 0.03)。配对比较显示, 颅脑损伤与单纯性和假 (p = 0.043 和p = 0.006) 有显著差异 (图 5, 右下角)。此外, 通过比较每一天的伤害组, 使用单向方差分析, 在3天 (F = 7.28, p = 0.003) 中检测到显著的差异。后 hoc比较显示, 脑外伤与假 (p = 0.0018) (图 5右上角) 不同。在试验2中, 重复测量方差分析发现, 由于伤害 (F = 3.97, p = 0.029) 的差异很大, 与后 hoc配对比较检测脑外伤和假 (p = 0.017) 之间的差异 (图5, 右下角)。每天的单程方差分析在2和4天发现了显著的差异。在2天 (F = 4.02, p = 0.028), Tukey 的后 hoc测试发现, 脑外伤与假 (p = 0.023) 不同。在4天 (F = 4.12, p = 0.026) 上,后 hoc分析发现了脑外伤和假 (p = 0.025) 之间的区别 (图 5, 中间右)。

Figure 1
图1。水迷宫图.这张图展示了可能的平台位置 (1, 2, 3, 4) 和起始点 (N, S, E, W) 为工作记忆莫里斯水迷宫。老鼠可以从每个起始位置/平台配对中进行两次试验。有一个十五年代间试验间隔和4分钟休息在温暖的房间在两对试验共计四对每每日会议的试验。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。neuroscore 测试的结果.所有的老鼠在0天前接受了简单的反射测试任务 (有关训练、测试和评分的详细信息, 请参阅文本)。结果显示为中值 (黑线)、第一个和第三四 (框的边界) 和 10th和 90th分 (误差线)。这个平均值也被红线和外围点显示为黑点。数据被提出为天0基线和损伤后天1-3。对每个时间点的后 hoc t测试的结果显示在图表上: * p < 0.001 与颅脑损伤日 0;^ p < 0.001 与同一天的天真。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。梁平衡试验结果.所有的老鼠都经过训练, 在平衡木上保持平衡, 直到他们在六十年代连续三次试验中取得平衡 (关于训练、测试和评分的细节参见文本)。在随后的测试中, 大鼠的得分是从 1-6, 1 表示正常平衡, 6 表示没有试图停留在光束上。结果显示为中值 (黑线)、第一个和第三四 (框的边界) 和 10th和 90th分 (误差线)。这个平均值也被红线和外围点显示为黑点。数据显示0天基线评分, 受伤后天数 1-3 (左), 和6月后受伤 (右)。每个时间点的后 hoc t测试的结果都显示在关系图上。0-3 天: * p < 0.001 vs 天脑外伤 0; ^ p < 0.001 vs 同一天天真;@ p < 0.001 vs 同一天假。6月: * p < 0.001vs 天脑外伤 0; # p < 0.001 vs 天真日 0;& p < 0.001 与假日0。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图4。梁式行走试验结果.所有的老鼠都经过训练, 在柱子之间的横梁上穿行, 以避免进入一个安全箱。他们接受了训练, 直到他们在三连续的试验遇见了≤ 5 s 标准 (参见文本关于训练、测试和计分的细节)。基线测试在0天完成, 老鼠随后在受伤后1-3 天进行测试 (左)。在受伤后的6月内, 还有一组老鼠被重新测试 (右)。结果被绘成中值 (黑线)、第一个和第三四 (框的边界) 和 10th和 90th分 (误差线)。这个平均值也被红线和外围点表示为黑点。每个时间点的后 hoc测试的结果显示在关系图上。0-3 天: * p < 0.001 vs 天脑外伤 0; ^ p < 0.001 vs 同一天天真;@ p < 0.001 vs 同一天假;6月: * p < 0.001vs 天脑外伤 0.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图5。工作记忆的结果莫里斯水迷宫.结果显示在3月 (左栏) 和12月 (右栏) 的大鼠单独组。上部面板显示了在五测试日的两个试验配对的第一次试验中, 平均潜伏期 (在老鼠找到隐藏平台时所用的时间)。中间面板显示每一天的第二次试验的平均潜伏期。后 hoc分析的结果显示在图表上 (* p < 0.05 与同一天假; ^ p < 0.05 vs 同一天天真)。下部面板总结显示中位数 (黑线)、25th和 75th分 (框边界) 和 10th和 90th分 (误差线) 的结果。这个平均值也被红线和外围点显示为黑点。后 hoc分析的结果显示在关系图上 (*p < 0.05 与同一个试验假, ^ p < 0.05 vs 相同的试验天真)。请单击此处查看此图的较大版本.

