Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Påvisning af adfærdsmæssige underskud i rotter efter traumatisk hjerneskade

Published: January 30, 2018 doi: 10.3791/56044
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

Målet med de adfærdsmæssige test præsenteres her er at opdage funktionelle mangler hos rotter efter traumatisk hjerneskade. Fire specifikke tests er præsenteret som registrere underskud i opførsel at afspejle skader på specifikke hjernen områder til tider strækker sig til et år efter skaden.

Abstract

Med den stigende forekomst af traumatisk hjerneskade (TBI) i både civile og militære befolkninger, TBI er nu betragtes som en kronisk sygdom; dog har få studier undersøgt de langsigtede virkninger af skade i gnavere modeller af TBI. Vist her er adfærdsmæssige foranstaltninger, der er veletableret i TBI forskning for gange tidligt efter skade, såsom to uger til to måneder. Nogle af disse metoder har tidligere været brugt på senere tidspunkter efter skade, op til et år, men af meget få laboratorier. Metoder viste her er en kort neurologisk vurdering at teste reflekser, en stråle-Balance at teste balance, en stråle-tur til at teste balance og motoriske koordination og en fungerende hukommelse version af Morris vand labyrinten, der kan være følsomme over for underskud i reference hukommelse. Mandlige rotter blev håndteret og pre uddannet til neurologiske, balance, og motor koordinering test før modtager parasagittal væske slagtøj skade (FPI) eller sham skade. Rotter kan testes på den korte neurologisk vurdering (neuroscore), beam-balance, og Beam-gang flere gange, mens testning på vand-labyrint kan kun gøres en gang. Denne forskel skyldes, at rotter kan huske opgaven, således confounding resultaterne, hvis gentagne afprøvning er forsøgt i samme dyr. Ved test af en til tre dage efter skade, registreres væsentlige forskelle i alle tre ikke-kognitive opgaver. Men forskelle i Beam-gang opgaven var ikke detectable på senere tidspunkter (efter 3 måneder). Underskud blev opdaget på 3 måneder i Beam-Balance og på 6 måneder i neuroscore. Underskud i arbejdshukommelsen blev fundet ud til 12 måneder efter skade, og et underskud i en reference memory dukkede første gang op på 12 måneder. Således er kan standard adfærdsmæssige test være nyttige foranstaltninger af vedvarende adfærdsmæssige underskud efter FPI.

Introduction

De metoder, der præsenteres her er designet til at afsløre funktionelle mangler i specifikke hjernen områder induceret en eksperimentel model med TBI i rotter. Fire forskellige adfærd prøver vil blive beskrevet. Først, de korte neurologisk vurdering, omtales som neuroscore, kan udføres uden at kræve nogen specialiseret udstyr, men kræver praksis; denne test registrerer underskud i reflekser. For det andet registrerer Beam-Balance test underskud i evnen til at balancere. Denne opgave kræver handleren til at score den rotte, baseret på en ordinal skala og kræver nogle uddannelse af handleren. Beam-Balance test kræver en smal stråle og er følsom over for underskud i det vestibulære system. Den tredje test vurderer vestibulomotor koordinering. Denne test er kendt som bom-gang opgaven, og selv om nogle forberedende undervisning af rotten er påkrævet, denne procedure er mere objektiv end de to foregående som ventetid til at krydse strålen er et objektivt mål ikke afhængige af subjektive scoring. Denne forskel skyldes, at tid til at krydse en smal stråle for at nå et pengeskab er målt. Beam-Walk testen kræver en længere stråle end stråle-Balance samt en flugt boks. Denne test måler underskud i både motoriske koordination og balance og dermed er følsomme over for skade at lillehjernen og motor relaterede hjernen områder. Hukommelse arbejdsversion af Morris vand labyrint (MWM-WM) tester primært hippocampus funktion og integration med præfrontal cortex eller udøvende funktion. Versionen af Morris vand labyrinten vist kan også bruges til at registrere underskud i reference hukommelse1.

Disse metoder var udvalgt på baggrund af deres veletablerede track record i litteraturen. Hver enkelt har været effektiv i mange hænder fra forskellige laboratorier med flere stammer af rotter i mange år af forskning. Men i fortiden, efter skade måler op til to uger efter skaden ansås "kroniske" tidspunkter. Således, for at etablere adfærdsmæssige teknikker til undersøgelse af kroniske effekter af TBI i gnavere, induceret disse velkendte metoder skulle evalueres for følsomhed til at registrere TBI underskud på længere tid point efter skade. Mens der er nu flere gnavere modeller af TBI, FPI model er en af de mest udbredte og anvendes i denne undersøgelse. Denne model blev første gang offentliggjort i 1950 's2, og siden da har mere end 1.000 papirer har ansat FPI i rotter3. Neuropatologiske af denne type skade er blevet godt beskrevet af os4 og andre5,6,7. Kort, neuronal skade i hippocampus har vist sig at være dosisafhængig ved hjælp af Fluoro-Jade farvning på kort tid efter skade, dvs., 24-48 timer; mens brutto atrofi og kavitation er herunder udtynding af interne kapsel og cortex blevet rapporteret et år efter skade6,7.

Den mest meningsfulde repræsentation af hjernefunktion er vurderet ved hjælp af adfærdsmæssige statusmålinger efter en eksperimentel hjerneskade. Men størstedelen af FPI eksperimenter, der bruger adfærdsmæssige resultater gøre foranstaltninger forholdsvis tidligt, typisk fra 1 til 14 dage efter skaden. Ved hjælp af metoderne vist her, nogle adfærdsmæssige underskud kan detekteres ud til 12 måneder efter skade1. Neurologiske funktion, brutto vestibulomotor funktion og fine motor koordinering blev vurderet efter skade dage (PID) 1-3 og på 3, 6 og 12 måneder efter operationen, ved hjælp af et kort neurologisk vurdering (Neuroscore; ændret fra Schallert8), den Beam-Balance opgave, og Beam-gang opgave9,10,11. Reference og arbejdshukommelsen blev vurderet ved hjælp af en fungerende hukommelse version af Morris vand labyrint1,12,13.

Protocol

Alle dyreforsøg godkendes først af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af University of Texas medicinsk afdeling i Galveston, Texas, som instrueret af National Institutes of sundhed Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr (8. udgave, National Research Council).

1. kirurgiske procedurer og væske slagtøj TBI

  1. Få voksne mandlige 300 g Sprague-Dawley rotter fra en leverandør og hus to pr. bur med mad og vand ad libitum i en vivarium med konstant forhold: lys cyklus (600 timer til 1.800 h), temperatur (21 ° C til 23 ° C) og fugtighed (40-60%).
  2. Forud for operationen, håndtere rotter i tre til fem dage, og derefter tog rotter for Neuroscore, bom-Balance og Beam-gang procedurer fra en til tre dage før baseline vurdering. Gennemføre den oprindelige vurdering enten dag eller morgen før operationen.
    Bemærk: Udarbejde altid kontrol rotter, som sham-drives eller kirurgisk naive rotter på samme måde som dem, der får en skade, og enten tilfældigt eller på en afbalanceret måde, gruppe rotter i behandlingsgrupper.
  3. Udføre kirurgi under aseptiske betingelser (sterile instrumenter, ren kirurgisk kjoler, sterile handsker, masker og hoved dækker).
  4. Bedøver rotter ved hjælp af isofluran på 4% for induktion og 1.5-2% for vedligeholdelse. Intubate og mekanisk ventilere rotter (ved hjælp af isofluran i luften: ilt (70:30) og forberede parasagittal væske-percussion skade som tidligere beskrevet14,15.
  5. Infiltrere sår websteder med 0,10% bupivicane før suturering og indsætte rektal acetaminophen stikpille (120 mg/kg) før opvågning fra anæstesi. Overvåge rotter i mindst 4 timer i løbet af tilbagebetalingsperioden, og den følgende dag for tegn på infektion, alvorlig neurologisk skade (f.eks. lammelse) eller svær ubehag (f.eks. vedvarende syvsoveren position).
    Bemærk: Rotter udstiller nogle af disse symptomer bør være aflivede (4% isofluran i et bedøvelsesmiddel kammer efterfulgt af afhugning af hovedet).

2. Neuroscore undervisning og test

  1. Neuroscore uddannelse
    1. Køre gennem tests i følgende rækkefølge (trin 2.2.1-2.2.5) fra start til slut, vender tilbage til hjem buret for 1 min uddannelse på rotter, kendt for at være eksperimentelt naiv, og derefter Gentag indtil en score på nul opnås.
    2. Mark score på score-arket for en registrering af uddannelse forsøg for hver rotte. Efter træning, skal du udføre en test session (se nedenfor) på den samme eller følgende dag.
      Bemærk: Hvis test sessionen ikke producerer en nul score for den oprindelige plan, undervisning og test kan gentages eller rotten kan omstilles til en ikke-adfærd eksperiment.
  2. Neuroscore test
    Bemærk: Kør gennem tests i følgende rækkefølge, vender tilbage til hjem buret for 1 min, derefter gentage to gange i alt tre gange.
    1. Forelimb fleksion test
      1. Løft rotten i halen og hold omkring 6-12 inches over bordpladen.
      2. Observere om rotten udvider eller bøjer forbens. Score tilstedeværelsen af fleksion (1) eller ej (0).
        Bemærk: Fleksion er unormal. Mulige score på 1 x 3 = 3 (alt muligt = 3).
    2. Hindlimb fleksion test
      1. Løft rotten i halen og hold omkring 6-12 inches over bordpladen.
      2. Observere om rotten udvider eller bøjer hindlimbs. Score tilstedeværelsen af fleksion (1) eller ej (0).
        Bemærk: Fleksion er unormal. Mulige score på 1 x 3 = 3 (kumulative Total muligt = 6).
    3. Visuelt udløst markedsføring test
      1. Løft rotten ved halen.
      2. Langsomt sænke rotte mod kanten af bordet, indtil næsen er ca 10 cm fra kanten.
      3. Flytte rotte langsomt mod kanten (ikke tillader den knurhår at røre ved kanten).
      4. Observere om rotten når og udvider forepaws til tabellen. Score (0) eller ej (1) for at udvide forepaws.
        Bemærk: Nå til tabellen i svar til visuelle stikord er normal. Mulige score på 1 x 3 = 3 (kumulative Total muligt = 9).
    4. Kontakt udløst markedsføring test
      1. Hold rotte med kroppen i hånden, parallelt til bordkanten og forben gratis.
      2. Langsomt sænke rotte mod kanten af bordet, indtil knurhår på den ene side tryk kanten af bordet.
      3. Observere om rotten udvider forelimb på samme side som den knurhår, som rørende tabellen mod bordkanten, så snart knurhår touch.
        Bemærk: Udvikling af denne reaktion tager betydelig praksis og forskere skal være godt uddannet til at udføre denne test konsekvent.
      4. Score (0) eller ej (1) for at nå mod bordet.
        Bemærk: Nå i svar til taktil stimulation er normal. Mulige score på 1 x 3 = 3 (alt muligt = 12).
      5. Gentag trin 2.2.4.1-2.2.4.4 til den modsatte side. Mulige score på 1 x 3 = 3 (kumulative Total muligt = 15).
    5. Hindpaw gribe refleks test
      1. Hold rotten i den ene hånd med tommel- og pegefinger omkring brystet under forbens.
      2. Blidt røre håndfladen i den ene hindpaw med de andre pegefinger.
      3. Observere om rotten griber pegefingeren. Score (0) eller ej (1) at fatte.
        Bemærk: Grådige er normal. Mulige score på 1 x 3 = 3 (alt muligt = 18).
      4. Gentag trin 2.2.5.1-2.2.5.3 til den modsatte side. Mulige score på 1 x 3 = 3 (alt muligt = 21).
    6. Scoring
      1. Opsummere score for en eventuel kumulativ alt 7 x 3 = 21. En score på nul er normal.

3. stråle-Balance træning og testning

  1. Udstyr
    1. Brug en stråle 60 cm i længden, 1,75 cm i bredden, 4,0 cm i højden, modregne gulvet med en barriere 30 cm i højden, 30 cm i bredde 90 cm. Sikre stråle til en tabel med barriere knyttet så at 50 cm af strålen stikker fra barriere, væk fra bordet.
    2. Placer en polstret pengeskab under stråle til at afbøde virkningerne af rotter, der falder.
  2. Beam-Balance træning
    1. 24-48 h før operation, sted rotten på bjælken for en 60 s retssag.
    2. Hvis rotten undlader at balancere på sin egen, tillade rotte at falde i boksen sikkerhed.
    3. Begynde timing, når rotten placeres sikkert på bjælken.
    4. Observere rotten for 60 s periode og dens ydeevne baseret på følgende skala: 1 = viser stabil balance (brudgomme, gåture, forsøg på at bestige barrieren), 2 = viser gyngende balance (griber sider af stråle og/eller har usikre bevægelser), 3 = forsøger at afbalancere men glider o r spins på bjælken, hænger på af hugging stråle, 4 = forsøger at balance, men falder efter 10 s, 5 = hænger over eller fra stråle og falder ud i under 10 s, 6 = falder ned, gør ingen forsøg på at balancere eller hænge på bjælken.
    5. Optage score i regnearket.
    6. Tillad rotte hvile i 15 s i burene, Gentag derefter trin 3.2.1-3.2.5 indtil rotten opnår tre scoringer af 1 eller 2. Rotten betragtes derefter som uddannet.
    7. Udføre en forudgående vurdering på 24 h eller på dagen for operationen forud for operationen.
  3. Beam-Balance test
    1. Start 24 h efter kirurgi og fortsætter i op til 4 dage, teste rotter dagligt.
      1. Placere rotten på bjælken og starte timeren. Observere rotten nøje for 60 s. rekord score på regnearket.
      2. Returnere rotten til hjem buret for en kort hvileperiode (1-3 min).
      3. Gentag trin 3.3.1.1-3.3.1.2 for i alt tre tests.

4. stråle-Walk undervisning og test

  1. Udstyr
    1. Bruge en træ stråle 100 cm i længden, 2,5 cm i bredden, og 4,0 cm i højden.
    2. Forberede et justerbart stativ, en justerbar bord og fire pinde, 2 cm i højden, og en sort mål boks 28 cm i længden, 18 cm i højden og 18 cm i bredden, med en åbning på en ende store nok til rotte at passere igennem.
    3. Tillægge den åbne side af boksen mål, der er placeret på tabellen justerbar målet ende af bjælken. Placer den lyse lys og hvid støj generator nær start enden af bjælken. Start slutningen af strålen er fastgjort til den justerbart stativ så strålen og boks er på samme niveau, omkring 1 meter over gulvet.
  2. Beam-gang træning
    1. Begynde at træne 24-48 h før operation.
    2. Placere rotten i boksen mål for 1 min. Efter 1 min, fjerne rotten og starte retssagen.
    3. At starte forsøget, tænde lys og hvid støj og placere rotten på bjælken på placeringen af pind hul tættest på boksen mål og rat til at angive boksen mål.
    4. Når rottens forpoterne krydser tærsklen af målet boks, straks slukke lys og støj kilder (dette er slutningen af en retssag).
    5. Tillad rotte at hvile i boksen mål for 30 s mellem hvert forsøg.
    6. Gentag fremgangsmåden i trin 4.2.3-4.2.5 to gange på hver pind placering og fra startpositionen. Indsæt en pløkkerne i hullerne og køre en komplet Beam-tur med pinde på plads.
    7. Køre tre timet Beam-gang forsøg.
      1. Fjerne rotten fra boksen mål. Tænde lys og hvid støj og starte stopuret, når placere rotten på bjælken. Stop stopur, straks når rottens forpoterne krydser tærsklen af målet boks, og slå derefter straks fra lys og støj.
      2. Registrere tid på regnearket.
      3. Gentag trin 4.2.7.1-4.2.7.2 indtil rotten har opnået tre gange 5 s eller derunder. Rotten er nu betragtes som uddannet.
  3. Beam-gang baseline vurdering
    1. På den dag eller morgen forud for operationen, gøre tre timet forsøg med pinde på plads.
    2. Start ved at placere rotten i boksen mål for 30 s. Fjern rotte af målet boks og drej på hvid støj og lys. Placere rotten på start slutningen af strålen og samtidig begynder stopur. Når rottens forpoterne krydser tærsklen af målet boks, straks slukke lys og støj kilder og stop tidtager.
    3. Registrere tid på regnearket. Tillad rotte at forblive i boksen mål for 30 s.
    4. Gentag trin 4.3.2-4.3.3 indtil tre ventetid er indspillet i regnearket. Vende tilbage rotten til burene, efter tre timet forsøg er afsluttet.
  4. Beam-Walk test
    1. Teste rotter dagligt starter 24 timer efter operationen og fortsætter i op til 4 dage. Udføre tre timet forsøg som i trin 4.3.

5. arbejder hukommelse vand labyrint

  1. Udstyr
    1. Brug en tank fyldt med vand til en højde på 28 cm og vedligeholdes på 26 ± 1 ° C.
    2. Brug en klar akryl glas platform, der er 10 cm i diameter på et stativ 26 cm i højden.
      Bemærk: Den øverste overflade af platformen bør være beklædt med silicium i form af en cirkel med et X på tværs af det. Dette gør det muligt rotter at klatre op på platformen og giver dem trækkraft, så de ikke glider ud.
    3. Samle et stopur, en varmelampe, engangs håndklæder, absorberende puder, ekstra bure og en net lille, lang-håndteres akvariefisk. Bruge en edb video tracking system, der er forbundet til et videokamera til at optage den rotte svømning og sende data til computeren. Gemme video og data på computeren til senere analyse.
  2. Arbejder hukommelse vand maze test
    1. Give rotter fire par forsøg hver dag i fem på hinanden følgende dage, placere platformen i hver af de fire kvadranter og starte rotter fra hver af de fire udgangspunkter (N, S, E, W) som beskrevet nedenfor.
    2. Først definere start placering-platform par til at blive brugt i hele eksperimentet.
      Bemærk: Rækkefølgen af kvadranter hvor platformen er placeret og udgangspunktet anvendes behov for at være i en anden rækkefølge for hver af fem dage af svømning, men det samme for hver rotte.
      1. Bruge fire udgangspunkter (N, S, E eller W) og fire platform steder (kvadranter 1, 2, 3 eller 4; Figur 1). For eksempel, (N, 2; E, 4; SØRENSEN, 1; W, 3; Se figur 1). Planen en afbalanceret (ikke tilfældig) for at undgå udgangspunkter for tæt på platforme (ingen udgangspunkt er den samme kvadrant som lokationen platform). Oprette en data-ark ved hjælp af platformen kvadranter og fire udgangspunkter.
      2. Skrive en protokol for videoen tracking software til at bruge for at video rotter svømning og samle angivne data (f.eks., varigheden af svømme, hastighed, afstand rejste før at finde platformen).
        Bemærk: Tracking software vil automatisk stoppe optagelsen efter den angivne varighed. Protokollen skal tillade angivelse af hvor platformen er placeret, hvor mange forsøg at køre pr. dyr, og hvor mange dyr vil blive testet per session, og også den maksimale varighed tilladt (f.eks.120 s).
      3. Test 4-6 rotter pr. session.
        Bemærk: mere end 6 rotter skabe en oplag i timingen mellem rotter og kan føre til fejl af handleren. Boksene opvarmning også blive overfyldt.
    3. Forsøg 1
      1. Åbn video tracking software og indlæse den korrekte protokol, herunder vand labyrint kort.
      2. Sted platform i den tildelte placering (f.eks.2; Figur 1) og kontrollere, at det svarer til kortet i softwaren. Forberede tracking software til at starte, når rotten træder synsfelt video kamera.
      3. Placere rotten i tanken mod væggen på den tildelte placering (f.eks.N; Figur 1) og straks starte timeren.
      4. Tillad rotte 120 s at finde platformen. Når rotten finder platformen, stop tidtager og registrere tid på regnearket. Hvis rotten ikke kan finde platformen, fører det til platformen i hånden og optage 120 s. Tillad rotte 15 s for at forblive på platformen.
    4. Forsøg 2
      1. Kontrollere, at softwaren er klar til forsøg 2. Placere rotten tilbage i tanken på samme startposition (N). Gentag trin 5.2.3.4.
    5. Efter forsøg 2, placere rotten i den opvarmede kabinet i 4 min. flytte platformen til den anden placering (4; Figur 1), og kontrollere, at det svarer til kortet i softwaren.
    6. Gentag forsøg 1 og 2 procedurer (trin 5.2.3-5.2.4) indtil alle fire starter placering/platform bindinger er afsluttet.

6. dataanalyse

  1. Neuroscore
    1. Manuelt overføre håndskrevne resultaterne til en computer regneark.
    2. Opsummere resultaterne for hvert forsøg at få tre point pr. rotte på hver dag.
    3. Formatere dataene til statistisk analyse, (enten i det lange eller brede format afhængigt af software præferencen).
      Bemærk: Den lange format har en enkelt kolonne til behandling (i dette tilfælde, udfyldt med enten "Naiv", "Fingeret" eller "TBI"), en enkelt kolonne for dagen (i dette tilfælde "0", "1", "2" eller "3"), og en enkelt kolonne til retssag ("1", "2" eller "3"). Wide-format har en enkelt kolonne for hver kombination af faktor niveauer (så en enkelt kolonne for naiv, dag 0, forsøg 1, anden kolonne for naiv, dag 0, forsøg 2, osv.)
    4. Gennemsnitlige score for hvert dyr på hver dag. Da der var tre forsøg gjort hver dag vil der være tre værdier for hvert dyr pr. dag.
    5. Vurdere, om dataene er normalt fordelt. Brug en ikke-parametrisk statistiske (f.eksKruskal-Wallis) test for at analysere, om scoren på hver dag er forskellige mellem grupper. I dette tilfælde, da disse data ikke er kontinuerlig, fordeles de ikke normalt.
    6. For at bestemme, hvor forskellene ligger, gøre post-hoc test, såsom Tukey's post-hoc analyse.
      Bemærk: Her, R statistisk software pakke16, Kruskal.test() funktion og funktionen posthoc.kruskal.nemenyi.test i parvis flere sammenligning af betyde rækker pakke (PMCMR)17 blev brugt.
    7. Derudover test for at se om der er uoverensstemmelser mellem dage inden for hver gruppe.
      Bemærk: For eksempel, at se, hvis dyrenes FARCE opfører sig forskelligt på dag 0 sammenlignet med dag 1, dag 2 og dag 3. For at gøre dette, køre en envejs gentagne foranstaltninger ANOVA. Dette kan ske i R ved hjælp af funktionen ezANOVA i ez-pakken.
    8. Hvis du vil køre en gentagen foranstaltninger ANOVA, skal du først kontrollere antagelse om kugleform.
      Bemærk: Her, dataene, der angiver at den inden for faktor (dag) gør mødes kugleform antagelse for NAIV og HUMBUG, men ikke for TBI. Således, en korrektion er ikke nødvendige for NAIVE eller HUMBUG. TBI data, bruge drivhus-Geisser korrektion.
    9. Hvis der findes betydelige forskelle, køre en post-hoc test for at afgøre, hvor forskellene ligger. Dette opnås i R ved hjælp af en parvis t-test funktion. Plot resultaterne som et box plot, som vist i de repræsentative resultater (figur 2).
  2. Beam-Balance
    1. Manuelt overføre de håndskrevne noder til en computer regneark. Formatere dataene til statistisk analyse, (enten i lange eller brede format afhængigt af software præferencen). Se Note taktfast 6.1.3.
    2. Gennemsnitlige scores for hver rotte på hver dag, så de hver rotte har en score per dag. For at teste, om scoren på hver dag er forskellige mellem NAIVE, HUMBUG og TBI, vurdere, om dataene er normalt fordelt.
      Bemærk: I dette tilfælde, da data ikke er kontinuerlig, disse data er ikke normalt fordelt. Derfor bruge en ikke-parametrisk statistiske test (fx, Kruskal-Wallis test).
    3. For at bestemme, hvor forskellene ligger, er post-hoc test, fx, Tukey's post-hoc analyse. For at teste for forskelle mellem dage inden for hver behandling, køre en envejs gentages måler ANOVA (Se trin 6.1.7). Tjek antagelsen om kugleform.
      Bemærk: I denne undersøgelse, dataene, der angiver at den inden for faktor (dag) ikke opfylder kugleform antagelsen for nogen af grupperne, så brugte kontinuitet korrektioner. Bruge drivhus-Grier kontinuitet korrektion.
    4. Plot resultaterne på et box plot, som vist i de repræsentative resultater (figur 3).
  3. Beam-walk
    1. Manuelt overføre håndskrevne resultater til en computer regneark. Gennemsnittet af de tre Beam-gang ventetid for hvert dyr for hver dag. Formatere data for statistisk analyse (Se trin 6.1.3).
    2. Vurdere, om dataene er normalt fordelt.
      Bemærk: I dette tilfælde data er løbende, og er normalt fordelt. Derfor bruge en en-vejs ANOVA for at afgøre, om ventetid på hver dag er forskellige mellem naive, HUMBUG og TBI.
    3. For at se, hvis der er nogen forskel mellem dage inden for en behandling, køre en envejs gentagne foranstaltninger ANOVA. Først kontrollere antagelse om kugleform.
      Bemærk: I denne undersøgelse, dataene, der angiver at den inden for faktor (dag) ikke opfylder kugleform antagelsen for nogen af vores grupper, så kontinuiteten korrektioner er brugt. Bruge drivhus-Grier korrektion.
    4. Plot resultaterne på et box plot, som vist i de repræsentative resultater (figur 4).
  4. Arbejder hukommelse vand labyrint
    1. Overføre data fra regneark eller computer tracking program til et regneark. Vælg resultaterne der skal analyseres.
      Bemærk: Mange mulige resultater er tilgængelige for analyse fra computeren tracking programmer. Eksempler på resultater udvalgt til analyse kan omfatte: ventetid, lysvej, thigmotaxia og svømme hastighed. De rapporterede hyppigst resultat er ventetid, som bruges i eksemplet forudsat.
    2. Formatere dataene til statistisk analyse, (enten i lange eller brede format afhængigt af software præferencen).
      Bemærk: Den lange format har en enkelt kolonne til behandling (i dette tilfælde, udfyldt med enten "Naiv", "Fingeret" eller "TBI"), en enkelt kolonne for dagen (i dette tilfælde "1", "2", "3", "4" eller "5") og en enkelt kolonne til retssag (enten "1", "2", "3", "4", "5" "6", "7" eller "8"). Vi har også brug for en ekstra kolonne til at identificere forsøg (enten "1" eller "2"). Bredt format har en enkelt kolonne for hver kombination af faktor niveauer (så for eksempel, en enkelt kolonne for naiv, dag 1, forsøg 1, forsøg 1, anden kolonne for naiv, dag 1, forsøg 2, forsøg 2). Forskellen mellem retssag 1 og forsøg 2 kan også beregnes for hver session og analyseret som en forskel score.
    3. Udfør følgende trin for at finde, hvis der er en overordnet forskel mellem grupperne skade.
      1. Først, den gennemsnitlige vand labyrint ventetid for hvert dyr for dag 1.
        Bemærk: Der var fire sessioner på hver dag, så i gennemsnit fire værdierne pr. dyr for hver prøveversion 1 og forsøg 2. Gøre denne beregning for de resterende dage.
      2. Du kan kontrollere skade forskelle samlede, køre en to-vejs gentagne foranstaltninger ANOVA. Der er to faktorer, skade og dag. Skade er en mellem gruppe faktor og dagen er en i gruppen faktor. Bemærk: Her Rasmussen blev brugt.
      3. Hvis resultaterne viser en signifikant forskel på grund af skade, derefter køre en Tukey post-hoc test for at se, hvor forskellene ligger.
    4. For at finde ud om der er forskelle mellem grupperne skade på bestemte dage udfører følgende trin.
      Bemærk: Dag 1 bruges som et eksempel, og den samme analyse skal gøres for alle de følgende dage. Også er denne analyse udført på flere måder, først for forsøg 1, anden for forsøg 2 kun, og tredje for forskellen mellem retssag 1 og forsøg 2. Forsøg 1 bruges som et eksempel; samme fremgangsmåde skal anvendes til andre analyser.
      1. Først, den gennemsnitlige vand labyrint ventetid for hvert dyr for dag 1. Da der var fire gentagelser af "Trial 1" på hver dag, i gennemsnit fire værdierne for hvert dyr.
      2. Vurdere, om dataene er normalt fordelt.
        Bemærk: I dette tilfælde data er løbende, og er normalt fordelt. Derfor bruge en-vejs ANOVA for at afgøre, om vand labyrint latency på dag 1 er forskellige mellem NAIVE, HUMBUG og TBI. R statistisk softwarepakke og funktionen aov() blev brugt her.
      3. Brug en 5% niveau af betydning. Hvis den resulterende p-værdien er mindre end 0,05, så der er betydelige forskelle mellem grupperne.
      4. For at bestemme, hvor forskellene ligger, bruge Tukey's post-hoc test. Dette er TukeyHSD() funktionen i R.
    5. Følg disse trin for at finde ud af, om der er forskelle mellem dage inden behandlingsgrupper.
      1. Først køre en envejs gentagne foranstaltninger ANOVA. Dette kan ske i R ved hjælp af funktionen ezANOVA i ez-pakken.
      2. Før du kører en gentagen foranstaltninger ANOVA, skal du først kontrollere antagelse om kugleform.
        Bemærk: Den inden for faktor (dag) møder kugleform antagelsen for alle grupperne, der er således ingen grund til at bruge kontinuitet korrektioner.
      3. Hvis forskelle mellem dage findes (p-værdier mindre end 0,05), derefter køre en post-hoc test for at fastslå præcis hvor forskellene ligger. Dette trin er opnået i R ved hjælp af funktionen pairwise.t.test.
    6. Graf resultater ved hjælp af linje grafer (figur 5). Også, kan blive grafen retssag 1-forsøg 2.

Representative Results

Resultaterne af neuroscore proceduren (figur 2) viser både potentialet for falsk positiv (HUMBUG og TBI grupper på dag 0) og følsomheden af denne test for at opdage små forskelle. Falske positiver kan opstå, når rotten ikke er godt vænnes til proceduren, så det ikke er helt afslappet. Dag 0 er forud for operationen, så ideelt set alle rotter bør nå frem til kriteriet om en score på 0 før en undersøgelse. Dage 1-3 viser følsomheden af denne test til påvisning af små ændringer i partituret. Mens der er et potentiale for en score så højt som 21, er scorer højere end 3 usædvanligt i denne model. I dette eksempel gentages foranstaltninger ANOVA viste ingen forskelle mellem dage for NAIVE (p = 0,78) eller falsk (p = 0,09); men for gruppen TBI der var forskelle mellem dage (p < 0,05). Post-hoc parvise sammenligning viste, at dag 0 er væsentligt forskellige fra dag 1, 2 og 3. Dette resultat viser, at skaden, der produceres små men betydelige ændringer i neurologisk vurdering.

Yderligere analyse ved hjælp af Kruskal-Wallis test sammenlignede NAIVE, HUMBUG og TBI på hver dag, efterfulgt af den Tukey post-hoc test til at bestemme præcist, hvor forskellene ligger. Dag 0, var prøvningsstatistikken 13.37, p = 0,001, og SHAM var signifikant forskellig fra NAIV (p = 0,008). Ideelt set bør der være nogen forskelle mellem grupper på dag 0, som har fået indgivet ikke behandlinger eller procedurer. I dette tilfælde skal rotter yderligere vænnes til proceduren, eller overføres til en ikke-adfærd undersøgelse. For dag 1, prøvningsstatistikken var 32.39, p = 9.75e-8, med post-hoc test, der angiver, at HUMBUG og TBI var signifikant forskellig fra NAIV (p = 0,002, p = 5.9e-7, henholdsvis). For dag 2, prøvningsstatistikken var 23.39, p = 8.34e-6, og HUMBUG og TBI var forskellige fra NAIV (p = 0,002, p = 6.8e-5). Dag 3, var prøvningsstatistikken 38,4, p = 4.59e-9, og igen, HUMBUG og TBI var signifikant forskellig fra NAIV (p = 0,001, p = 2.1e-8, henholdsvis). Disse resultater peger på, at SHAM forberedelse også producerer nogle underskud i neurologisk vurdering til tider tidligt efter skade.

Repræsentant Beam-Balance resultater (figur 3) vise følsomheden af stråle-Balance test til underskud kort efter skade (figur 3, venstre) og på et tidspunkt længere efter skade (figur 3, højre). Følsomheden af stråle-Balance test følgerne af hjerneskade aftager over tid, fordi som de uskadt rotter alder og tager på i vægt, de har øget ved at balancere på bjælken. På senere tidspunkter, er strålen vendt, så rotterne balancerende på den brede side af bjælken. Dog senest 6 måneder efter skade er denne test ikke længere følsomme over for virkningerne af skade som alder og/eller vægt forvirre evnen til at udføre opgaven (figur 3, højre). Alternativt, healing kan være opstået i det vestibulære system, og disse data afspejler nøjagtigt at den rats' evne til at balancere når samme niveau som kontrolgrupper.

Sammenligne naive, HUMBUG og TBI på hver dag, brugte vi Kruskal-Wallis test. Resultater for tiden point tidligt venstre efter skade, der er vist i figur 3. På dag 0, Kruskal-Wallis test fandt værdien af Proevestatistikken er 6.81, p = 0.033. Der var en signifikant forskel mellem grupperne, med Tukey's post-hoc test viser, at naivt gruppe var anderledes end SHAM (p = 0,038); alle tre grupper havde imidlertid betyder langt under 2.0, der angiver, at alle rotter havde mødt kriterierne til at fortsætte. Det ville være at foretrække at have nogen forskelle mellem grupper på dag 0, men da alle grupper er under 2, de kan fortsætte i undersøgelsen. På PID 1, Kruskal-Wallis test statistik var 69.72, p = 7.25e-16. Tukey's post-hoc test viste, at gruppen TBI var signifikant forskellig fra både naive og Sham grupper (p = 4.9e-14, p = 9.1e-08, henholdsvis). På dag 2, Kruskal-Wallis test statistik var 62.84 og p = 2.26e-14, i post-hoc test viser TBI forskellige fra NAIV og HUMBUG (p = 1.0e-10, p = 2.1e-10 henholdsvis). På dag 3, Kruskal-Wallis test statistik var 62.69 og p = 2.44e-14. Post-hoc test viste TBI forskellige fra naiv og HUMBUG, (p = 9.6e-12, p = 1.7e-08, henholdsvis). Derudover kiggede vi for at se, om der var nogen forskelle mellem dage inden for hver gruppe. Ved hjælp af en gentagen måler ANOVA, for NAIVE, der ikke var nogen forskelle mellem dage (p = 0.367). For HUMBUG og TBI der var forskelle mellem dage (p = 0,002, p = 3.90e-29, henholdsvis). Post-hoc parvise sammenligninger afsløret for SHAM dag 1 er væsentligt forskellige fra dag 2 og dag 3 (p = 0,001, p = 0.01, henholdsvis), og for TBI, dag 0 er væsentligt anderledes form dage 1, 2 og 3 (p < 2e-16, p = 5.5e-16, og p = 2.7e-13, henholdsvis). Dag 1 er også adskiller sig væsentligt fra dag 3 (p = 0,036).

6 måneder efter skade, blev sammenligninger mellem NAIVE, HUMBUG og TBI foretaget på hver dag, ved hjælp af Kruskal-Wallis test (figur 3, højre). På dag 0, var værdien af prøvningsstatistikken 3.36 og p = 0,187, så der var ingen forskel på dag 0. Alle midler blev under 2, der angiver, at alle rotter og grupper opfylder kriterierne til at fortsætte i undersøgelsen. På PID 1, prøvningsstatistikken var 6.11, p = 0.047; post-hoc analyse ved hjælp af Tukey's post-hoc test viste imidlertid, at ingen af grupperne var væsentligt anderledes når tegner sig for flere hypotesetest. På dag 2, prøvningsstatistikken var 4.09, p = 0,13, ns, og på dag 3, var prøvningsstatistikken 2,91, p = 0,23, ns. Således var der ingen forskel mellem grupperne skade på en given dag.

Derudover ser på forskelle mellem dage inden behandlingsgrupper, en gentagen foranstaltninger ANOVA afsløret betydelige forskelle mellem dage for NAIV, HUMBUG og TBI (p = 0,0003, p = 2.61e-5, p = 5.59e-7, henholdsvis; Figur 3, højre). Post-hoc test vist følgende forskelle. For NAIV, dag 0 var signifikant forskellig fra dag 1, 2 og 3 (p = 0,002, p = 0.044, p = 0,004, henholdsvis). For SHAM, alle dage var markant forskellige fra hinanden: dag 0 var signifikant forskellig fra dag 1, 2 og 3 (p = 0.0006, p = 0,001, p = 0.0006, henholdsvis); Dag 1 var signifikant forskellig fra dage 2 og 3 (p = 0.031, p = 0.0006, henholdsvis); og dag 2 var signifikant forskellig fra dag 3 (p = 0.044). TBI, dag 0 er væsentligt forskellige fra dag 1, 2 og 3 (p = 0.0005, p = 0,0008, p = 0.0005, henholdsvis).

Resultaterne af stråle-Walk test er vist på to tidspunkter (figur 4). Svarende til stråle-Balance, denne test registrerer underskud tidligt efter skade (figur 4, venstre). Dog senest 6 måneder efter skade, der er ingen væsentlige forskelle mellem grupperne (figur 4, højre), antyder helbredelse opstod i gruppen sårede. Dette resultat kan afspejle virkningerne af mere fremskreden alder og øget vægt.

Hvis du vil sammenligne NAIVE, HUMBUG og TBI hver dag tidligt efter skade, blev en en-vejs ANOVA brugt. Der var ingen forskel på dag 0 (F = 0.859, p = 0,426) og alle ventetid var under 5 s, der angiver, at alle rotter opfylder kriterierne til at fortsætte i undersøgelsen. På PID 1, der var en betydelig prøvningsstatistikken af 15.36, p = 1.18e-6. Tukey's post hoc test viste en betydelig forskel mellem TBI og NAIV (p = 0.000004) og TBI og HUMBUG (p = 0,0001). På dag 2, der var en signifikant forskel mellem grupper (F = 9,49, p = 0.0002). Post-hoc test afslørede forskelle mellem TBI og NAIV (p = 0.0002) og TBI og HUMBUG (p = 0,005). På dag 3, de samlede Proevestatistikken er lig med 6,27, p = 0,0025, om der er forskelle mellem grupperne. Tukey's post-hoc test viste, at igen, TBI var forskellige fra NAIV og HUMBUG (p = 0,003, p = 0,035, henholdsvis).

Ved hjælp af en envejs gentagne foranstaltning ANOVA, blev forskelle mellem dage inden behandlingsgrupper udforsket. Først blev antagelsen af kugleform kontrolleret for hver gruppe. Den inden for faktor (dag) ikke opfyldte kugleform antagelsen for de NAIVE eller SHAM grupper, således kontinuitet korrektionen, drivhus-Grier blev anvendt til disse grupper. For SHAM, der var ingen forskel mellem dage (p = 0.066), NAIVE og TBI der var (p = 0,006, p = 2.89E-7, henholdsvis). Post-hoc sammenligninger viste for NAIV, var forskellen mellem dag 0 og dag 1 (p = 0,003). TBI, var forskellene mellem dag 0 og dage 1, 2 og 3 (p = 9.2e-6, p = 0.0005, p = 0,002, henholdsvis), og der var en forskel på dag 1 og dag 3 (p = 0.018).

6 måneder efter skade, der var ingen væsentlige forskelle mellem NAIVE, SHAM eller TBI på en dag (dag 0, F = 0.315, p = 0.732; Dag 1, F = 0,336, p = 0.717; Dag 2, F = 0,5, p = 0,61; Dag 3, F = 1.17, p = 0.322; Figur 4, højre). Når man sammenligner forskellene mellem dage inden for hver gruppe, der var en signifikant forskel i gruppen TBI (p = 0.026), med dag 0 er forskellig fra dag 1, 2 og 3 (p = 0.026, p = 0,002, p = 0,002). Der ikke var nogen forskelle mellem nogen dage for NAIVE eller FINGERET (p = 0.104, p = 0,063, henholdsvis).

Data fra hukommelse arbejdsversion af Morris vand labyrint kan være grafen i en række forskellige måder. Her vi vise resultaterne i 3 måneder (figur 5, venstre) og 12 måneder (figur 5, højre) efter skade ved hjælp af både linje diagrammer til at repræsentere tidsforløb, og kasse grunde til at give en samlet oversigt over data (figur 5, nederst). Vi kan derefter visualisere retssag 1 sammenligninger og forsøg 2 sammenligninger uafhængigt på hver dag samt generelle forskelle på grund af skade. Forsøg 1 ventetid repræsenterer reference hukommelse og forsøg 2 ventetid skildrer arbejdshukommelse.

Data fra rotter 3 måneder efter skade er vist i figur 5, venstre. For forsøg 1 (figur 5, øverst til venstre), når man sammenligner NAIVE, HUMBUG og TBI, kun dag 4 viste en signifikant forskel mellem grupper (F = 4.12, p = 0,025), med post-hoc Tukey test med angivelse af, TBI var forskellig fra NAIV (p = 0.019). Forsøg 2 (figur 5, midterste venstre), der var en signifikant forskel på dag 1 (F = 5,93, p = 0,006), med post-hoc analyse med angivelse af, TBI var forskellig fra FINGERET (p = 0,005). De gentagne foranstaltninger ANOVA fandt ikke en samlet forskel mellem skade grupper på 3 måneder (p = 0,56). Disse resultater tyder på, at disse rotter har små men betydelige underskud i reference samt arbejdshukommelse på 3 måneder efter skade.

12 måneder efter skade, sammenligner retssagen 1 NAIVE, HUMBUG og TBI (figur 5, højre), gentages foranstaltninger ANOVA demonstrerede en væsentlig samlet effekt af personskader (F = 3,94, p = 0,03). Parvise sammenligninger afslørede, TBI var signifikant forskellig fra både NAIVE og HUMBUG (p = 0.043 og p = 0,006., henholdsvis) (figur 5, nederst til højre). Derudover ved at sammenligne skade grupper på hver dag, ved hjælp af en en-vejs ANOVA, en væsentlig forskel var opdaget på dag 3 (F = 7.28, p = 0,003). Post-hoc sammenligning viste, TBI var forskellig fra FINGERET (p = 0.0018) (figur 5, øverst til højre). For forsøg 2, de gentagne foranstaltninger ANOVA fundet en signifikant forskel på grund af skade (F = 3,97, p = 0.029), med post-hoc parvise sammenligninger afsløre forskellen mellem TBI og HUMBUG (p = 0.017) (figur 5 , nederst til højre). En-vejs ANOVA hver dag fundet betydelige forskelle på dage 2 og 4. På dag 2 (F = 4.02, p = 0.028), Tukey's post-hoc test fandt, TBI var forskellige fra FINGERET (p = 0,023). På dag 4 (F = 4.12, p = 0.026), post-hoc analyse fandt en forskel mellem TBI og HUMBUG (p = 0,025) (figur 5, middle højre).

Figure 1
Figur 1. Diagram over vand-labyrint. Dette diagram viser de mulige platform steder (1, 2, 3, 4) og udgangspunkter (N, S, E, W) for arbejder hukommelse Morris vand labyrint. Rotter er tilladt to forsøg fra hver start placering/platform parring. Der er en 15 s indbyrdes retssag interval og 4 min hvile i en opvarmning kammeret mellem par forsøg for i alt fire par forsøg for hver daglig session. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Resultaterne af neuroscore test. Alle rotter blev uddannet til enkel refleks test opgaver før dag 0 (Se tekst for detaljer om træning, testning og scoring). Resultaterne er vist som median (sort streg), første og tredje kvartiler (grænserne for afkrydsningsfeltet), og 10th og 90th percentiler (fejllinjer). Middelværdien er også vist ved den røde linjer og fjerntliggende punkter som sorte prikker. Data præsenteres for dag 0 baseline og efter skade dage 1-3. Resultaterne af post-hoc t-test for hvert tidspunkt er vist på grafer: * p < 0,001 vs TBI dag 0; ^ p < 0,001 vs samme dag NAIV. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Resultaterne af stråle-Balance test. Alle rotter blev trænet til at balancere på strålen, indtil de kunne balancere for 60 s for tre på hinanden følgende forsøg (Se tekst for detaljer om træning, testning og scoring). På efterfølgende tests, blev rotter scoret på en skala fra 1-6 med 1 tilkendegiver normale balance og 6 betyder ingen forsøg på at bo på bjælken. Resultaterne er vist som median (sort streg), første og tredje kvartiler (grænserne for afkrydsningsfeltet), og 10th og 90th percentiler (fejllinjer). Middelværdien er også vist ved den røde linjer og fjerntliggende punkter som sorte prikker. Data er præsenteret for dag 0 baseline score, efter skade dage 1-3 (til venstre), og 6 måneder efter skade (til højre). Resultaterne af post-hoc t-test for hvert tidspunkt er vist på grafer. For dage 0-3: * P < 0,001vs TBI dag 0; ^ p < 0,001 vs samme dag NAIV; @ p < 0,001 vs samme dag HUMBUG. For 6 måneder: * p < 0,001vs TBI dag 0; # p < 0,001 vs NAIVE dag 0; & p < 0,001 vs SHAM dag 0. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Resultaterne af stråle-Walk test. Alle rotter blev trænet til at krydse strålen mens vævning mellem indlæg at flygte ind i et pengeskab. De blev trænet før de opfylder kriterierne i ≤ 5 s på tre på hinanden følgende forsøg (Se tekst for detaljer om træning, testning og scoring). Baseline test blev afsluttet på dag 0 og rotter blev efterfølgende testet på 1-3 dage efter skade (venstre). En delmængde af rotter blev også testes igen 6 måneder efter skade (til højre). Resultaterne gengivelsesegenskaberne som median (sort streg), første og tredje kvartiler (grænserne for afkrydsningsfeltet), og 10th og 90th percentiler (fejllinjer). Middelværdien er også fremgår af de røde linjer og fjerntliggende punkter som sorte prikker. Resultaterne af post-hoc test for hvert tidspunkt er vist på grafer. For dage 0-3: * P < 0,001vs TBI dag 0; ^ p < 0,001 vs samme dag NAIV; @ p < 0,001 vs samme dag SHAM; For 6 måneder: * p < 0,001vs TBI dag 0. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Resultaterne af arbejdshukommelse Morris vand labyrint. Resultaterne er vist for separate grupper af rotter på 3 måneder (venstre kolonne) og 12 måneder (højre kolonne). De øverste paneler viser de gennemsnitlige ventetid (tid, det tog rotter til at finde den skjulte platform) på de første forsøg med to-retssag parring for hver af de fem teste dage. De midterste paneler viser de gennemsnitlige ventetid i andet forsøg på hver dag. Resultaterne af post-hoc analyse er vist på grafer (* p < 0,05 vs samme dag SHAM; ^ p < 0,05 vs samme dag NAIVE). Panelerne lavere opsummere resultaterne viser median (sort streg), 25th og 75th percentiler (grænserne for afkrydsningsfeltet), og 10th og 90th percentiler (fejllinjer). Middelværdien er også vist ved den røde linjer og fjerntliggende punkter som sorte prikker. Resultaterne af post-hoc analyse er vist på grafer (*p < 0,05 vs samme retssag HUMBUG, ^ p < 0,05 vs samme retssag NAIVE). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Når udfører enhver type af adfærdsmæssige test, er det afgørende at være konsekvente. Denne detalje omfatter mange overvejelser, der synes ubetydeligt, men har en stor indflydelse på svaret af dyret. Et vigtigt skridt, der ikke kan være overset er acclimation af dyr til deres hjem-bur/boligsituation forud for enhver eksperiment. Denne forberedelse reducerer effekten af dyrenes fysiologiske stressrespons, som kan ændre adfærdsmæssige resultater18. Det er ligeledes absolut nødvendigt, at alt er lavet til at håndtere alle dyr på samme måde. Denne sammenhæng omfatter som tidligere nævnt, akklimatisering til boliger og også akklimatisering til håndtering og transport mellem værelser før træning eller test. Dette begreb kan ikke overvurderes. Sjusket animalske håndtering er katastrofalt at eventuelle adfærdsmæssige test19. Ligeledes, enhver indsats skal gøres til at teste dyr på det samme tidspunkt på dagen, hverken under deres mørk eller lys cyklus. For test diskuteret her, er test i lys eller mørk fase acceptabelt, så længe testene udføres konsekvent. Test udført på forskellige tidspunkter i løbet af døgnrytmen cyklus har vist sig at ændre adfærdsmæssige resultater18,20. Derudover skal handleren samt dyret være i en stress fri, rolig tilstand for at maksimere nøjagtigheden af resultaterne.

Især i forbindelse med Neuroscore er falske positiver og negativer fælles. Falske positiver opstår typisk, når et dyr ikke er fuldt vænnes til håndtering og test. Dyret skal være helt afslappet, så den observerede svar er refleksiv og ikke på grund af musklerne strammes fra reagerer ud af stress eller angst. En anspændt handleren kan påvirke resultaterne ved at overføre stress til dyret. Derfor, holde rotten for stramt eller for løst kan både være problematisk. Derudover hvis handleren er nervøs, kan det forvirre reaktion af rotter. Der er også den risiko, at en uerfarne iagttager vil misfortolke rottens svar. God uddannelse og en masse praksis er afgørende for succes og sammenhængen i Neuroscore.

Generelt, er den vigtigste bekymring med disse test manglen på en stor forskel, og nogle gange ingen forskel mellem behandlingsgrupper. Da dyr kan reagere forskelligt på forskellige handlere, lyde, tidspunkter af dagen, og potentielt, sæsoner21, skal alt sættes ind til at reducere alle mulige forstyrrende faktorer.

Resultaterne af stråle-Balance og Beam-gang opgaver vist her viser, at disse prøver er nyttige tidligt efter skade at opdage underskud i vestibulomotor funktion. Disse underskud typisk løse over tid1,14. I denne model, har med 6 måneder efter skade, skade-induceret underskud løst. Resultaterne af 6 måned tidspunkt tyder på at der er ingen forskelle mellem NAIVE, SHAM eller tilskadekomne rotter; men alle rotterne har været afslappende i deres hjem bure for 6 måneder, aldring og tager på i vægt. Således, når de er re-testet på 6 måneder efter operationen (eller tilsvarende i forbindelse med NAIVE), de væsentlige bliver gamle og fedt, og derfor alle grupperne ikke udføre så godt som de i forhold til deres grundlinje dag 0 resultater.

En anden vigtig overvejelse er, at adfærd test anvendes de korrekte test. For eksempel, menes test ansat her at repræsentere funktion af specifikke hjernen områder. Et eksempel er det vestibulære system, hvilket er vigtigt for balance. Hjernen områder involveret i sensorimotor funktion som cortex herunder sensorimotor cortex, thalamus, corticospinal neuroner, basale ganglier, nigro-striatum, for at nævne nogle få, er alle involveret i vestibulomotor koordinering. Således angive underskud i Beam-Balance eller stråle-gang potentielle underskud i disse områder. Desuden, hippocampus og præfrontal cortex er involveret i indlæring og hukommelse funktioner testet af arbejder hukommelse vand labyrint. Selv når den korrekte test er valgt, skal begrænsningerne af de test, der er ansat holdes for øje. For eksempel, er ingen af testene præsenteres her følsomme over for underskud i humør, såsom depression, angst eller sociale interaktioner aggression, beslutningstagning og impulsivitet. For at gentage, er det bydende nødvendigt at vælge den relevante test for området adfærd og hjernen skal evalueres.

Fortolkning og analyse af adfærdsmæssige data skal behandles med forsigtighed. Det anbefales stærkt at omfatte magt analyser af hver type prøvning separat, fordi ved hjælp af en adfærdsmæssige resultatet som en foranstaltning af neurale underskud, er i sagens natur, et groft mål for en subtil effekt. Desuden kræver forskellige tests forskellige typer af statistiske analyser. For eksempel, er de Neuroscore og stråle-Balance prøverne afhængige af fortolkningen af en uddannet observatør at score adfærd ved hjælp af en ordinal skala. Disse typer af data er ikke kontinuerlige og ikke normalt fordelt, så ikke-parametrisk statistik der bør anvendes som f.eks Kruskal-Wallis test, som vist i afsnit 6.1 og 6.2. Alternativt, Beam-gang og arbejder vand labyrint hukommelsestest producere data, der sammenhængende og normalt fordelt, så parametrisk statistik der kan bruges som en-vejs ANOVA eller gentages-foranstaltninger to-vejs ANOVA, som vist i afsnit 6.3 og 6.4.

Adfærdsmæssige opgaverne præsenteres her har stået sin prøve af tid og giver reproducerbare resultater, især når parret med FPI model i rotter, selvom der findes mange andre metoder til adfærdsmæssige test for hjerneskade. Neuroscore er en kort vurdering udført med et minimum af udstyr. Andre tests af reflekser og styrke er tilgængelige og kan integreres i en neurologisk vurdering, som den laterale pulsion opgave, akinesi test, den skrå plan test og gribestyrke (Se Fujimoto et al. 22 og guld et al. 23). the Beam-Balance og Beam-gang opgaver beskrevet er foranstaltninger af vestibulomotor underskud efter skade. Vestibulomotor koordinering kan betragtes som én foranstaltning brutto bevægeapparatet adfærd, mens andre foranstaltninger af brutto bevægeapparatet underskud omfatter Rotarod, roterende stangen, og åbne felt aktivitet. Evnen til at svømme, er målt som svømme hastighed under vand-labyrint, også en indikation af gross motor koordinering22,23. Arbejder hukommelse vand labyrint opgave fuldender dette sæt af test af afsløre både reference hukommelse underskud (angivet af retssagen 1) og arbejder hukommelse underskud (angives af forsøg 2 eller forskellen mellem retssag 1 og forsøg 2). Andre foranstaltninger af kognitiv funktion omfatter otte arm radial labyrint, Barnes labyrint, Roman objekt anerkendelse test og forskellige varianter af vand-labyrint. Disse variationer omfatter den oprindelige Morris vand labyrint og Lashley III labyrint (igen se Fujimoto et al. 22 og guld et al. 23). dette batteri af tests har vist sig for at være nyttige tidligt efter skade og i varierende grader, ud til 12 måneder efter skade1.

Derudover kan de opgaver, der er vist her bruges med forskellige stammer, køn og alder af rotter; accommodations kan dog være nødvendigt at være lavet i forskellige størrelser og i tilfælde af større skrøbelighed. For eksempel ældre, tungere rats savn en bredere stråle stråle-Balance opgave og ældre, svagelige rotter, kan brug for kortere varighed af svømme gange i vandet labyrint. Således er der plads til fleksibilitet i disse test og potentiale for udvikling af ny test til at rumme forskellige situationer og hypoteser.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takke Ian Bolding for bistand med kirurgisk forberedelse af emner og Elizabeth Sumner til hendes omhyggelig redigering. Disse undersøgelser blev gennemført som en del af et team, der er finansieret af The Moody projekt for Translationel traumatisk hjerne skade forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley rats Charles Rivers Laboratories
251 Ballardvale St
Wilmington, MA 01887-1096
Phone: 800-522-7287		 CD-IGS rats, strain code 001 male, albino, 300-350g at arrival
Name Company Catalog Number Comments
Beam-Balance
Beam home built wood, 25" l x 1" h x 3/4" w sealed with polyurethane varnish
C-clamp Home Depot 1422-C 2 1/2"
barrier Home Depot styrofoam, 18" x 17 1/2"
table (for both BB & BW) generic office supply 37" h x 30" w x 60" l
Name Company Catalog Number Comments
Beam-Walk
Beam home built wood 38-1/2" l x 1-3/4" h x 1" w sealed with polyurethane varnish (~ 37" off floor)
escape box home built woodpainted black 12 1/2 " l x 9" h x 7-1/4" w
nails (pegs) 2"
hinges
clamps
white noise machine San Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121
Phone: (858)530-2600		 http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf
light Home Depot
Name Company Catalog Number Comments
Morris Water Maze
fiberglass pool manufacturer unknown
(similar to one made by SDI) San Diego Instruments 7000-0723 72" diameter x 30" deep (~ 500 gal)
plexiglass platform hand-made by Maggie Parsley 10 cm diameter, 26" tall with silicone applied to the surface of the platform to provide a gripping surface
(similar to one made by SDI) SDI 7500-0272
plexiglass animal boxes w/ lids UTMB Machine Shop 2 boxes, 10" w x 16" L x 9" h
spot lights/ heat lamps Home Depot 3 around pool, 2 over boxes to dry animals
AnyMaze San Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121
Phone: (858)530-2600		 /9001 http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sell, S. L., Johnson, K., DeWitt, D. S., Prough, D. S. Persistent Behavioral Deficits in Rats after Fluid Percussion Injury. J Neurotrauma. 34 (5), 1086-1096 (2017).
  2. Gurdjian, E. S., Lissner, H. R., Webster, J. E., Latimer, F. R., Haddad, B. F. Studies on experimental concussion: relation of physiologic effect to time duration of intracranial pressure increase at impact. Neurology. 4, 674-681 (1954).
  3. Anonymous. US National Library of Medicine. , (last accessed Jan. 9, 2018) www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/$term=fluid+percussion+injury+rat (2017).
  4. Hellmich, H. L., Capra, B., Eidson, K., Garcia, J., Kennedy, D., Uchida, T., et al. Dose-dependent neuronal injury after traumatic brain injury. Brain Research. 1044, 144-154 (2005).
  5. Bramlett, H. M., Detrich, W. D. Long-Term consequences of Traumatic Brain Injury: Current Status of Potential Mechanisms of Injury and Neurological Outcomes. J. Neurotrauma. 32, 1-15 (2015).
  6. Pierce, J. E. S., Smith, D. H., Trojanowski, J. Q., McIntosh, T. K. Enduring cognitive neurobehavioral and histopathological changes persist for up to one year following severe experimental brain injury in rats. Neuroscience. 87 (2), 359-369 (1998).
  7. Smith, D. H., Chen, X. H., Pierce, J. E. S., Wolf, J. A., Trojanowski, J. Q., Graham, D. I., McIntosh, T. K. Progressive atrophy and neuron death for one year following brain trauma in the rat. J Neurotrauma. 14 (10), 715-727 (1997).
  8. Schallert, T. Behavioral tests for preclinical intervention assessment. NeuroRx. 3 (4), 497-504 (2006).
  9. Sell, S. L., Avila, M. A., Yu, G., Vergara, L., Prough, D. S., Grady, J. J., DeWitt, D. S. Hypertonic resuscitation improves neuronal and behavioral outcomes after traumatic brain injury plus hemorrhage. Anesthesiology. 108 (5), 873-881 (2008).
  10. Hamm, R. J. Neurobehavioral assessment of outcome following traumatic brain injury in rats: an evaluation of selected measures. J Neurotrauma. 18 (11), 1207-1216 (2001).
  11. Feeney, D. M., Gonzalez, A., Law, W. A. Amphetamine, haloperidol, and experience interact to affect rate of recovery after motor cortex injury. Science. 217, 855-857 (1982).
  12. Hamm, R. J., Temple, M. D., Pike, B. R., O'Dell, D. M., Buck, D. L., Lyeth, B. G. Working memory deficits following traumatic brain injury in the rat. J Neurotrauma. 13, 317-323 (1996).
  13. Morris, R. G., Hagan, J. J. Allocentric spatial learning by hippocampectomised rats: A further test of the "Spatial Mapping" and "Working Memory" Theories of hippocampal function. The Quart J of Exp Psych. 38 (4), 365-395 (1986).
  14. Dixon, C. E., Lyeth, B. G., Povlishock, J. T., Findling, R. L., Hamm, R. J., Marmarou, A., Young, H. F., Hayes, R. L. A fluid-percussion model of experimental brain injury in the rat. J. Neurosurg. 67, 110-119 (1987).
  15. DeWitt, D. S., Smith, T. G., Deyo, D. J., Miller, K. R., Uchida, T., Prough, D. S. L-arginine and superoxide dismutase prevent or reverse cerebral hypoperfusion after fluid-percussion traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 14, 223-233 (1997).
  16. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2017).
  17. Pohlert, T. The Pairwise Multiple comparison of Mean Ranks Package (PMCMR) R package. , http://CRAN.R-project.org/package=PMCMR (2014).
  18. Verma, P., Hellemans, K. G., Choi, F. Y., Yu, W., Weinberg, J. Circadian phase and sex effects on depressive/anxiety-like behaviors and HPA axis responses to acute stress. Physiol Behav. 99, 276-285 (2010).
  19. Schallert, T., Woodlee, M. T., Fleming, S. M. Experimental Focal Ischemic Injury: Behavior-Brain Interactions and Issues of Animal Handling and Housing. ILAR J. 44 (2), 130-143 (2003).
  20. Ruis, J. F., Rietveld, W. J., Buys, J. P. Properties of parametric photic entrainment of circadian rhythms in the rat. Physiol Behav. 50, 1233-1239 (1991).
  21. Ferguson, S. A., Maier, K. L. A review of seasonal/circannual effects of laboratory rodent behavior. Physiol Behav. 119, 130-136 (2003).
  22. Fujimoto, S. T., Longhi, L., Saatman, K. E., McIntosh, T. K. Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury. Neurosci & Biobehav Reviews. , (2004).
  23. Gold, E. M., Su, D., Lopez-Velazquez, L., Haus, D. L., Perez, H., Lacuesta, G. A., Anderson, A. J., Cummings, B. J. Functional assessment of long-term deficits in rodent models of traumatic brain injury. Regen. Med. 8 (4), 483-516 (2013).

Tags

Adfærd sag 131 adfærd neuroscore beam-balance beam-walk arbejdshukommelse hjerneskade væske-percussion skade Morris vand labyrint rotte
Påvisning af adfærdsmæssige underskud i rotter efter traumatisk hjerneskade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hausser, N., Johnson, K., Parsley,… More

Hausser, N., Johnson, K., Parsley, M. A., Guptarak, J., Spratt, H., Sell, S. L. Detecting Behavioral Deficits in Rats After Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (131), e56044, doi:10.3791/56044 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter