Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Opsporen van gedrags tekorten in ratten na traumatisch hersenletsel

Published: January 30, 2018 doi: 10.3791/56044
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

Het doel van de gedragsmatige tests die hier gepresenteerd is om op te sporen van functionele tekorten bij ratten na traumatisch hersenletsel. Vier specifieke tests worden gepresenteerd die detecteren van tekorten in gedrag aan de schade aan specifieke hersengebieden soms uit te breiden tot één jaar na blessure.

Abstract

Met de toenemende incidentie van traumatische hersenenverwonding (TBI) in zowel civiele als militaire populaties, TBI wordt nu beschouwd als een chronische ziekte; echter hebben weinig studies onderzocht de langetermijneffecten van letsel in knaagdier modellen van TBI. Hier worden weergegeven zijn gedrags maatregelen die gevestigd in TBI onderzoek voor tijden vroeg na schade, zoals twee weken, tot twee maanden zijn. Sommige van deze methoden zijn eerder gebruikt op latere tijdstippen na letsel, omhoog tot één jaar, maar door weinig laboratoria. De methoden aangetoond hier een korte neurologische beoordeling om te testen reflexen, een Beam-evenwicht aan het testen van evenwicht, een Beam-wandeling voor het testen van balans en coördinatie van de motor, en een werkversie van het geheugen van de Morris water maze die kan gevoelig zijn voor tekorten in verwijst naar geheugen. Mannelijke ratten werden behandeld en vooraf getraind om neurologische, evenwicht, en motorische coördinatie test vóór parasagittal vloeistof percussie letsel (FPI) of sham schade ontvangen. Ratten kunnen worden getest op de korte neurologische beoordeling (neuroscore), de bundel-evenwicht, en de Beam-wandeling meerdere malen tijdens het testen van op het water labyrint kan alleen worden gedaan eenmaal. Dit verschil is omdat ratten de taak herinneren kunnen, dus daarmee de resultaten als herhaald testen wordt geprobeerd in hetzelfde dier. Bij het testen van één tot drie dagen na blessure, worden significante verschillen aangetroffen in alle drie niet-cognitieve taken. Verschillen in de Beam-Walk taak waren echter niet waarneembaar op latere tijdstippen (na 3 maanden). Tekorten zijn waargenomen bij 3 maanden in de Beam-balans en bij 6 maanden in de neuroscore. Tekorten in het werkgeheugen zijn aangetroffen uit tot 12 maanden na verwonding, en een tekort in een referentie-geheugen verscheen voor het eerst op 12 maanden. Zo kunnen gedrags standaardtests nuttige maatregelen van permanente gedrags tekorten na FPI.

Introduction

De hier gepresenteerde methoden zijn ontworpen om het detecteren van functionele tekorten in specifieke hersengebieden geïnduceerd door een experimenteel model van TBI in de rat. Vier verschillend gedrag tests worden beschreven. Ten eerste, de korte neurologische beoordeling, hierna aangeduid als de neuroscore, kan worden uitgevoerd zonder een gespecialiseerde apparatuur maar vereist praktijk; deze test detecteert tekorten in reflexen. Ten tweede detecteert detest Beam-evenwicht tekorten in het vermogen om evenwicht te brengen. Deze taak vereist van de handler te scoren de rat gebaseerd op een ordinale schaal en vereist enige training van de handler. De Beam-Balance test vereist een smalle bundel en is gevoelig voor tekorten in het vestibulair systeem. De derde test beoordeelt vestibulomotor coördinatie. Deze test staat bekend als de Beam-Walk taak, en hoewel sommige pre opleiding van de rat vereist is, deze procedure is objectiever dan de vorige twee zoals de latentie te doorkruisen de lichtbundel een objectieve maatstaf niet afhankelijk van subjectieve scoren is. Dit verschil is omdat de tijd om te doorkruisen een smalle bundel te bereiken een veilige doos wordt gemeten. De Beam-Walk test vereist een langere lichtbundel dan het Beam-evenwicht, evenals een doos ontsnappen. Deze test meet tekorten in zowel motorische coördinatie en evenwicht en zo is gevoelig voor schade aan het cerebellum en de motor verwante hersengebieden. De werkversie van het geheugen van de Morris water maze (MWM-WM) test voornamelijk hippocampal functie en integratie met de prefrontale cortex of uitvoerende functie. De versie van de Morris water maze komt te staan is ook bruikbaar voor de opsporing van tekorten in verwijzing geheugen1.

Deze methoden werden gekozen op basis van hun gevestigde track record in de literatuur. Elk effectief geweest in vele handen van verschillende laboratoria met meerdere stammen van ratten over verschillende jaren van onderzoek. Echter in het verleden maatregelen na letsel tot twee weken nadat de schade werden beschouwd als "chronische" tijd punten. Dus, om vast te stellen gedrags technieken voor de studie van chronische effecten van TBI in knaagdieren, deze bekende methoden nodig om te worden geëvalueerd om de gevoeligheid voor het detecteren van TBI veroorzaakte tekorten op langere tijd punten na blessure. Hoewel er nu verschillende knaagdieren modellen van TBI, de FPI-model is een van de meest gebruikte, en wordt toegepast in deze studie. Dit model werd voor het eerst gepubliceerd in de jaren 1950-2, en sindsdien hebben meer dan 1.000 artikelen FPI werkzaam in ratten3. Het neuropathologie van dit soort schade is goed beschreven door ons4 en anderen5,6,7. Kort, neuronale schade in de hippocampus is gebleken te zijn dosisafhankelijk met fluor-Jade kleuring op korte momenten na schade, dat wil zeggen, 24-48 h; terwijl het bruto atrofie en cavitatie heeft inclusief dunner worden van de interne capsule en de cortex gemeld één jaar na letsel6,7.

De meest betekenisvolle vertegenwoordiging van hersenfunctie wordt beoordeeld met behulp van gedragsmatige resultaat maatregelen na een experimentele hersenletsel. Echter, de overgrote meerderheid van FPI experimenten die gebruikmaken van gedrags resultaten maken maatregelen relatief vroeg, meestal van 1 tot 14 dagen na blessure. Met behulp van de methoden hier gedemonstreerd, dat sommige gedrags tekorten kunnen worden gedetecteerd uit tot 12 maanden na letsel1. Neurologische functie, bruto vestibulomotor functie en fijne motorische coördinatie werden beoordeeld op na letsel dagen (PID's) 1-3 en op 3, 6 en 12 maanden na de operatie, met behulp van een korte neurologische beoordeling (Neuroscore; gewijzigd van Schallert8), de Beam-evenwicht taak en de Beam-Walk taak9,10,11. Referentie- en werkgeheugen zijn beoordeeld met behulp van een werkversie van het geheugen van de Morris water maze1,12,13.

Protocol

Alle dierproeven zijn eerst goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de Universiteit van Texas Medical Branch, Galveston, Texas, zoals aangegeven door de nationale instituten van gezondheid gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (8ste editie, National Research Council).

1. chirurgische ingrepen en vloeistof percussie TBI

  1. Volwassen mannelijke 300 g Sprague-Dawley ratten te verkrijgen van een leverancier en huis twee per kooi met voedsel en water ad libitum in een vivarium met constante omstandigheden: licht cyclus (600 h tot 1800 h), temperatuur (21 ° C tot 23 ° C) en luchtvochtigheid (40-60%).
  2. Voorafgaand aan de operatie, de ratten te behandelen gedurende drie tot vijf dagen, en vervolgens de ratten te trainen voor de Neuroscore, Beam-evenwicht en Beam-Walk procedures van één tot drie dagen vóór de nulmeting. Het gedrag van de nulmeting van de dag of de ochtend voorafgaand aan de operatie.
    Opmerking: Bereiden altijd controle ratten, zoals sham bediende of operatief naïef ratten op dezelfde wijze als die een blessure ontvangt en ofwel willekeurig of op een evenwichtige wijze, de ratten in de behandeling groepen groeperen.
  3. Chirurgie onder aseptische condities (steriele instrumenten, schone chirurgische toga's, steriele handschoenen, maskers en hoofd covers) uitvoeren.
  4. Anesthetize ratten met behulp van Isofluraan op 4% voor de inductie en 1,5-2% voor onderhoud. Intubate en mechanisch ventileren de ratten (met behulp van Isofluraan in lucht: zuurstof (70:30) en voorbereiden van de parasagittal vloeistof-percussion letsel als eerder beschreven14,15.
  5. Infiltreren wond plaatsen met 0,10% bupivicane voorafgaand aan hechten en voeg rectale paracetamol zetpil (120 mg/kg) voorafgaand aan het ontwaken van de verdoving. Bewaken van ratten gedurende ten minste 4 uur tijdens de herstelperiode en de volgende dag voor tekenen van infectie, ernstige neurologische schade (bijv. verlamming) of ernstige ongemak (b.v. blijvende slaapmuizen positie).
    Opmerking: Ratten vertonen een van deze symptomen moet euthanized (4% Isofluraan in een verdoving zaal gevolgd door onthoofding).