Discussion

在进行任何类型的行为测试时, 保持一致是至关重要的。这个细节包括许多看似微不足道但对动物的反应有重大影响的考虑。一个不容忽视的重要步骤是, 在进行任何实验之前, 动物都要适应他们的家笼/住房状况。这种准备减少动物的生理应激反应的影响, 这可以改变行为的结果18。同样, 必须尽一切努力以同样的方式处理所有的动物。这种一致性包括, 如前所述, 适应住房, 也适应处理和交通之间的训练或测试前的房间。这个概念不能被夸大。草率的动物处理是灾难性的任何行为测试19。同样, 无论是在黑暗中还是在光周期中, 都需要在一天的同一时间对动物进行测试。对于此处讨论的测试, 在光照或暗阶段进行测试是可以接受的, 只要测试是一致执行的。在昼夜节律周期的不同时间进行的测试已经被证明可以改变行为结果18,20。此外, 处理程序以及动物必须在一个压力释放, 平静的状态, 以最大限度地提高结果的准确性。

特别是在 Neuroscore 的情况下, 假阳性和阴性是共同的。假阳性通常发生在动物没有完全习惯于处理和测试。动物必须完全放松, 所以观察到的反应是反身的, 而不是由于肌肉收紧而引起的压力或恐惧。紧张的处理可以通过向动物传递压力来影响结果。因此, 把老鼠抓得太紧或太松都可能会有问题。另外, 如果处理程序是紧张的, 这可能混淆老鼠的反应。还有一个风险, 没有经验的观察家会曲解老鼠的反应。良好的训练和大量的练习对 Neuroscore 的成功和一致性至关重要。

总的来说, 这些测试的主要关注点在于治疗组之间缺乏很大的差异, 有时也没有区别。由于动物对不同的处理程序、噪音、时间以及可能的季节21有不同的反应, 所以必须尽力减少所有可能的混杂因素。

在这里显示的平衡木平衡和束流任务的结果表明, 这些测试是有用的早期损伤后, 发现缺陷的 vestibulomotor 功能。这些缺陷通常会随着时间的推移而解决1,14。在这个模型中, 受伤后6月, 损伤引起的赤字已经解决。6月时间点的结果表明, 天真、虚伪或受伤的老鼠之间没有区别;然而, 所有的老鼠都在自家笼子里放松了6月, 变老, 发胖了。因此, 当他们在6月后的手术中重新测试 (或在幼稚的情况下是等价的), 他们基本上是变老和脂肪, 因此, 所有的组不执行, 以及他们相比, 他们的基线日0的结果。

另一个重要的考虑是, 使用的行为测试是正确的测试。例如, 这里使用的测试被认为代表了特定大脑区域的功能。一个例子是前庭系统, 这是重要的平衡。涉及运动功能的脑区, 如皮层包括运动皮质、丘脑、脊髓神经元、基底神经节、nigro 纹状体等, 都参与了 vestibulomotor 的协调。因此, 平衡木平衡或束流中的赤字表明了这些地区的潜在赤字。此外, 海马和前额叶皮层参与了由工作记忆水迷宫测试的学习记忆功能。即使选择了正确的测试, 也必须牢记所使用的测试的局限性。例如, 这里所提供的任何测试都不敏感于情绪上的缺陷, 如抑郁、焦虑或社会互动, 如侵略、决策或冲动。要重申, 必须选择适当的测试, 对行为和大脑区域进行评估。

必须谨慎地对待行为数据的解释和分析。强烈建议对每种类型的测试分别进行功率分析, 因为, 使用行为结果作为神经缺陷的量度, 是由于它的性质, 是一种微妙的影响的粗略量度。此外, 不同的测试需要不同类型的统计分析。例如, 所描述的 Neuroscore 和平衡木平衡测试依赖于对训练有素的观察者的解释, 用序号刻度来评分行为。这些类型的数据不是连续的, 也不是正态分布的, 所以应该使用非参数统计, 如克鲁斯卡尔-瓦利斯测试, 如6.1 和6.2 节所示。另外, 波束行走和工作记忆的水迷宫测试产生的数据是连续的和正常分布的, 所以参数统计可以使用, 如单向方差分析或重复测量的双向方差分析, 如6.3 和6.4 节所示。

这里提出的行为任务经受了时间的考验, 并给出了重现性的结果, 特别是当与大鼠的外国证券投资模型配对时, 尽管许多其他的脑损伤行为测试方法确实存在。neuroscore 是用最少的设备进行的简短评估。其他的反射和强度测试可用, 并可纳入神经评估, 如横向 pulsion 任务, 不能试验, 斜面试验, 握力 (见藤本et al.22和金色et al.23). 所描述的平衡木平衡和光束行走任务是损伤后 vestibulomotor 的测量。Vestibulomotor 的协调可以被认为是一个衡量的总运动行为, 而其他措施的总活动赤字包括 Rotarod, 旋转极, 和开放的野外行动。游泳的能力, 测量作为游泳速度在水迷宫期间, 也是总马达协调的征兆22,23。工作记忆水迷宫任务通过检测两个参考内存赤字 (由试验1表示) 和工作记忆缺陷 (由试验2或试验1和试验2之间的差异) 来完成这套测试。认知功能的其他措施包括八臂径向迷宫, 巴恩斯迷宫, 新的物体识别测试, 以及不同的水迷宫的变化。这些变化包括原始的莫里斯水迷宫和拉什利 III 迷宫 (再看见藤本et al.22和金色et al.23). 这一电池的测试证明是有用的早期损伤后, 并在不同程度上, 12 月后受伤的1。

此外, 在这里演示的任务可以用于不同的菌株, 性别, 和年龄的大鼠;然而, 住宿可能需要为不同的大小和在更大的弱点的情况下作出。例如, 较年长、较重的老鼠需要更宽的光束来进行平衡木平衡任务, 而年老、体弱的老鼠, 在水迷宫中可能需要更短的游泳时间。因此, 在这些测试中有灵活的余地, 并且有可能开发新的测试以适应不同的情况和假设。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢伊恩粗的帮助与外科准备的主题和伊丽莎白, 她精心编辑。这些研究已经完成, 作为一个团队的一部分, 由穆迪的转化性颅脑损伤研究项目资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley rats Charles Rivers Laboratories
251 Ballardvale St
Wilmington, MA 01887-1096
Phone: 800-522-7287		 CD-IGS rats, strain code 001 male, albino, 300-350g at arrival
Name Company Catalog Number Comments
Beam-Balance
Beam home built wood, 25" l x 1" h x 3/4" w sealed with polyurethane varnish
C-clamp Home Depot 1422-C 2 1/2"
barrier Home Depot styrofoam, 18" x 17 1/2"
table (for both BB & BW) generic office supply 37" h x 30" w x 60" l
Name Company Catalog Number Comments
Beam-Walk
Beam home built wood 38-1/2" l x 1-3/4" h x 1" w sealed with polyurethane varnish (~ 37" off floor)
escape box home built woodpainted black 12 1/2 " l x 9" h x 7-1/4" w
nails (pegs) 2"
hinges
clamps
white noise machine San Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121
Phone: (858)530-2600		 http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf
light Home Depot
Name Company Catalog Number Comments
Morris Water Maze
fiberglass pool manufacturer unknown
(similar to one made by SDI) San Diego Instruments 7000-0723 72" diameter x 30" deep (~ 500 gal)
plexiglass platform hand-made by Maggie Parsley 10 cm diameter, 26" tall with silicone applied to the surface of the platform to provide a gripping surface
(similar to one made by SDI) SDI 7500-0272
plexiglass animal boxes w/ lids UTMB Machine Shop 2 boxes, 10" w x 16" L x 9" h
spot lights/ heat lamps Home Depot 3 around pool, 2 over boxes to dry animals
AnyMaze San Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121
Phone: (858)530-2600		 /9001 http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/

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Hausser, N., Johnson, K., Parsley, M. A., Guptarak, J., Spratt, H., Sell, S. L. Detecting Behavioral Deficits in Rats After Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (131), e56044, doi:10.3791/56044 (2018).

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