2. Neuroscore opleiding en testen

  1. Neuroscore opleiding
    1. Voor opleiding op ratten bekend naïef te zijn experimenteel, lopen door de tests in de volgende volgorde (stappen 2.2.1-2.2.5) van start tot finish, terug naar de kooi voor 1 min, dan herhaal tot een score van nul wordt bereikt.
    2. Mark scoort op de scorekaart voor een record van de proeven van de opleiding voor elke rat. Na de training, uitvoeren van een testsessie (zie hieronder) op de dezelfde of volgende dag.
      Opmerking: Als de testsessie geen een nul score voor de basislijn produceert, opleiding en testen kunnen worden herhaald of de rat kan worden omgeleid naar een niet-gedrag-experiment.
  2. Neuroscore testen
    Opmerking: De tests in de volgende volgorde, terug te keren naar de kooi voor 1 min, doorlopen en herhaal vervolgens tweemaal voor een totaal van drie keer.
    1. Voorpoot flexie test
      1. Til de rat door de staart en houd ongeveer 6-12 duim boven de tabel oppervlak.
      2. Observeer de rat breidt of buigt voorpoten. Score van de aanwezigheid van flexie (1) of afwezigheid (0).
        Opmerking: Flexie, is ongebruikelijk. Mogelijke score van 1 x 3 = 3 (totale mogelijk = 3).
    2. Stuk flexie test
      1. Til de rat door de staart en houd ongeveer 6-12 duim boven de tabel oppervlak.
      2. Observeer de rat breidt of hindlimbs buigt. Score van de aanwezigheid van flexie (1) of afwezigheid (0).
        Opmerking: Flexie, is ongebruikelijk. Mogelijke score van 1 x 3 = 3 (cumulatieve totale mogelijk = 6).
    3. Visueel geactiveerd plaatsen test
      1. Til de rat door de staart.
      2. Langzaam lager de rat naar de rand van de tabel totdat de neus ongeveer 10 cm vanaf de rand is.
      3. Verplaatsen van de rat langzaam naar de rand (niet toestaan de snorharen te raken de rand).
      4. Observeer of de rat bereikt en zich uitstrekt van forepaws naar de tabel. Score van de aanwezigheid (0) of afwezigheid (1) forepaws uit te breiden.
        Opmerking: Voor de tabel in reactie op visuele signalen bereiken is normaal. Mogelijke score van 1 x 3 = 3 (cumulatieve totale mogelijk = 9).
    4. Contact geactiveerd plaatsen test
      1. Houd de rat, met lichaam in de hand, parallel aan de randen van de tabel en voorpoten gratis.
      2. Langzaam lager de rat naar de rand van de tabel totdat de snorharen aan de ene kant de rand van de tafel raken.
      3. Let op of de rat de voorpoot aan dezelfde kant als de snorharen dat de tabel naar de rand van de tabel zijn ontroerend breidt, zodra de snorharen touch.
        Opmerking: Verdieping van deze reactie duurt aanzienlijke praktijk en onderzoekers moeten goed opgeleid zijn voor het uitvoeren van deze test consequent.
      4. Score van de aanwezigheid (0) of afwezigheid (1) naar de tabel te bereiken.
        Opmerking: Bereiken in reactie op tactiele stimulatie is normaal. Mogelijke score van 1 x 3 = 3 (totale mogelijk = 12).
      5. Herhaal de stappen 2.2.4.1-2.2.4.4 voor de andere kant. Mogelijke score van 1 x 3 = 3 (cumulatieve totale mogelijk = 15).
    5. Hindpaw grijpen reflex test
      1. Houd de rat in de ene kant met duim en wijsvinger rond de borst onder de voorpoten.
      2. Zachtjes aanraken de palm van de één hindpaw met de andere wijsvinger.
      3. Let op of de rat de wijsvinger grijpt. Score van de aanwezigheid (0) of afwezigheid (1) voor het grijpen.
        Opmerking: Grijpen is normaal. Mogelijke score van 1 x 3 = 3 (totale mogelijk = 18).
      4. Herhaal de stappen 2.2.5.1-2.2.5.3 voor de andere kant. Mogelijke score van 1 x 3 = 3 (totale mogelijk = 21).
    6. Scoren
      1. Som van de scores voor een mogelijke cumulatieve totaal van 7 x 3 = 21. Een score van nul is normaal.

3. beam-evenwicht opleiding en testen

  1. Apparatuur
    1. Gebruik een straal 60 cm in lengte, 1,75 cm in de breedte, hoogte, 4,0 cm instellen 90 cm van de vloer, met een barrière 30 cm hoog, 30 cm in breedte Beveilig de lichtbundel naar een tabel met de barrière gekoppeld zodat dat 50 cm van de lichtbundel uit de barrière, weg van de tafel steekt.
    2. Plaats een gepolsterde Kluisje onder de balk te verzachten van de gevolgen van de ratten die vallen.
  2. Beam-evenwicht opleiding
    1. 24-48 uur voor de ingreep, de rat op de balk voor een 60 s proef te plaatsen.
    2. Als de rat mislukt om het evenwicht op zijn eigen, laat de rat te vallen in de kluis.
    3. Beginnen timing wanneer de rat veilig op de lichtbundel is geplaatst.
    4. Observeren van de rat voor de 60 s periode en tarief haar prestaties op basis van de volgende schaal: 1 = Shows stabiel evenwicht (bruidsparen, wandelingen, probeert te klimmen van de barrière), 2 = Shows wankel evenwicht (grijpt zijden van de balk en/of wankele bewegingen), 3 = probeert om evenwicht maar slips o r draait op de lichtbundel loopt vast op door het knuffelen van de bundel, 4 = probeert om evenwicht, maar valt na 10 s, 5 = loopt vast via of vanaf de lichtbundel en valt uit in jonger dan 10 s, 6 = Falls uit, geen toelegden op het evenwicht of hangen op de balk.
    5. De score op het werkblad opnemen.
    6. Toestaan dat de rat om uit te rusten voor 15 s in kooi, herhaalt u stappen 3.2.1-3.2.5 totdat de rat behaalt drie scores van 1 of 2. De rat wordt dan beschouwd als opgeleid.
    7. Een pre beoordeling op 24 h of op de dag van de operatie voorafgaand aan de operatie uit te voeren.
  3. Beam-evenwicht testen
    1. Vanaf 24 h na de chirurgie en voor maximaal 4 dagen blijven, test de rats dagelijks.
      1. Plaats de rat op de balk en de timer te starten. Observeer de rat nauw voor 60 s. Record de score op het werkblad.
      2. De rat terugkomen met de kooi voor een korte rustperiode (1-3 min).
      3. Herhaal de stappen 3.3.1.1-3.3.1.2 voor een totaal van drie proeven.

4. beam-Walk opleiding en testen

  1. Apparatuur
    1. Gebruik een houten balk 100 cm lang en 2,5 cm breed, en 4,0 cm in hoogte.
    2. Bereiden van een verstelbare standaard, een verstelbare tafel en vier pinnen, 2 cm in hoogte, en een zwarte doel vak 28 cm in lengte, 18 cm hoog en 18 cm breed, met een opening op een einde groot genoeg is voor de rat te passeren.
    3. Sluit het uiteinde van de doelstelling van de lichtbundel aan de open zijde van het vak doel dat op de verstelbare tafel wordt geplaatst. De heldere licht en white noise generator in de buurt van het begin einde van de lichtbundel plaats. Het begin einde van de lichtbundel is bevestigd aan de verstelbare standaard, zodat de straal en de vak op hetzelfde niveau, ongeveer 1 m boven de vloer zijn.
  2. Beam-Walk opleiding
    1. Start opleiding van 24-48 uur voor de ingreep.
    2. Plaats de rat in het vak doel voor 1 min. Na 1 minuut, verwijder de rat en start van het proces.
    3. Om te beginnen met het proces, zet op het licht en de witte ruis en de rat plaats op de bundel op de locatie van het pen-gat dichtst bij het vak doel en laat de rat in te voeren van het vak doel.
    4. Wanneer de rat voorkant voeten Kruis de drempel van het doel-vak, schakelt onmiddellijk uit de bronnen van het licht en geluid (dit is het einde van een proces).
    5. Toestaan dat de rat om uit te rusten in het vak doel voor 30 s tussen elk afzonderlijk experiment.
    6. Herhaal de procedure in stap 4.2.3-4.2.5 tweemaal op elke locatie van peg en vanaf de beginpositie. Plaats de haringen in de gaten en voer een volledige Beam-wandeling met de haringen in plaats.
    7. Drie getimede Beam-Walk proeven worden uitgevoerd.
      1. Verwijder de rat uit het vak doel. Zet het licht en de witte ruis en start van de stopwatch bij het plaatsen van de rat op de balk. Stop de stopwatch onmiddellijk wanneer de rat voorkant voeten overschrijden van de drempel van het vak doel, en vervolgens onmiddellijk uit het licht en lawaai schakelt.
      2. Neem de tijd op het werkblad.
      3. Herhaal stappen 4.2.7.1-4.2.7.2 totdat de rat drie keer van 5 bereikt heeft s of minder. De rat wordt nu beschouwd als opgeleid.
  3. Beam-Walk nulmeting
    1. Op de dag of de ochtend voorafgaand aan de operatie, doen drie getimede proeven met haringen in plaats.
    2. Allereerst brengen de rat in het vak doel voor 30 s. verwijderen de rat van het vak doel en draai de witte ruis en licht. Plaats de rat op het einde van de start van de lichtbundel en start gelijktijdig de stopwatch. Wanneer de rat voorkant voeten over de drempel van het vak doel, onmiddellijk uitschakelen van de bronnen van licht en geluid en stoppen van de timer.
    3. Neem de tijd op het werkblad. Toestaan dat de rat te blijven in het vak doel voor 30 s.
    4. Herhaal de stappen 4.3.2-4.3.3 om drie latencies zijn opgenomen op het werkblad. Terug de rat naar de kooi nadat drie getimede tests zijn voltooid.
  4. Beam-Walk testen
    1. Test de rats dagelijks 24u beginnen na de operatie en verder voor tot 4 dagen. Drie getimede proeven zoals in 4.3 stappen uit te voeren.

5. werken geheugen Water doolhof

  1. Apparatuur
    1. Gebruik een tank gevuld met water tot een hoogte van 28 cm en onderhouden bij 26 ± 1 ° C.
    2. Gebruik een duidelijk acryl glas-platform dat is 10 cm diameter op een stand 26 cm in hoogte.
      Opmerking: De oppervlaktelaag van het platform moet worden bedekt met silicium in de vorm van een cirkel met een X overheen. Dit maakt de ratten te klimmen op het platform en geeft hen tractie, zodat ze niet doen glijden.
    3. Verzamel een stopwatch, een warmte lamp, wegwerpbare handdoeken, absorberend pads, extra kooien en een kleine, lange-orige aquariumvissen netto. Gebruik een geautomatiseerde video tracking systeem dat is aangesloten op een videocamera om te registreren de rat zwemmen en stuur de gegevens naar de computer. Sla de video en gegevens op de computer voor een latere anayse.
  2. Werken met het testen van geheugen water doolhof
    1. Geef de ratten vier paren van proeven elke dag gedurende vijf opeenvolgende dagen, het platform plaats in elk van de vier kwadranten en start van de ratten uit elk van de vier uitgangspunten (N, S, E, W), zoals hieronder beschreven.
    2. Eerst definiëren de startende locatie-platform paren om te worden gebruikt gedurende het gehele experiment.
      Opmerking: De volgorde van de kwadranten waar het platform zich bevindt en het startpunt gebruikte moet worden in een andere volgorde voor elk van de vijf dagen van zwemmen, maar hetzelfde voor elke rat.
      1. Gebruik vier uitgangspunten (N, S, E of W) en vier platform locaties (kwadrant 1, 2, 3 of 4; Figuur 1). Bijvoorbeeld (N, 2; E, 4; S, 1; W, 3; Zie Figuur 1). Plan een evenwichtige orde (niet willekeurig) om te voorkomen dat uitgangspunten te dicht naar de perrons (geen enkel begin punt is het hetzelfde Kwadrant als de locatie van het platform). Instellen van een gegevensblad met behulp van de kwadranten platform en vier uitgangspunten.
      2. Schrijven van een protocol voor de video tracking software te gebruiken om video van de ratten zwemmen en opgegeven gegevens te verzamelen (b.v., duur van zwemmen, snelheid, afstand reisde voor het vinden van het platform).
        Opmerking: De opsporingssoftware zal automatisch stoppen met registreren na de opgegeven periode. Het protocol moet laten waar het platform wordt gebracht, hoeveel proeven uit te voeren per dier, en hoeveel dieren zal worden getest per sessie opgeeft, en ook de maximumduur die is toegestaan (bijvoorbeeld120 s).
      3. Test 4-6 ratten per sessie.
        Opmerking: meer dan 6 ratten maken van een probleem in de timing tussen ratten en kunnen leiden tot fout door de handler. De opwarming van de aarde vakken ook komen vol.
    3. Proef 1
      1. Open de video voor het bijhouden van software en het juiste protocol, met inbegrip van de water doolhof kaart laden.
      2. Plaats van het platform op de toegewezen locatie (bijvoorbeeld2; Figuur 1) en controleer of het overeenkomt met de kaart in de software. Bereiden de tracking-software om te beginnen wanneer de rat in het gezichtsveld van de videocamera.
      3. Plaats de rat in de tank geconfronteerd met de muur op de toegewezen locatie (bijvoorbeeldN; Figuur 1) en onmiddellijk de timer te starten.
      4. Laat de rat 120 s te vinden van het platform. Wanneer de rat het platform vindt, de timer stoppen en opnemen van de tijd op het werkblad. Als de rat mislukt te vinden van het platform, leiden tot het platform met de hand en noteert 120 s. toestaan de rat 15 s om te blijven op het platform.
    4. Proef 2
      1. Controleer of de software klaar voor proef 2 is. Plaats de rat terug in de tank op de dezelfde startpositie (N). Herhaal stap 5.2.3.4.
    5. Na de proef 2, plaats de rat in de verwarmde ruimte voor 4 min. zet het platform naar de tweede locatie (4; Figuur 1), en controleer of het overeenkomt met de kaart in de software.
    6. Herhaal Trial 1 en 2 procedures (stappen 5.2.3-5.2.4) tot alle vier vanaf locatie/platform paringen zijn voltooid.

6. de gegevensanalyse

  1. Neuroscore
    1. Handmatig overbrengen de handgeschreven resultaten naar een werkblad van de computer.
    2. Som van de resultaten voor elk afzonderlijk experiment om drie scores per rat op elke dag.
    3. Opmaak van de gegevens voor statistische analyse (hetzij in de indeling van het lang of breed afhankelijk van de voorkeur van de software).
      Opmerking: De lange notatie heeft één kolom voor behandeling (in dit geval, gevuld met "Naïef", "Schijn" of "TBI"), een enkele kolom voor dag (in dit geval "0", "1", "2" of "3"), en een kolom voor trial ("1", "2" of "3"). De grootformaat heeft één kolom voor elke combinatie van factor niveaus (dus één kolom voor naïef, dag 0, proef 1, een andere kolom voor naïef, dag 0, trial 2, enz.)
    4. De score voor elk dier gemiddeld op elke dag. Aangezien er drie proeven gedaan op elke dag waren zullen er drie waarden per dier per dag.
    5. Beoordelen of de gegevens zijn normaal verdeeld. Gebruik die een niet-parametrische statistische (bijvoorbeeldde Kruskal-Wallis) testen om te analyseren of de score op elke dag anders tussen groepen is. In dit geval, aangezien deze gegevens niet continu, zijn ze niet normaal verdeeld.
    6. Om te bepalen waar de verschillen liggen, door post-hoc tests, zoals de de Tukey post-hoc analyse te doen.
      Opmerking: Hier, de R statistische software pakket16, de Kruskal.test()-functie en de functie van de posthoc.kruskal.nemenyi.test binnen de paarsgewijs meerdere vergelijking van bedoel rangen pakket (PMCMR)17 werden gebruikt.
    7. Daarnaast testen om te zien of er eventuele verschillen tussen dagen binnen elke groep.
      Opmerking: om bijvoorbeeld te zien als de SHAM-dieren zich anders gedragen op dag 0 ten opzichte van dag 1, dag 2 en dag 3. Om dit te doen, voert u een one-way herhaalde maatregelen ANOVA. Dit kan worden bereikt in R, met behulp van de functie van de ezANOVA binnen de ez-pakket.
    8. Als u wilt uitvoeren een herhaalde maatregelen ANOVA, controleer dan eerst de veronderstelling over de bolvorm.
      Opmerking: Hier, de gegevens wijzen erop dat de binnen factor (dag) doet meet de bolvorm veronderstelling voor NAÏEF en SHAM, maar niet voor TBI. Dus, is een correctie niet nodig voor NAÏEF of SHAM. Voor de TBI-gegevens, gebruikt u de Greenhouse-Geisser-correctie.
    9. Als er significante verschillen zijn gevonden, voert u een post-hoc test om te bepalen waar de verschillen liggen. Dit wordt bereikt in R, met behulp van de paarsgewijze t-test functie. Plot de resultaten als een boxplot, zoals wordt weergegeven in de representatieve resultaten (Figuur 2).
  2. Beam-evenwicht
    1. Handmatig de handgeschreven scores overbrengen naar een werkblad van de computer. Opmaak van de gegevens voor statistische analyse (hetzij in lang of breed formaat afhankelijk van de voorkeur van de software). Zie opmerking in stap 6.1.3.
    2. Gemiddeld de scores voor elke rat op elke dag, zodat elke rat een score per dag hebben zal. Om te testen of de score op elke dag anders tussen NAÏEF, SHAM en TBI is, te beoordelen of de gegevens zijn normaal verdeeld.
      Opmerking: In dit geval, omdat de gegevens niet continu zijn, deze gegevens zijn niet normaal verdeeld. Daarom gebruik van een niet-parametrische statistische toets (bijvoorbeeld, de test Kruskal-Wallis).
    3. Doen om te bepalen waar de verschillen liggen, post-hoc tests, bijvoorbeeld, de Tukey post-hoc analyse. Om te testen voor verschillen tussen dagen binnen elke groep van de behandeling, run een one-way herhaald maatregelen ANOVA (zie stap 6.1.7). Controleer de veronderstelling over de bolvorm.
      Opmerking: In deze studie, de gegevens wijzen erop dat de binnen factor (dag) voldoet niet aan de bolvorm aanname voor een van de groepen, zo gebruikt continuïteit correcties. Gebruik de broeikasgassen-Grier continuïteit correctie.
    4. Plot de resultaten op een Boxplot zoals aangegeven in de representatieve resultaten (Figuur 3).
  3. Beam-wandeling
    1. Handmatig overbrengen handgeschreven resultaten naar een werkblad van de computer. Het gemiddelde van de drie Beam-Walk latencies voor elk dier voor elke dag. Opmaak van de gegevens voor statistische analyse (zie stap 6.1.3).
    2. Beoordelen of de gegevens normaal wordt verdeeld.
      Opmerking: In dit geval, de gegevens continu, en is normaal verdeeld. Gebruik daarom een one-way ANOVA om te bepalen of de latentie op elke dag verschillend tussen naïef, SHAM en TBI.
    3. Om te zien of er enig verschil tussen dagen binnen een behandeling groep, voert u een one-way herhaalde maatregelen ANOVA. Controleer eerst de veronderstelling over de bolvorm.
      Opmerking: In deze studie, de gegevens wijzen erop dat de binnen factor (dag) niet voldoet aan de bolvorm aanname voor elk van onze groepen, zodat continuïteit correcties worden gebruikt. Gebruik de broeikasgassen-Grier-correctie.
    4. Plot de resultaten op een Boxplot zoals aangegeven in de representatieve resultaten (Figuur 4).
  4. Werken van geheugen water doolhof
    1. De gegevens van het werkblad of computer tracking-programma overbrengen naar een werkblad. Selecteer de resultaten te analyseren.
      Opmerking: Vele mogelijke uitkomsten zijn beschikbaar voor analyse van computer bijhouden van programma's. Voorbeelden van resultaten die zijn geselecteerd voor analyse kan omvatten: latency, weglengte, thigmotaxia en zwemmen snelheid. De meeste vaak gemeld resultaat latentie, zoals gebruikt in het gegeven voorbeeld.
    2. Opmaak van de gegevens voor statistische analyse (hetzij in lang of breed formaat afhankelijk van de voorkeur van de software).
      Opmerking: De lange notatie heeft één kolom voor behandeling (in dit geval, gevuld met "Naïef", "Schijn" of "TBI"), een enkele kolom voor dag (in dit geval "1", "2", "3", "4" of "5") en een enkele kolom voor trial (ofwel "1", "2", "3", "4", "5" "6", "7", of "8"). We moeten ook een extra kolom te identificeren van de poging ("1" of "2"). Grootformaat heeft één kolom voor elke combinatie van factor niveaus (dus bijvoorbeeld één kolom voor naïef, dag 1, proef 1, poging 1, een andere kolom voor naïef, dag 1, trial 2, poging 2). Het verschil tussen Trial 1 en Trial 2 kan ook worden berekend voor elke sessie en geanalyseerd als de score van een verschil.
    3. Om te vinden als er een totale verschil tussen de groepen van de schade is, moet u de volgende stappen uitvoeren.
      1. Eerst, het gemiddelde van de water doolhof latentie voor elk dier voor dag 1.
        Opmerking: Er waren vier sessies op elke dag, dus het gemiddelde van de vier waarden per dier voor elk van de Trial 1 en Trial 2. Deze berekening voor de resterende dagen zo goed doen.
      2. Uitvoeren om te controleren op schade verschillen algemene, een two-way herhaalde maatregelen ANOVA. Er zijn twee factoren, de schade en de dag. Leder letsel is een tussen groep factor en dag is een binnen groep factor. Opmerking: Hier R werd gebruikt.
      3. Als uit de resultaten blijkt een significant verschil als gevolg van letsel, voer dan van een Tukey post hoc test om te zien waar de verschillen liggen.
    4. Vind uit of er verschillen tussen de groepen van de schade op specifieke dagen de volgende stappen uitvoeren.
      Opmerking: Dag 1 wordt gebruikt als een voorbeeld, en dezelfde analyse moet gebeuren voor alle van de volgende dagen. Ook, is deze analyse gebeurt op verschillende manieren, eerst voor Trial 1 alleen voor Trial 2 alleen tweede en derde voor het verschil tussen Trial 1 en Trial 2. Proef 1 wordt gebruikt als een voorbeeld; dezelfde stappen moeten worden gebruikt voor de andere analyses.
      1. Eerst, het gemiddelde van de water doolhof latentie voor elk dier voor dag 1. Aangezien er vier herhalingen van "Trial 1" op elke dag waren, gemiddeld de vier waarden voor elk dier.
      2. Beoordelen of de gegevens normaal wordt verdeeld.
        Opmerking: In dit geval, de gegevens continu, en is normaal verdeeld. Daarom gebruiken de one-way ANOVA om te bepalen als de water doolhof latentie op dag 1 verschillend tussen NAÏEF, SHAM en TBI is. R statistische softwarepakket en de functie van aov() werden hier gebruikt.
      3. Het gebruik van een 5% niveau van betekenis. Als de resulterende p-waarde kleiner is dan 0,05, dan zijn er grote verschillen tussen de groepen.
      4. Gebruik van de Tukey post hoc test om te bepalen waar de verschillen liggen. Dit is de TukeyHSD() functie in R.
    5. Ga als volgt te werk als u wilt weten als er verschillen tussen dagen binnen behandelgroepen zijn.
      1. Voer eerst een one-way herhaalde maatregelen ANOVA. Dit kan worden bereikt in R, met behulp van de functie van de ezANOVA binnen de ez-pakket.
      2. Voordat u een herhaalde maatregelen ANOVA, controleer dan eerst de veronderstelling over de bolvorm.
        Opmerking: De binnen factor (dag) voldoet aan de bolvorm aanname voor alle groepen, dus er is geen behoefte aan continuïteit correcties gebruiken.
      3. Als er verschillen tussen de dagen worden gevonden (p-waarden die kleiner zijn dan 0,05), voer een post-hoc test om te bepalen waar de verschillen liggen. Deze stap wordt bereikt in R met de pairwise.t.test functie.
    6. Grafiek van de resultaten met behulp van lijngrafieken (Figuur 5). Ook, Trial 1-Trial 2 kan worden opgenomen in een grafiek.

Representative Results

Resultaten van de procedure neuroscore (Figuur 2) tonen aan zowel het potentieel voor vals positief (SHAM en TBI groepen op dag 0) als de gevoeligheid van deze test om het detecteren van kleine verschillen. Valse positieven kunnen optreden wanneer de rat is niet goed gewend aan de procedure, dus het is niet volledig ontspannen. Dag 0 is voorafgaand aan de operatie, dus een ideale dat alle ratten moeten bereiken het criterium van een score van 0 voorafgaand aan het invoeren van een studie. 1-3 dagen tonen de gevoeligheid van deze test voor de opsporing van kleine veranderingen in de partituur. Hoewel er een potentieel voor een score van maar liefst 21, zijn scores hoger dan 3 ongebruikelijk in dit model. In dit voorbeeld doorlopend maatregelen ANOVA bleek geen verschillen tussen dagen voor NAÏEF (p = 0.78) of SHAM (p = 0,09); voor de TBI-groep waren er echter verschillen tussen dagen (p < 0,05). Post-hoc paarsgewijze vergelijking aangegeven dat dag 0 aanzienlijk van dagen 1, 2 en 3 verschilt. Dit resultaat toont aan dat de schade geproduceerd kleine maar significante veranderingen in de neurologische beoordeling.

Nadere analyse met behulp van de test Kruskal-Wallis vergeleken NAÏEF, SHAM en TBI op elke dag, gevolgd door de de Tukey post hoc test om te bepalen waar de verschillen liggen. Voor dag 0, was het statistische proefresultaat 13.37, p = 0,001, en SHAM verschilde aanzienlijk van NAÏEVE (p = 0,008). In het ideale geval moet er geen verschillen tussen groepen op dag 0, zoals geen behandelingen of procedures hebben toegediend. In dit geval moeten de ratten worden verder gewend aan de procedure, of overgedragen aan een niet-gedrag-studie. Voor dag 1, het statistische proefresultaat was 32.39, p = 9.75e-8, met de post-hoc test, die aangeeft dat SHAM en TBI significant verschillend van NAÏEVE waren (p = 0.002, p = 5.9e-7, respectievelijk). Voor dag 2, was het statistische proefresultaat 23.39, p = 8.34e-6, en SHAM en TBI waren verschillend van NAÏEVE (p = 0.002, p = 6.8e-5). Voor dag 3, was het statistische proefresultaat 38,4, p = 4.59e-9, en voorts SHAM en TBI waren significant verschillend van NAÏEVE (p = 0,001, p = 2.1e-8, respectievelijk). Deze resultaten wijzen op het feit dat de voorbereiding van SHAM ook sommige tekorten bij neurologische beoordeling soms vroeg na blessure produceert.

Vertegenwoordiger Beam-evenwicht resultaten (Figuur 3) tonen de gevoeligheid van de test van de Beam-evenwicht tekorten kort na letsel (Figuur 3, links) en op een tijdstip meer na blessure (Figuur 3, rechts). De gevoeligheid van de test van de Beam-evenwicht aan de gevolgen van hersenletsel vermindert na verloop van tijd, omdat als de ongedeerd rats leeftijd en gewicht, ze moeite balanceren op de balk zijn toegenomen. Op latere tijdstippen, is de balk gedraaid zodat de ratten zijn balanceren op de brede kant van de lichtbundel. Echter uiterlijk 6 maanden na letsel is deze test niet meer gevoelig voor de effecten van letsel zoals leeftijd en/of gewicht de mogelijkheid verwarren voor het uitvoeren van de taak (Figuur 3, rechts). Anderzijds genezing kan hebben plaatsgevonden in het vestibulair systeem, en deze gegevens nauwkeurig overeen dat de ratten kunnen evenwicht hetzelfde niveau als de controlegroepen bereikt.

Bij het vergelijken van naïef, SHAM en TBI op elke dag, hebben we gebruikt detest Kruskal-Wallis. De resultaten voor tijdstippen vroeg verliet na letsel zijn afgebeeld in Figuur 3. Op dag 0, vond de Kruskal-Wallis-test de waarde van het statistische proefresultaat als 6.81, p = 0.033. Er was een significant verschil tussen de groepen, met de de Tukey post hoc test waaruit blijkt dat het naïef was groep anders dan SHAM (p = 0.038); alle drie de groepen had echter middelen goed onder 2.0, die aangeeft dat alle ratten hadden voldaan aan de criteria om door te gaan. Het zou wenselijk zijn dat er geen verschillen tussen groepen op dag 0, maar aangezien alle groepen onder 2, ze kunnen blijven in de studie. Op PID 1, was het Kruskal-Wallis statistische proefresultaat 69.72, p = 7.25e-16. Van de Tukey post hoc test bleek dat de TBI-groep sterk afwijkt van zowel de en naïeve Sham groepen (p = 4.9e-14, p = 9.1e-08, respectievelijk). Op dag 2, het statistische proefresultaat Kruskal-Wallis was 62.84 en p = 2.26e-14, met de post-hoc test toont TBI verschilt NAÏEF en SHAM (p = 1.0e-10, p = 2.1e-10 respectievelijk). Op dag 3, het statistische proefresultaat Kruskal-Wallis was 62.69 en p = 2.44e-14. De post-hoc test toonde TBI verschilt naïef en SHAM, (p = 9.6e-12, p = 1.7e-08, respectievelijk). Verder keken we om te zien of er eventuele verschillen tussen dagen binnen elke groep. Met behulp van een herhaalde ANOVA, uitvoeringsmaa NAÏEF, er waren geen verschillen tussen dagen (p = 0.367). Voor SHAM en TBI waren er verschillen tussen dagen (p = 0.002, p = 3.90e-29, respectievelijk). Post-hoc paarsgewijze vergelijkingen geopenbaard want SHAM dag 1 aanzienlijk van dag 2 en dag 3 verschilt (p = 0,001, p = 0,01, respectievelijk), en voor TBI, dag 0 is beduidend anders vorm dagen 1, 2 en 3 (p < 2e-16, p = 5.5e-16, en p = 2.7e-13, respectievelijk). Dag 1 is ook beduidend verschillend van dag 3 (p = 0,036).

Op 6 maanden na blessure, werden vergelijkingen tussen NAÏEF, SHAM en TBI gemaakt op elke dag met de Kruskal-Wallis test (Figuur 3, rechts). Op dag 0, de waarde van het statistische proefresultaat was 3.36 en p = 0.187, zodat er geen verschillen op dag 0 waren. Alle middelen werden onder 2, die aangeeft dat alle ratten en groepen voldoet aan de criteria om te zetten in de studie. Op PID 1, was het statistische proefresultaat 6.11, p = 0,047; post-hoc analyse met behulp van Tukey post hoc test bleek echter dat geen van de groepen significant verschillend waren bij de administratieve verwerking voor meerdere hypothesen. Op dag 2, was het statistische proefresultaat 4.09, p = 0.13, ns, en op dag 3, was het statistische proefresultaat 2.91, p = 0.23, ns. Er waren dus geen verschillen tussen de groepen van de schade op een bepaalde dag.

Bovendien kijken naar verschillen tussen dagen binnen behandelgroepen, een herhaalde maatregelen ANOVA bleek significante verschillen tussen dagen voor NAÏEF, SHAM en TBI (p = 0.0003, p = 2.61e-5, p = 5.59e-7, respectievelijk; Afbeelding 3, rechts). Post-hoc tests aangetoond de volgende verschillen. Voor NAÏEF, dag 0 verschilde aanzienlijk van dagen 1, 2 en 3 (p = 0.002, p = 0.044, p = 0.004, respectievelijk). Voor SHAM, alle dagen waren significant verschillend van elkaar: dag 0 verschilde aanzienlijk van dagen 1, 2 en 3 (p = 0.0006, p = 0,001, p = 0.0006, respectievelijk); Dag 1 verschilde aanzienlijk van dagen 2 en 3 (p = 0.031, p = 0.0006, respectievelijk); en dag 2 verschilde aanzienlijk van dag 3 (p = 0.044). Voor TBI, dag 0 verschilt aanzienlijk van dagen 1, 2 en 3 (p = 0.0005, p = 0.0008, p = 0.0005, respectievelijk).

De resultaten van de test van de Beam-wandeling staan op twee tijdstippen (Figuur 4). Gelijkaardig aan het Beam-evenwicht, deze test detecteert tekorten vroeg na blessure (Figuur 4, links). Echter uiterlijk 6 maanden na letsel, er zijn geen significante verschillen tussen de groepen (Figuur 4, rechts), suggereren genezing is opgetreden in de benadeelde groep. Dit resultaat kan gevolgen voor de meer gevorderde leeftijd en toegenomen gewicht weerspiegelen.

Om te vergelijken NAÏEF, SHAM en TBI op elke dag vroeg na blessure, werd een one-way ANOVA gebruikt. Er waren geen verschillen op dag 0 (F = 0.859, p = 0,426) en alle latencies waren minder dan 5 s, die aangeeft dat alle ratten voldoet aan de criteria om te zetten in de studie. Op PID 1, was er een significante statistische proefresultaat van 15.36, p = 1.18e-6. De Tukey post hoc test aangegeven een significant verschil tussen TBI en NAÏEF (p = 0.000004) en TBI en SHAM (p = 0.0001). Op dag 2, was er een significant verschil tussen groepen (F = 9.49, p = 0.0002). Post-hoc testen bleek verschillen tussen TBI en NAÏEF (p = 0.0002) en TBI en SHAM (p = 0,005). Op dag 3, is dit de algemene statistische proefresultaat is gelijk aan 6.27, p = 0.0025, die aangeeft dat er verschillen tussen de groepen. De Tukey post hoc test bleek dat opnieuw, TBI verschilt NAÏEF en SHAM (p = 0.003, p = 0,035, respectievelijk).

Met behulp van een one-way herhaalde maatregel ANOVA, werden verschillen tussen dagen binnen behandelgroepen onderzocht. Eerst werd de veronderstelling van bolvorm gecontroleerd voor elke groep. De binnen factor (dag) niet voldeed aan de bolvorm aanname voor de NAÏEVE of SHAM groepen, aldus de continuïteit correctie, broeikasgassen-Grier werd toegepast op die groepen. Voor SHAM, waren er geen verschillen tussen dagen (p = 0.066), voor NAÏEF en TBI er waren (p = 0.006, p = 2.89E-7, respectievelijk). Post-hoc vergelijkingen bleek voor NAÏEF, het verschil tussen dag 0 en dag 1 (p = 0.003). Voor TBI, waren de verschillen tussen dag 0 en dag 1, 2, en 3 (p = 9.2e-6, p = 0.0005, p = 0.002, respectievelijk), en was er een verschil tussen dag 1 en dag 3 (p = 0.018).

6 maanden na schade, er waren geen significante verschillen tussen NAÏEF, SHAM of TBI op elke dag (dag 0, F = 0.315, p = 0.732; Dag 1, F = 0,336, p = 0.717; Dag 2, F = 0,5, p = 0.61; Dag 3, F = 1.17, p = 0.322; Afbeelding 4, rechts). Bij het vergelijken van de verschillen tussen dagen binnen elke groep was er een significant verschil in de TBI-groep (p = 0.026), met dag 0 die verschillend van dagen 1, 2 en 3 (p = 0.026, p = 0.002, p = 0.002). Er waren geen verschillen tussen alle dagen voor NAÏEF of SHAM (p = 0.104, p = 0.063, respectievelijk).

Gegevens uit het geheugen werkversie van de Morris water maze kan worden opgenomen in een grafiek in een verscheidenheid van manieren. Hier tonen we de resultaten voor 3 maanden (Figuur 5, links) en 12 maanden (Figuur 5, rechts) na blessure met behulp van zowel lijngrafieken te vertegenwoordigen het tijdsverloop, en de percelen van het vak om een algehele samenvatting van de gegevens (Figuur 5, bodem). We kunnen vervolgens visualiseren tot vergelijkingen van de Trial 1 en Trial 2 vergelijkingen onafhankelijk op elke dag evenals algemene verschillen als gevolg van letsel. Proef 1 latencies vertegenwoordigen referentie geheugen en Trial 2 latencies verbeelden werkgeheugen.

De gegevens van ratten 3 maanden na blessure zijn afgebeeld in Figuur 5, links. Voor Trial 1 (Figuur 5, linkerbovenhoek), bij het vergelijken van NAÏEF, SHAM en TBI, alleen dag 4 toonde een significant verschil tussen groepen (F = 4.12, p = 0,025), met de post-hoc Tukey de test die aangeeft dat de TBI van verschilde NAÏEF (p = 0.019). Voor proef 2 (Figuur 5, midden links), was er een significant verschil op dag 1 (F = 5.93, p = 0.006), met post-hoc analyse die aangeeft dat de TBI van SHAM verschilde (p = 0,005). De herhaalde maatregelen ANOVA niet vinden een totale verschil tussen schade groepen op 3 maanden (p = 0,56). Deze resultaten suggereren dat deze ratten kleine nog aanzienlijke tekorten in verwijzing evenals werkgeheugen op 3 maanden na blessure hebben.

Twaalf maanden na blessure, vergelijken Trial 1 NAÏEF, SHAM en TBI (Figuur 5, rechts), herhaalde maatregelen ANOVA aangetoond dat een aanzienlijke totale effect van letsel (F = 3,94, p = 0,03). Paarsgewijze vergelijkingen geopenbaard dat TBI aanzienlijk van zowel NAÏEF en SHAM verschilde (p = 0,043 en p = 0.006., respectievelijk) (Figuur 5, rechtsonder). Bovendien, door het vergelijken van letsel groepen op elke dag, met een one-way ANOVA, een significant verschil werd ontdekt op dag 3 (F = 7.28, p = 0.003). Post-hoc vergelijking bleek dat de TBI van SHAM verschilde (p = 0,0018) (Figuur 5, rechts bovenin). Voor Trial 2, de herhaalde maatregelen ANOVA gevonden een significant verschil vanwege blessure (F = 3,97, p = 0.029), met post-hoc paarsgewijze vergelijkingen detecteren het verschil tussen TBI en SHAM (p = 0,017) (Figuur 5 , rechtsonder). One-way ANOVA op elke dag vonden significante verschillen op dagen 2 en 4. Op dag 2 (F = 4.02, p = 0.028), de Tukey post hoc test gevonden dat TBI van SHAM verschilde (p = 0.023). Op dag 4 (F = 4.12, p = 0.026), post-hoc analyse vond een verschil tussen TBI en SHAM (p = 0,025) (Figuur 5, midden rechts).

Figure 1
Figuur 1. Diagram van de water maze. Dit diagram toont de mogelijke platform locaties (1, 2, 3, 4) en uitgangspunten (N, S, E, W) voor de werkende geheugen Morris water maze. Ratten zijn twee proeven van elke startende locatie/platform pairing toegestaan. Er is een 15 s onderling proef interval en 4 min rust in een opwarming van de aarde kamer tussen paren van proeven voor een totaal van vier paren van proeven voor elke dagelijkse sessie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Resultaten van de neuroscore test Alle ratten werden opgeleid om eenvoudige reflex testen taken voorafgaand aan de dag 0 (zie tekst voor meer informatie over training, testen en scoren). Resultaten worden weergegeven als de mediaan (zwarte lijn), eerste en derde kwartielen (grenzen van doos), en 10th en 90th percentielen (foutbalken). Het gemiddelde wordt ook aangegeven door de rode lijnen en afgelegen punten als zwarte stippen. Gegevens worden uitgereikt aan de dag 0 basislijn en na letsel dagen 1-3. De resultaten van de post-hoc t-test voor elk punt van de tijd worden weergegeven op de grafieken: * p < 0.001 vs TBI dag 0; ^ p < 0.001 vs dezelfde dag NAÏEF. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Resultaten van de test van de Beam-evenwicht Alle ratten werden opgeleid om het evenwicht op de lichtbundel totdat ze voor 60 evenwicht kon s voor drie opeenvolgende trials (zie tekst voor meer informatie over opleiding, te testen en te scoren). Op verdere tests, werden ratten gescoord op een schaal van 1-6 met 1 betekenende normale evenwicht en 6 betekenende geen poging te blijven op de balk. Resultaten worden weergegeven als de mediaan (zwarte lijn), eerste en derde kwartielen (grenzen van doos), en 10th en 90th percentielen (foutbalken). Het gemiddelde wordt ook aangegeven door de rode lijnen en afgelegen punten als zwarte stippen. Gegevens worden uitgereikt aan de basislijn dag 0 score, na letsel dagen 1-3 (links), en 6 maanden na blessure (rechts). De resultaten van de post-hoc t-test voor elk punt van de tijd worden weergegeven op de grafieken. Dagenlang 0-3: * P < 0.001vs TBI dag 0; ^ p < 0.001 vs dezelfde dag NAÏEF; @ p < 0.001 vs dezelfde dag SHAM. 6 maanden: * p < 0.001vs TBI dag 0; # p < 0.001 vs NAÏEF dag 0; & p < 0.001 vs SHAM dag 0. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Resultaten van de test Beam-wandeling Alle ratten werden opgeleid om te doorkruisen de lichtbundel terwijl weven tussen posten te ontsnappen naar een kluisje. Zij werden opgeleid totdat zij voldoet aan de criteria van ≤ 5 s op drie opeenvolgende proeven (zie tekst voor meer informatie over opleiding, te testen en te scoren). Basislijn testen werd voltooid op dag 0 en ratten werden vervolgens getest op 1-3 dagen na blessure (links). Een subset van ratten werd ook getest op 6 maanden na blessure (rechts). De resultaten zijn opgenomen in een grafiek als mediaan (zwarte lijn), eerste en derde kwartielen (grenzen van doos), en 10th en 90th percentielen (foutbalken). Het gemiddelde wordt ook aangegeven door de rode lijnen en afgelegen punten als zwarte stippen. De resultaten van de tests van de post-hoc voor elk punt van de tijd worden weergegeven op de grafieken. Dagenlang 0-3: * P < 0.001vs TBI dag 0; ^ p < 0.001 vs dezelfde dag NAÏEF; @ p < 0,001 vs dezelfde dag SHAM; 6 maanden: * p < 0.001vs TBI dag 0. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5. Resultaten van het werkgeheugen Morris water maze. Resultaten worden weergegeven voor afzonderlijke groepen van ratten op 3 maanden (linker kolom) en 12 maanden (rechter kolom). De bovenste panelen Toon de gemiddelde latenties (tijd die nodig de ratten was te vinden van de verborgen platform) op de eerste proeven van de koppeling van de twee-proces voor elk van de vijf testen dagen. De middelste panelen Toon de gemiddelde latenties van de tweede proeven op elke dag. Resultaten van de post-hoc analyse worden weergegeven op de grafieken (* p < 0.05 vs dezelfde dag SHAM; ^ p < 0.05 vs dezelfde dag NAÏEF). De lagere panelen vatten de resultaten tonen van de mediaan (zwarte lijn), 25th en 75th percentielen (grenzen van doos), en 10th en 90th percentielen (foutbalken). Het gemiddelde wordt ook aangegeven door de rode lijnen en afgelegen punten als zwarte stippen. Resultaten van de post-hoc analyse worden weergegeven op de grafieken (*p < 0.05 vs dezelfde proef SHAM, ^ p < 0.05 vs dezelfde proef NAÏEF). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Bij het uitvoeren van elk type gedrags testen, is het essentieel om consequent te zijn. Dit detail bevat veel overwegingen die onbelangrijk lijken maar een grote invloed hebben op de reactie van het dier. Een belangrijke stap die niet kan worden overzien is acclimatisering van dieren naar hun huis-kooi/woonsituatie voorafgaand aan elk experiment. Deze voorbereiding vermindert de gevolgen van de dieren fysiologische stress-respons, waardoor het gedrags resultaten18kunnen worden gewijzigd. Ook, is het absoluut noodzakelijk dat alles is gedaan om alle dieren op dezelfde manier. Deze samenhang omvat, als eerder vermeld, acclimatisatie op huisvesting en ook acclimatisering tot behandeling en vervoer tussen kamers voorafgaand aan de training of testen. Dit concept kan niet worden overschat. Slordig dierlijke behandeling is rampzalig om eventuele gedrags test19. Ook moet alles in het werk worden gedaan om te testen dieren op hetzelfde moment van de dag, of tijdens hun donkere of lichte cyclus. Voor de tests hier besproken, is testen in licht of donker fase aanvaardbaar zolang de tests voortdurend worden uitgevoerd. Testen gedaan op verschillende tijdstippen tijdens de circadiane cyclus heeft aangetoond dat het gedrags resultaten18,20te wijzigen. Bovendien, moet de handler evenals het dier in een stress-vrije en kalm staat om de nauwkeurigheid van de resultaten te maximaliseren.

Met name in het geval van de Neuroscore, zijn de valse positieven en negatieven zijn gemeenschappelijk. Valse positieven doen zich meestal voor wanneer een dier is niet volledig gewend tot de behandeling en testen. Het dier moet volledig ontspannen zijn, zodat de waargenomen reactie is reflexief en niet wegens de spieren aanscherping van de reageren op stress of angst. Een gespannen handler kan de resultaten beïnvloeden door verzending van stress bij het dier. Daarom kunnen houden de rat te strak of te los beide worden problematisch. Bovendien, als de handler nerveus is, kan dit de reactie van de ratten beschamen. Er is ook het risico dat een onervaren waarnemer van de rat reactie zal interpreteren. Goede training en veel van de praktijk zijn essentieel voor het succes en de consistentie van de Neuroscore.

In het algemeen, is de voornaamste zorg met deze tests het ontbreken van een groot verschil, en soms geen verschil tussen behandelgroepen. Aangezien dieren verschillend op verschillende handlers, de geluiden, de tijden van de dag, en potentieel, seizoenen21 reageren kunnen, moet elke inspanning worden geleverd om alle mogelijke storende factoren.

De resultaten van de taken van het Beam-evenwicht en Beam-Walk hieronder tonen aan dat deze tests nuttig vroeg na letsel aan het opsporen van tekorten in de vestibulomotor functie. Deze tekorten lossen meestal over tijd1,14. In dit model hebben uiterlijk 6 maanden na schade, de schade-geïnduceerde tekorten opgelost. De resultaten van de 6 maand tijdstip aangeven dat er geen verschillen tussen NAIVE, SHAM of verwonde ratten zijn; echter alle ratten geweest ontspannen in hun huis kooien voor 6 maanden, veroudering en het verkrijgen van het gewicht. Dus tegen de tijd dat ze opnieuw getest op 6 maanden na chirurgie (of equivalent in het geval van NAÏEF zijn), zijn ze in wezen steeds oude en vet, en derhalve alle fracties presteren niet evenals zij in vergelijking met hun basislijn dag 0 resultaten.

Een andere belangrijke overweging is dat de gedrag test gebruikt de juiste test. Bijvoorbeeld, zijn de tests die hier werkzaam gedacht te vertegenwoordigen van de functie van de specifieke hersengebieden. Een voorbeeld is het vestibulaire systeem, dat belangrijk voor evenwicht is. Hersengebieden die betrokken zijn bij sensorimotor functie, zoals de cortex met inbegrip van sensomotorische cortex, de thalamus, de corticospinal neuronen, de basale ganglia, nigro-striatum, te noemen, zijn allemaal betrokken bij coördinatie van de vestibulomotor. Dus, tekorten in het Beam-saldo of Beam-Walk geven mogelijke tekorten in deze gebieden. Bovendien, de hippocampus en de prefrontale cortex zijn betrokken bij het leren en geheugen functies getest door het werk geheugen water labyrint. Zelfs wanneer de juiste test wordt gekozen, moeten de beperkingen van de tests die werkzaam zijn in gedachten worden gehouden. Geen van de tests hier gepresenteerd zijn bijvoorbeeld gevoelig voor tekorten in stemming, zoals depressie, angst of sociale interacties zoals besluitvorming, agressie en impulsiviteit. Nogmaals, is het noodzakelijk om te kiezen van de passende test voor het gebied van het gedrag en de hersenen worden geëvalueerd.

Interpretatie en analyse van gedrags-gegevens moeten met voorzichtigheid worden benaderd. Het is sterk aanbevolen om zijn: macht analyse van elk type proef afzonderlijk, omdat het gebruik van een gedrags resultaat als een maatregel van een neuraal tekort, is door haar aard, een ruwe maat voor een subtiel effect. Bovendien vereisen verschillende tests verschillende soorten statistische analyses. Bijvoorbeeld, zijn de Neuroscore en Beam-evenwicht beschreven proeven afhankelijk van de interpretatie van een getrainde waarnemer te scoren het gedrag met behulp van een ordinale schaal. Deze typen gegevens zijn niet continu en niet normaal verdeelde, dus niet-parametrische statistische gegevens moet worden gebruikt, zoals de Kruskal-Wallis test, zoals aangetoond in de secties 6.1 en 6.2. Als alternatief, de Beam-lopen en werken water doolhof geheugentests gegevens opleveren die continu zijn en normaal verdeelde, dus parametrische statistieken kunnen worden gebruikt, zoals one-way ANOVA of herhaald-maatregelen two-way ANOVA, zoals aangetoond in secties 6.3 en 6.4.

De gedrags taken hier gepresenteerd de tand des tijds hebben doorstaan en geeft reproduceerbare resultaten, met name wanneer in paren gerangschikt met de FPI-model bij ratten, hoewel vele andere methoden voor het testen van de gedragsmatige voor hersenletsel bestaan. De neuroscore is een korte beoordeling uitgevoerd met een minimum van apparatuur. Andere proeven van reflexen en sterkte zijn beschikbaar en kunnen worden opgenomen in een neurologische beoordeling, zoals de laterale scopische taak, de Akinesie test, de test van het hellend vlak en grijpkracht (Zie Fujimoto et al. 22 en gouden et al. 23). the Beam-evenwicht en Beam-Walk taken beschreven zijn maatregelen van vestibulomotor tekorten na blessure. Vestibulomotor coördinatie kan een maatregel van grove motorische gedrag, terwijl andere maatregelen van grove motorische tekorten de Rotarod, de roterende paal omvatten, en veld activiteit open worden beschouwd. De mogelijkheid om te zwemmen, is gemeten als zwemmen snelheid tijdens het doolhof van water, ook een indicatie van grove motorische coördinatie22,23. De werkende geheugen water doolhof taak voltooid deze set van tests door opsporing beide verwijst naar geheugen tekorten (aangegeven door Trial 1) en werken van geheugen tekorten (aangegeven door Trial 2 of het verschil tussen Trial 1 en Trial 2). Andere maatregelen van cognitief functioneren bestaan uit de radiale doolhof van acht arm, het doolhof Barnes, de roman object herkenningstest en verschillende varianten van het water labyrint. Deze varianten omvatten de oorspronkelijke Morris water maze en de doolhof Lashley III (opnieuw Zie Fujimoto et al. 22 en gouden et al. 23). deze batterij van tests is gebleken dat nuttig vroeg na blessure en, in mindere mate, uit tot 12 maanden na letsel1.

Bovendien, kunnen de taken hier gedemonstreerd worden gebruikt met verschillende stammen, seks en ages voor rats; Accommodaties moet echter mogelijk worden gemaakt voor verschillende maten en in het geval van grotere broosheid. Bijvoorbeeld, oudere, zwaardere ratten moeten een bredere bundel voor de Beam-evenwicht taak en leeftijd, frêle ratten, doolhof van moeten kortere duur van zwemmen keer in het water kan. Er is dus ruimte voor flexibiliteit in deze tests en potentieel voor de ontwikkeling van nieuwe tests voor verschillende situaties en hypothesen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Ian Bolding voor hulp bij chirurgische voorbereiding van onderwerpen en Elizabeth Sumner voor haar zorgvuldige bewerking. Deze studies werden voltooid als onderdeel van een team gefinancierd door The Moody Project voor translationeel traumatische hersenonderzoek letsel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley rats Charles Rivers Laboratories
251 Ballardvale St
Wilmington, MA 01887-1096
Phone: 800-522-7287		 CD-IGS rats, strain code 001 male, albino, 300-350g at arrival
Name Company Catalog Number Comments
Beam-Balance
Beam home built wood, 25" l x 1" h x 3/4" w sealed with polyurethane varnish
C-clamp Home Depot 1422-C 2 1/2"
barrier Home Depot styrofoam, 18" x 17 1/2"
table (for both BB & BW) generic office supply 37" h x 30" w x 60" l
Name Company Catalog Number Comments
Beam-Walk
Beam home built wood 38-1/2" l x 1-3/4" h x 1" w sealed with polyurethane varnish (~ 37" off floor)
escape box home built woodpainted black 12 1/2 " l x 9" h x 7-1/4" w
nails (pegs) 2"
hinges
clamps
white noise machine San Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121
Phone: (858)530-2600		 http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf
light Home Depot
Name Company Catalog Number Comments
Morris Water Maze
fiberglass pool manufacturer unknown
(similar to one made by SDI) San Diego Instruments 7000-0723 72" diameter x 30" deep (~ 500 gal)
plexiglass platform hand-made by Maggie Parsley 10 cm diameter, 26" tall with silicone applied to the surface of the platform to provide a gripping surface
(similar to one made by SDI) SDI 7500-0272
plexiglass animal boxes w/ lids UTMB Machine Shop 2 boxes, 10" w x 16" L x 9" h
spot lights/ heat lamps Home Depot 3 around pool, 2 over boxes to dry animals
AnyMaze San Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121
Phone: (858)530-2600		 /9001 http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sell, S. L., Johnson, K., DeWitt, D. S., Prough, D. S. Persistent Behavioral Deficits in Rats after Fluid Percussion Injury. J Neurotrauma. 34 (5), 1086-1096 (2017).
  2. Gurdjian, E. S., Lissner, H. R., Webster, J. E., Latimer, F. R., Haddad, B. F. Studies on experimental concussion: relation of physiologic effect to time duration of intracranial pressure increase at impact. Neurology. 4, 674-681 (1954).
  3. Anonymous. US National Library of Medicine. , (last accessed Jan. 9, 2018) www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/$term=fluid+percussion+injury+rat (2017).
  4. Hellmich, H. L., Capra, B., Eidson, K., Garcia, J., Kennedy, D., Uchida, T., et al. Dose-dependent neuronal injury after traumatic brain injury. Brain Research. 1044, 144-154 (2005).
  5. Bramlett, H. M., Detrich, W. D. Long-Term consequences of Traumatic Brain Injury: Current Status of Potential Mechanisms of Injury and Neurological Outcomes. J. Neurotrauma. 32, 1-15 (2015).
  6. Pierce, J. E. S., Smith, D. H., Trojanowski, J. Q., McIntosh, T. K. Enduring cognitive neurobehavioral and histopathological changes persist for up to one year following severe experimental brain injury in rats. Neuroscience. 87 (2), 359-369 (1998).
  7. Smith, D. H., Chen, X. H., Pierce, J. E. S., Wolf, J. A., Trojanowski, J. Q., Graham, D. I., McIntosh, T. K. Progressive atrophy and neuron death for one year following brain trauma in the rat. J Neurotrauma. 14 (10), 715-727 (1997).
  8. Schallert, T. Behavioral tests for preclinical intervention assessment. NeuroRx. 3 (4), 497-504 (2006).
  9. Sell, S. L., Avila, M. A., Yu, G., Vergara, L., Prough, D. S., Grady, J. J., DeWitt, D. S. Hypertonic resuscitation improves neuronal and behavioral outcomes after traumatic brain injury plus hemorrhage. Anesthesiology. 108 (5), 873-881 (2008).
  10. Hamm, R. J. Neurobehavioral assessment of outcome following traumatic brain injury in rats: an evaluation of selected measures. J Neurotrauma. 18 (11), 1207-1216 (2001).
  11. Feeney, D. M., Gonzalez, A., Law, W. A. Amphetamine, haloperidol, and experience interact to affect rate of recovery after motor cortex injury. Science. 217, 855-857 (1982).
  12. Hamm, R. J., Temple, M. D., Pike, B. R., O'Dell, D. M., Buck, D. L., Lyeth, B. G. Working memory deficits following traumatic brain injury in the rat. J Neurotrauma. 13, 317-323 (1996).
  13. Morris, R. G., Hagan, J. J. Allocentric spatial learning by hippocampectomised rats: A further test of the "Spatial Mapping" and "Working Memory" Theories of hippocampal function. The Quart J of Exp Psych. 38 (4), 365-395 (1986).
  14. Dixon, C. E., Lyeth, B. G., Povlishock, J. T., Findling, R. L., Hamm, R. J., Marmarou, A., Young, H. F., Hayes, R. L. A fluid-percussion model of experimental brain injury in the rat. J. Neurosurg. 67, 110-119 (1987).
  15. DeWitt, D. S., Smith, T. G., Deyo, D. J., Miller, K. R., Uchida, T., Prough, D. S. L-arginine and superoxide dismutase prevent or reverse cerebral hypoperfusion after fluid-percussion traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 14, 223-233 (1997).
  16. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2017).
  17. Pohlert, T. The Pairwise Multiple comparison of Mean Ranks Package (PMCMR) R package. , http://CRAN.R-project.org/package=PMCMR (2014).
  18. Verma, P., Hellemans, K. G., Choi, F. Y., Yu, W., Weinberg, J. Circadian phase and sex effects on depressive/anxiety-like behaviors and HPA axis responses to acute stress. Physiol Behav. 99, 276-285 (2010).
  19. Schallert, T., Woodlee, M. T., Fleming, S. M. Experimental Focal Ischemic Injury: Behavior-Brain Interactions and Issues of Animal Handling and Housing. ILAR J. 44 (2), 130-143 (2003).
  20. Ruis, J. F., Rietveld, W. J., Buys, J. P. Properties of parametric photic entrainment of circadian rhythms in the rat. Physiol Behav. 50, 1233-1239 (1991).
  21. Ferguson, S. A., Maier, K. L. A review of seasonal/circannual effects of laboratory rodent behavior. Physiol Behav. 119, 130-136 (2003).
  22. Fujimoto, S. T., Longhi, L., Saatman, K. E., McIntosh, T. K. Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury. Neurosci & Biobehav Reviews. , (2004).
  23. Gold, E. M., Su, D., Lopez-Velazquez, L., Haus, D. L., Perez, H., Lacuesta, G. A., Anderson, A. J., Cummings, B. J. Functional assessment of long-term deficits in rodent models of traumatic brain injury. Regen. Med. 8 (4), 483-516 (2013).

Tags

Gedrag kwestie 131 gedrag neuroscore beam-evenwicht beam-wandeling werkgeheugen hersenletsel vloeistof-percussion letsel Morris water maze rat
Opsporen van gedrags tekorten in ratten na traumatisch hersenletsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hausser, N., Johnson, K., Parsley,… More

Hausser, N., Johnson, K., Parsley, M. A., Guptarak, J., Spratt, H., Sell, S. L. Detecting Behavioral Deficits in Rats After Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (131), e56044, doi:10.3791/56044 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter