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Behavior

Detecção de défices comportamentais em ratos após lesão cerebral traumática

Published: January 30, 2018 doi: 10.3791/56044
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

O objetivo dos testes comportamentais apresentados aqui é detectar déficits funcionais em ratos após lesão cerebral traumática. Quatro testes específicos são apresentados que detectar déficits em comportamentos para refletir o dano a áreas específicas do cérebro, estendendo-se às vezes até um ano após a lesão.

Abstract

Com a crescente incidência de traumatismo crânio-encefálico (TCE) em populações civis e militares, TBI é considerada uma doença crônica; no entanto, alguns estudos têm investigado os efeitos a longo prazo da lesão em modelos de roedores de TCE. Aqui são mostrados medidas comportamentais que estão bem estabelecidas na pesquisa TBI por vezes cedo depois da lesão, tais como duas semanas, até dois meses. Alguns desses métodos anteriormente foram usados às vezes mais tarde, após a lesão, até a um ano, mas por muito poucos laboratórios. Os métodos demonstrados aqui são reflexos de uma avaliação neurológica curta para testar, um feixe-equilíbrio para testar o equilíbrio, a viga-pé para testar o equilíbrio e coordenação motora e uma versão de memória de trabalho do labirinto de Morris água que pode ser sensível a déficits em memória de referência. Ratos machos foram tratados e treinadas para neurológica, equilíbrio e coordenação motora testa antes de receber a lesão de percussão fluido parassagital (FPI) ou lesão de Souza. Ratos podem ser testados na avaliação neurológica curta (neuroscore), o feixe do equilíbrio, e o feixe-pé várias vezes, durante o teste sobre o labirinto de água só pode ser feito uma vez. Essa diferença é porque ratos podem lembrar a tarefa, confundindo assim os resultados de se repetir o teste é tentada no mesmo animal. Quando o teste de um a três dias após a lesão, diferenças significativas são detectadas em todas as três tarefas não-cognitivo. No entanto, diferenças na tarefa feixe-pé não foram detectáveis em pontos de tempo mais tarde (após 3 meses). Os défices foram detectados em 3 meses no feixe-equilíbrio e em 6 meses no neuroscore. Déficits na memória de trabalho foram detectados por até 12 meses após a lesão, e um défice na memória referência apareceu pela primeira vez em 12 meses. Assim, testes padrão comportamental podem ser medidas úteis de persistentes défices comportamentais depois FPI.

Introduction

Os métodos apresentados aqui são projetados para detectar déficits funcionais em áreas específicas do cérebro induzidas por um modelo experimental em ratos de TCE. Serão descritos quatro testes de comportamento diferente. Em primeiro lugar, a avaliação neurológica curta, conhecida como o neuroscore, pode ser realizada sem a necessidade de qualquer equipamento, mas requer prática; Este teste detecta déficits em reflexos. Em segundo lugar, o teste do feixe-equilíbrio detecta déficits na habilidade de equilibrar. Esta tarefa exige o manipulador marcar o rato baseado em uma escala ordinal e requer algum treinamento do manipulador. O teste do feixe do equilíbrio requer um feixe estreito e é sensível aos défices no sistema vestibular. O terceiro teste avalia a coordenação de vestibulomotor. Este teste é conhecido como a tarefa de feixe-pé, e embora alguns pre-treinamento do rato é necessário, este procedimento é mais objetivo do que os dois anteriores, como a latência para desviar o feixe é uma medida objetiva não dependente de Pontuação subjetiva. Essa diferença é porque o tempo para atravessar um feixe estreito para alcançar um cofre é medido. O teste de caminhada de feixe requer um feixe mais tempo do que o feixe do equilíbrio, bem como uma caixa de fuga. Este teste mede a déficits na coordenação motora e equilíbrio e, portanto, é sensível a danos para o cerebelo e áreas do cérebro relacionadas motor. A versão de memória de trabalho do labirinto de água Morris (MWM-WM) principalmente testes função hippocampal e integração com o córtex pré-frontal ou função executiva. A versão do labirinto de água Morris mostrado também pode ser usada para detectar os déficits na memória de referência1.

Esses métodos foram escolhidos com base no seu histórico bem estabelecido na literatura. Cada um tem sido eficaz em muitas mãos de laboratórios diferentes com várias cepas de ratos ao longo de vários anos de pesquisa. No entanto, no passado, pós-lesão mede até duas semanas após a lesão foram considerados pontos de tempo "crônica". Assim, para estabelecer técnicas comportamentais para o estudo dos efeitos crônicos de TCE em roedores, estes métodos conhecidos preciso ser avaliada para a sensibilidade detectar TBI induziram déficits em pontos de tempo mais longos após a lesão. Enquanto existem agora vários modelos de roedores de TCE, o modelo FPI é um dos mais amplamente utilizados e é aplicado neste estudo. Este modelo foi publicado pela primeira vez na década de 19502, e desde então, mais de 1.000 papéis têm empregado FPI em ratos3. A neuropatologia deste tipo de lesão tem sido bem descrita por nós4 e outros5,6,7. Brevemente, lesão neuronal no hipocampo tem demonstrado ser dose-dependente usando Fluoro-Jade coloração pouco tempo após a lesão, ou seja, 24-48 h; enquanto bruta atrofia e cavitação incluindo desbaste da cápsula interna e córtex tem sido relatado em um ano após a lesão de6,7.

A representação mais significativa da função cerebral é avaliada por meio de medidas comportamentais resultado após uma lesão cerebral experimental. No entanto, a grande maioria dos experimentos FPI que usam os resultados comportamentais fazer medidas relativamente cedo, normalmente de 1 a 14 dias após a lesão. Usar os métodos demonstrado aqui, que alguns défices comportamentais podem ser detectados por até 12 meses após a lesão1. Função neurológica, função vestibulomotor bruto e coordenação motora fina foram avaliados nos dias pós-lesão (PIDs) 1-3 e a-3, 6 e 12 meses após a cirurgia, usando uma breve avaliação neurológica (Neuroscore; modificado de Schallert8), o Tarefa de viga de equilíbrio e o feixe-pé tarefa9,10,11. Referência e memória de trabalho foram avaliados usando uma versão de memória de trabalho do Morris água labirinto1,12,13.

Protocol

Todas as experiências com animais são primeiro aprovadas pelo Comité de uso da University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas e institucional Cuidado Animal como dirigido pelo institutos nacionais da saúde guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (8ª edição, Conselho Nacional de pesquisa).

1. cirurgias e percussão fluido TBI

  1. Obter adulto masculino 300g ratos Sprague-Dawley de um vendedor e casa duas por gaiola com comida e água ad libitum em um viveiro com condições constantes: luz do ciclo (h 600 a 1.800 h), temperatura (21 ° C a 23 ° C) e humidade (40-60%).
  2. Antes da cirurgia, lidar com os ratos por três a cinco dias e depois treinar os ratos para o Neuroscore, feixe do equilíbrio e procedimentos de feixe-caminhada de um a três dias antes da avaliação de linha de base. Realizar a avaliação de linha de base do dia ou da manhã antes da cirurgia.
    Nota: Sempre prepare ratos de controle, tais como operada ou cirurgicamente ingênuo ratos da mesma forma como aqueles que receberá uma lesão e, aleatoriamente ou de forma equilibrada, agrupar os ratos em grupos de tratamento.
  3. Realizar uma cirurgia em condições assépticas (instrumentos esterilizados, batas cirúrgicas limpo, luvas esterilizadas, máscaras e capas de cabeça).
  4. ANESTHETIZE ratos utilizando isoflurano em 4% para a indução e 1,5-2% para manutenção. Intubar e ventilar mecanicamente os ratos (uso de isoflurano em ar: oxigênio (70:30) e prepare-se para lesão de fluido-percussão parasagital como anteriormente descrito14,15.
  5. Infiltrar-se ferida sites com 0,10% bupivicane antes da sutura e introduza o supositório retal paracetamol (120 mg/kg) antes de despertar da anestesia. Monitorar ratos pelo menos 4 h, durante o período de recuperação e no dia seguinte para sinais de infecção, lesões neurológicas graves (por exemplo, paralisia) ou desconforto grave (por exemplo, posição de arganaz persistente).
    Nota: Ratos exibindo algum destes sintomas devem ser sacrificados (4% isoflurano em uma câmara anestésica, seguido por decapitação).

2. Neuroscore de treinamento e testes

  1. Formação Neuroscore
    1. Para o treinamento em ratos, conhecido por ser experimentalmente ingênuo, atravessam os testes na seguinte ordem (etapas 2.2.1-2.2.5) do começo ao revestimento, retornar a gaiola em casa por 1 min e, em seguida, repita até que seja alcançada uma pontuação de zero.
    2. Marca golo na folha de Pontuação para um registro dos julgamentos de treinamento para cada rato. Após o treinamento, realizar uma sessão de testes (veja abaixo) no dia seguinte ou mesmo.
      Nota: Se a sessão de testes não produz uma pontuação zero para a linha de base, treinamento e testes podem ser repetidos ou o rato pode ser desviado para uma experiência não-comportamento.
  2. Teste de Neuroscore
    Nota: Atravessam os testes na ordem seguinte, retorno para casa gaiola por 1 min, em seguida, repita duas vezes para um total de três vezes.
    1. Teste de flexão do membro anterior
      1. Levantar o rato pela cauda e preensão aproximadamente 6-12 polegadas acima da superfície da mesa.
      2. Observe se o rato se estende ou flexiona membros dianteiros. Marca a presença de flexão (1) ou ausência (0).
        Nota: A flexão é anormal. Possível placar de 1 x 3 = 3 (possível Total = 3).
    2. Teste de flexão do membro posterior
      1. Levantar o rato pela cauda e preensão aproximadamente 6-12 polegadas acima da superfície da mesa.
      2. Observe se o rato se estende ou flexiona membros traseiros. Marca a presença de flexão (1) ou ausência (0).
        Nota: A flexão é anormal. Possível placar de 1 x 3 = 3 (possível cumulativa Total = 6).
    3. Visualmente, desencadeada teste de colocação
      1. Levante o rato pela cauda.
      2. Abaixe lentamente o rato em direção a borda da mesa até que o nariz é cerca de 10 cm da borda.
      3. Mova o rato lentamente em direção a borda (não permitir que os bigodes tocar a borda).
      4. Observe se o rato chega e estende dianteiras em direção a mesa. Marca a presença (0) ou não (1) de estender dianteiras.
        Nota: Chegar para a tabela em resposta a indicações visuais é normal. Possível placar de 1 x 3 = 3 (possível cumulativa Total = 9).
    4. Contato desencadeada teste de colocação
      1. Mantenha o rato, com o corpo na mão, paralelamente à borda da mesa e pernas dianteiras livre.
      2. Baixe lentamente o rato em direção a borda da mesa até os bigodes de um lado da borda da mesa.
      3. Observe se o rato estende o membro anterior do mesmo lado como os bigodes que estão tocando a mesa em direção a borda da mesa logo que toca os bigodes.
        Nota: Elicitação desta resposta requer prática considerável, e pesquisadores precisam ser bem treinados para realizar este teste consistentemente.
      4. Marca a presença (0) ou não (1) de chegar em direção a mesa.
        Nota: Chegar em resposta à estimulação tátil é normal. Possível placar de 1 x 3 = 3 (possível Total = 12).
      5. Repita os passos 2.2.4.1-2.2.4.4 para o lado oposto. Possível placar de 1 x 3 = 3 (possível cumulativa Total = 15).
    5. Teste de reflexo preensão Hindpaw
      1. Mantenha o rato em um lado com o dedo polegar e indicador em torno do peito sob as patas dianteiras.
      2. Toque suavemente palma da um hindpaw com o outro dedo indicador.
      3. Observe se o rato agarra o dedo indicador. Marca a presença (0) ou não (1) de apreender.
        Nota: Agarrando é normal. Possível placar de 1 x 3 = 3 (possível Total = 18).
      4. Repita os passos 2.2.5.1-2.2.5.3 para o lado oposto. Possível placar de 1 x 3 = 3 (possível Total = 21).
    6. Marcando
      1. Resumir os resultados para um possível total cumulativo de 7 x 3 = 21. Uma pontuação de zero é normal.

3. feixe-equilíbrio treinamento e testes

  1. Equipamentos
    1. Uso de um feixe de 60 cm de comprimento, 1,75 cm de largura, 4,0 cm de altura, conjunto 90 cm do chão, com uma barreira de 30 cm de altura, 30cm de largura. Prenda o feixe para uma tabela com a barreira anexada para que 50 cm do feixe sobressai da barreira, longe da mesa.
    2. Coloque uma caixa de segurança almofadado debaixo da trave para suavizar o impacto de ratos que caem.
  2. Formação de feixe-equilíbrio
    1. Em 24-48 h antes da cirurgia, coloque o rato sobre o feixe para um julgamento s 60.
    2. Se o rato não consegue equilibrar por conta própria, permitem que o rato cair na caixa de segurança.
    3. Iniciar a cronometragem quando o rato está firmemente posicionado na trave.
    4. Observar o rato para o período s 60 e taxa de seu desempenho com base na seguinte escala: 1 = mostra equilíbrio estável (noivos, anda, tenta subir a barreira), 2 = mostra equilíbrio instável (agarra os lados do feixe e/ou tem movimentos instáveis), 3 = tenta equilibrar Mas ó deslizamentos r gira na trave, trava por abraçar o feixe, 4 = tentativas de equilíbrio, mas cai após 10 s, 5 = trava sobre ou do feixe e cai fora em menos de 10 s, 6 = cai fora, não faz nenhum esforço para equilibrar ou agarrar o feixe.
    5. Gravar o resultado na planilha.
    6. Permitir que o rato descansar por 15 s em gaiola em casa, repita as etapas 3.2.1-3.2.5 até o rato atinge três contagens de 1 ou 2. O rato é então considerado treinados.
    7. Realize uma pré-avaliação em 24h ou no dia da cirurgia antes da cirurgia.
  3. Teste de feixe-equilíbrio
    1. A partir de 24h após a cirurgia e continuando por até 4 dias, teste os ratos diariamente.
      1. Coloque o rato sobre a viga e iniciar o temporizador. Observe o rato estreitamente para 60 registro s. a pontuação na planilha.
      2. Retorne o rato da gaiola em casa por um período breve de descanso (1-3 min).
      3. Repita as etapas 3.3.1.1-3.3.1.2 para um total de três testes.

4. feixe-pé treinamento e testes

  1. Equipamentos
    1. Usar uma viga de madeira de 100 cm de comprimento, 2,5 cm de largura e 4,0 cm de altura.
    2. Preparar um suporte ajustável, uma mesa ajustável e quatro pinos, 2 cm de altura e um gol preto caixa 28 cm de comprimento, 18 cm de altura e 18 cm de largura, com uma abertura em um fim grande o suficiente para o rato passar.
    3. Anexe o objectivo final do feixe para o lado aberto da caixa objetivo que é colocado sobre a mesa ajustável. Coloque o gerador de luz e ruído branco brilhante perto do final de partida do feixe. A extremidade inicial da viga é fixada para o suporte ajustável para que o feixe e a caixa estão no mesmo nível, cerca de 1 m acima do piso.
  2. Formação de feixe-caminhada
    1. Começa o treinamento de 24-48 h antes da cirurgia.
    2. Coloque o rato na caixa gol por 1 min. Depois de 1 min, remover o rato e começar o julgamento.
    3. Para iniciar o julgamento, a luz e ruído branco e coloque o rato sobre o feixe no local do furo de pino mais próximo à caixa de gol e deixe o rato inserir a caixa de objetivo.
    4. Quando cruzam o limiar da caixa objetivo de pés dianteiros do rato, desligue imediatamente as fontes de luz e ruído (este é o fim de um julgamento).
    5. Permitir que o rato descansar na caixa gol por 30 s entre cada tentativa.
    6. Repita o procedimento no passo 4.2.3-4.2.5 duas vezes em cada local de peg e da posição de partida. Insira os pinos nos furos e executar um feixe-caminhada completa com os pinos no lugar.
    7. Execute três ensaios de feixe-caminhada cronometrados.
      1. Remova o rato da caixa objetivo. Ligue a luz e ruído branco e iniciar o cronômetro quando colocar o rato sobre o feixe. Pare o cronômetro imediatamente quando cruzam o limiar da caixa objetivo pés dianteiros do rato e em seguida imediatamente, desligue a luz e o ruído.
      2. Registrar o tempo na planilha.
      3. Repita as etapas 4.2.7.1-4.2.7.2 até que o rato tenha alcançado três vezes de 5 s ou menos. O rato é considerado treinados.
  3. Avaliação de linha de base do feixe-pé
    1. No dia ou manhã antes da cirurgia, fazer três ensaios cronometrados com pinos no lugar.
    2. Comece colocando o rato na caixa gol por 30 s. remover o rato da caixa do gol e virar o ruído branco e da luz. Coloque o rato no início e fim do feixe e inicie simultaneamente o cronômetro. Quando cruzam o limiar da caixa objetivo de pés dianteiros do rato, imediatamente Desligue as fontes de luz e ruído e parar o timer.
    3. Registrar o tempo na planilha. Permitir que o rato permanecer na caixa do gol de 30 s.
    4. Repita as etapas 4.3.2-4.3.3 até três latências são registradas na planilha. Retorne o rato da gaiola para casa após três ensaios cronometrados são concluídos.
  4. Feixe-caminhada teste
    1. Teste os ratos diariamente 24 h após a cirurgia e continuando por até 4 dias. Realize três ensaios cronometrados como em passos 4.3.

5. trabalho memória labirinto de água

  1. Equipamentos
    1. Uso um tanque cheio de água a uma altura de 28 cm e mantida a 26 ± 1 ° C.
    2. Use uma plataforma de vidro acrílico transparente que é 10 cm de diâmetro em um carrinho de 26 cm de altura.
      Nota: A superfície superior da plataforma deve ser revestida com silicone em forma de um círculo com um X através dele. Isto permite que os ratos subir na plataforma e lhes dá tração, então eles não escorregar.
    3. Reunir um cronômetro, uma lâmpada de calor, toalhas descartáveis, pensos absorventes, gaiolas extras e um peixe de aquário pequena, cabo longo líquido. Use um vídeo computadorizado, sistema que está conectado a uma câmera de vídeo para gravar a natação de rato e enviar os dados para o computador de controle. Salve o vídeo e os dados do computador para posterior análise.
  2. Trabalhando a memória teste de labirinto de água
    1. Dê os ratos quatro pares de ensaios cada dia durante cinco dias consecutivos, coloque a plataforma em cada um dos quatro quadrantes e começar os ratos de cada um dos pontos de partida de quatro (N, S, E, W), conforme descrito abaixo.
    2. Primeiro defina pares de localização-plataforma de partida para ser usado durante todo o experimento.
      Nota: A ordem dos quadrantes onde situa-se a plataforma e o ponto de partida era necessidades em uma ordem diferente para cada um dos cinco dias de natação, mas o mesmo para cada rato.
      1. Usar quatro pontos de partida (N, S, E ou W) e quatro locais de plataforma (quadrantes 1, 2, 3 ou 4; A Figura 1). Por exemplo, (N, 2; E, 4; S, 1; W, 3; Ver Figura 1). Plano um equilibrado (não aleatória) a fim de evitar pontos de partida muito perto das plataformas (sem ponto de partida é o mesmo quadrante como a localização da plataforma). Configure uma folha de dados usando os quadrantes de plataforma e quatro pontos de partida.
      2. Escrever um protocolo para o vídeo que segue o software para usar em ordem para vídeo os ratos nadando e para coletar dados especificados (por exemplo, a duração do mergulho, velocidade, distância percorrida antes de encontrar a plataforma).
        Nota: O software de rastreamento automaticamente vai parar gravação após a duração especificada. O protocolo deve permitir para especificar onde a plataforma é colocada, quantos julgamentos para executar por animal, e quantos animais serão testados por sessão, e também a duração máxima permitida (por exemplo, 120 s).
      3. Teste 4-6 ratos por sessão.
        Nota: mais de 6 ratos criar um problema de cronometragem entre ratos e podem levar a erro pelo manipulador. As caixas de aquecimento também tornar-se lotado.
    3. Julgamento 1
      1. Abra o software de monitoramento de vídeo e carregar o protocolo correto, incluindo o mapa do labirinto de água.
      2. Coloque a plataforma no local atribuído (por exemplo, 2; A Figura 1) e verificar que coincide com o mapa no software. Prepare o software de rastreamento para iniciar quando o rato entra no campo de visão da câmara.
      3. Coloque o rato em tanque de frente para a parede no local atribuído (por exemplo, N; A Figura 1) e imediatamente iniciar o temporizador.
      4. Permitir que o rato 120 s encontrar a plataforma. Quando o rato encontra a plataforma, parar o cronômetro e registrar o tempo na planilha. Se o rato não conseguir localizar a plataforma, levá-lo para a plataforma à mão e gravar 120 s. permitir o rato 15 s para permanecer na plataforma.
    4. Julgamento 2
      1. Verifique se o software está pronto para julgamento 2. Coloque o rato volta no tanque na mesma posição inicial (N). Repita a etapa 5.2.3.4.
    5. Após julgamento 2, coloque o rato no recinto aquecido por 4 min. mover a plataforma para o segundo lugar (4; A Figura 1) e verificar que coincide com o mapa no software.
    6. Repetição de julgamento de 1 e 2 procedimentos (etapas 5.2.3-5.2.4) até quatro começando localização/plataforma emparelhamentos são concluídos.

6. análise de dados

  1. Neuroscore
    1. Transferi manualmente os resultados escritos à mão uma planilha de computador.
    2. Resumir os resultados para cada tentativa obter três pontuações por rato em cada dia.
    3. Formate os dados para a análise estatística (seja no formato longo ou largo dependendo da preferência do software).
      Nota: O formato tem uma única coluna para tratamento (no caso, preenchido com "Ingênuo", "Sham" ou "TBI"), uma única coluna por dia (no caso "0", "1", "2" ou "3") e uma única coluna para julgamento ("1", "2" ou "3"). O formato largo tem uma única coluna para cada combinação de níveis de fator (para uma única coluna para ingênuos, dia 0, julgamento 1, outra coluna para ingênuos, dia 0, julgamento 2, etc.)
    4. Média da pontuação para cada animal em cada dia. Já havia três ensaios feitos em cada dia haverá três valores para cada animal por dia.
    5. Avalie se os dados são normalmente distribuídos. Uso que um não paramétrico estatístico (por exemplo, o teste de Kruskal-Wallis) teste para analisar se a pontuação em cada dia é diferente entre os grupos. Neste caso, desde que estes dados não são contínuos, eles não são normalmente distribuídos.
    6. Para determinar onde se encontram as diferenças, fazer testes de post-hoc , como análise de post-hoc de Tukey.
      Nota: Aqui, o pacote de software estatístico R16, a função Kruskal.test() e a função posthoc.kruskal.nemenyi.test dentro o Pairwise múltiplos comparação de dizer fileiras pacote (PMCMR)17 foram usados.
    7. Além disso, teste para ver se há quaisquer diferenças entre dias dentro de cada grupo.
      Nota: por exemplo, para ver se os animais SHAM se comportam de forma diferente no dia 0 comparado ao dia 1, dia 2 ou 3 dias. Para fazer isso, execute uma ida medidas repetidas ANOVA. Isso pode ser feito em R usando a função ezANOVA dentro do pacote de ez.
    8. Para executar uma ANOVA de medidas repetidas, primeiro verifique a suposição sobre a esfericidade.
      Nota: Aqui, os dados indicam que o dentro fator (dia) será que encontro a suposição de esfericidade para SHAM e INGÊNUA, mas não para TBI. Assim, uma correção não é necessária para INGÊNUO ou SHAM. Para os dados TBI, use a correção de estufa-Geisser.
    9. Se encontram-se diferenças significativas, executar um teste post-hoc para determinar onde se encontram as diferenças. Isto é conseguido em R usando o emparelhadas t-teste de função. Plotar os resultados como um enredo de caixa, conforme os resultados representativos (Figura 2).
  2. Feixe-equilíbrio
    1. Transferi manualmente as notas escritas à mão uma planilha de computador. Formate os dados para a análise estatística (seja no formato longo ou largo dependendo da preferência do software). Ver nota na etapa 6.1.3.
    2. Em cada dia para que cada rato terá 01:20 por dia em média as pontuações para cada rato. Para testar se a pontuação em cada dia é diferente entre INGÊNUOS, SHAM e TBI, avalie se os dados são normalmente distribuídos.
      Nota: neste caso, uma vez que os dados não são contínuos, estes dados não são normalmente distribuídos. Portanto, use um teste estatístico não paramétrico (por exemplo, o teste de Kruskal-Wallis).
    3. Para determinar onde se encontram as diferenças, fazer testes de post-hoc , por exemplo, análise post-hoc de Tukey. Para testar as diferenças entre os dias dentro de cada grupo de tratamento, execução repetida de uma ida mede ANOVA (consulte a etapa 6.1.7). Verifique a suposição sobre a esfericidade.
      Nota: Neste estudo, os dados indicam que o fator dentro de (dia) não satisfaz a suposição de esfericidade para qualquer um dos grupos, correções de continuidade tão usadas. Use a correção de continuidade de estufa-Grier.
    4. Plotar os resultados em um terreno de caixa, conforme os resultados representativos (Figura 3).
  3. Feixe-caminhada
    1. Manualmente transferi manuscritos resultados para uma planilha de computador. Média as latências de feixe-pé três para cada animal por dia. Formatar os dados para a análise estatística (consulte a etapa 6.1.3).
    2. Avalie se os dados são normalmente distribuídos.
      Nota: neste caso, os dados é contínuos e é normalmente distribuídos. Portanto, use uma ANOVA one-way para determinar se a latência em cada dia é diferente entre ingênuos, SHAM e TBI.
    3. Para ver se há alguma diferença entre dias dentro de um grupo de tratamento, execute uma ida medidas repetidas ANOVA. Primeiro verifique a suposição sobre a esfericidade.
      Nota: Neste estudo, os dados indicam que o fator dentro de (dia) não satisfaz a suposição de esfericidade para qualquer um dos nossos grupos, para correções de continuidade são usadas. Use a correção de estufa-Grier.
    4. Plotar os resultados em um terreno de caixa, conforme os resultados representativos (Figura 4).
  4. Trabalhando o labirinto de água de memória
    1. Transferi os dados do programa de acompanhamento de planilha ou computador para uma planilha. Selecione os resultados a serem analisados.
      Nota: Muitos resultados possíveis estão disponíveis para análise de programas de controle de computador. Exemplos de resultados selecionados para análise pode incluir: latência, comprimento de caminho, thigmotaxia e velocidade de natação. Mais comumente relataram resultados são a latência, como usado no exemplo fornecido.
    2. Formate os dados para a análise estatística (seja no formato longo ou largo dependendo da preferência do software).
      Nota: O formato tem uma única coluna para tratamento (no caso, preenchido com "Ingênuo", "Sham" ou "TBI"), uma única coluna por dia (no caso "1", "2", "3", "4" ou "5") e uma única coluna para julgamento (ou "1", "2", "3", "4", "5" "6", "7" ou "8"). Precisamos também de uma coluna adicional para identificar a tentativa ("1" ou "2"). Grande formato tem uma única coluna para cada combinação de níveis de fator (assim, por exemplo, uma única coluna para ingênuos, dia 1, 1, tentativa experimental 1, outra coluna para ingênuos, dia 1, tentativa de julgamento 2, 2). Também, a diferença entre julgamento 1 e 2 do julgamento pode ser calculada para cada sessão e analisada como uma contagem de diferença.
    3. Para descobrir se há uma diferença global entre os grupos de lesões, execute as seguintes etapas.
      1. Em primeiro lugar, média a latência de labirinto de água para cada animal por 1 dia.
        Nota: Houve quatro sessões em cada dia, então, média quatro valores por animal para cada julgamento 1 e 2 do julgamento. Fazer este cálculo para os restantes dias também.
      2. Para verificar se há diferenças de prejuízo totais, execute um bidirecional medidas repetidas ANOVA. Existem dois fatores, o prejuízo e o dia. Lesão é um entre o grupo fator e o dia é uma dentro de fator de grupo. Nota: Aqui R foi usado.
      3. Se os resultados indicam uma diferença significativa devido a lesão, em seguida execute o teste de post-hoc de Tukey um para ver onde se encontram as diferenças.
    4. Para encontrar para fora se há diferenças entre os grupos de lesões em dias específicos, execute as seguintes etapas.
      Nota: Dia 1 é usado como um exemplo, e a mesma análise que precisa ser feito para todos os dias seguintes. Além disso, esta análise é feita de várias maneiras, primeiro para o julgamento apenas, 1 segunda para julgamento apenas 2 e o terceiros para a diferença entre julgamento 1 e 2 do julgamento. Julgamento 1 é usado como um exemplo; as mesmas etapas precisam ser usados para as outras análises.
      1. Em primeiro lugar, média a latência de labirinto de água para cada animal por 1 dia. Já havia quatro repetições de "Julgamento 1" em cada dia, os quatro valores médios para cada animal.
      2. Avalie se os dados são normalmente distribuídos.
        Nota: neste caso, os dados é contínuos e é normalmente distribuídos. Portanto, use a ANOVA one-way para determinar se a latência de labirinto de água em 1 dia é diferente entre INGÊNUOS, SHAM e TBI. Pacote de software estatístico R e a função de aov() foram usados aqui.
      3. Use um nível de significância de 5%. Se a resultante p-valor é menor que 0,05, então há diferenças significativas entre os grupos.
      4. Para determinar onde essas diferenças residem, use teste de post-hoc de Tukey. Esta é a função TukeyHSD() em R.
    5. Para descobrir se existem diferenças entre dias dentro dos grupos de tratamento, siga estas etapas.
      1. Primeiro, execute uma ida medidas repetidas ANOVA. Isso pode ser feito em R usando a função ezANOVA dentro do pacote de ez.
      2. Antes de executar uma ANOVA de medidas repetidas, primeiro verifique a suposição sobre a esfericidade.
        Nota: A dentro do fator atende (dia) a suposição de esfericidade para todos os grupos, assim, não há nenhuma necessidade de usar correções de continuidade.
      3. Se encontram-se diferenças entre os dias (p-valores inferior a 0,05), em seguida, execute um teste post-hoc para determinar exatamente onde residem as diferenças. Esta etapa é alcançada em R usando a função pairwise.t.test.
    6. Gráfico dos resultados usando gráficos de linha (Figura 5). Também, julgamento, julgamento de 1 2 pode ser graficamente.

Representative Results

Resultados do processo de neuroscore (Figura 2) demonstram o potencial de falso positivo (SHAM e TBI grupos no dia 0) e a sensibilidade do teste para detectar pequenas diferenças. Falsos positivos podem ocorrer quando o rato não é bem habituado ao procedimento, portanto, não é totalmente relaxado. Dia 0 é antes da cirurgia, portanto, idealmente, todos os ratos devem atingir o critério de um escore de 0 antes de entrar em um estudo. Dias 1-3 demonstram a sensibilidade deste teste para detectar pequenas alterações na pontuação. Enquanto existe um potencial para uma pontuação tão alta quanto 21, pontuação superior a 3 é incomuns neste modelo. Neste exemplo, repetido medidas ANOVA não revelaram nenhuma diferença entre dias para INGÊNUO (p = 0,78) ou SHAM (p = 0,09); no entanto, para o grupo TBI havia diferenças entre dias (p < 0,05). Post-hoc de comparação emparelhada indicou que o dia 0 é significativamente diferente dos dias 1, 2 e 3. Este resultado demonstra que o prejuízo produzido alterações pequenas mas significativas na avaliação neurológica.

Uma análise mais aprofundada utilizando o teste de Kruskal-Wallis em comparação INGÊNUA, SHAM e TBI em cada dia, seguido de teste de post-hoc de Tukey para determinar exatamente onde residem as diferenças. Para o dia 0, a estatística de teste foi 13.37, p = 0,001, e SHAM era significativamente diferente do INGÊNUO (p = 0.008). Idealmente, deveria não haver diferenças entre os grupos no dia 0, como foram administrados sem tratamentos ou procedimentos. Neste caso, os ratos devem ser ainda mais habituados ao procedimento, ou transferidos para um estudo do comportamento não. Para o dia 1, a estatística de teste foi 32,39, p = 9.75e-8, com o teste post-hoc , indicando que o SHAM e TBI foram significativamente diferentes do INGÊNUO (p = 0,002, p = 5.9e-7, respectivamente). Para o dia 2, a estatística de teste foi 23,39, p = 8.34e-6 e SHAM e TBI eram diferentes dos INGÊNUOS (p = 0,002, p = 6.8e-5). Para o dia 3, a estatística de teste foi 38,4, p = 4.59e-9, e novamente, SHAM e TBI foram significativamente diferentes do INGÊNUO (p = 0,001, p = 2.1e-8, respectivamente). Estes resultados apontam para o fato de que a preparação de Souza também produz alguns défices na avaliação neurológica às vezes cedo após lesão.

Representante do feixe equilíbrio resultados (Figura 3) demonstram a sensibilidade do teste de feixe-equilíbrio para déficits logo após a lesão (Figura 3, à esquerda) e num ponto do tempo mais após a lesão (Figura 3, direita). A sensibilidade do teste aos efeitos da lesão cerebral de feixe-equilíbrio diminui ao longo do tempo, porque como os ratos ilesos a idade e ganham de peso, eles têm maior dificuldade de equilíbrio na trave. Em pontos de tempo mais tarde, o feixe é girado para que os ratos são balanceamento do lado mais largo da viga. No entanto, por 6 meses após a lesão, este teste não é mais sensível aos efeitos da lesão como idade e/ou peso confundir a capacidade de executar a tarefa (Figura 3, direita). Como alternativa, cura pode ter ocorrido no sistema vestibular, e estes dados refletem com precisão que a capacidade dos ratos para equilibrar atinge o mesmo nível que os grupos de controle.

Na comparação ingênua, SHAM e TBI em cada dia, usamos o teste de Kruskal-Wallis. Resultados para pontos de tempo cedo após lesão são mostrados na Figura 3, deixaram. No dia 0, o teste de Kruskal-Wallis encontrado o valor da estatística de teste para ser 6,81, p = 0.033. Houve diferença significativa entre os grupos, com teste de post-hoc de Tukey, mostrando que o ingênuo grupo era diferente do SHAM (p = 0,038); no entanto, todos os três grupos tinham meios bem abaixo de 2.0, indicando que todos os ratos tinham conhecido os critérios para continuar. Seria preferível não ter nenhuma diferença entre os grupos no dia 0, mas desde que todos os grupos estão abaixo de 2, podem continuar no estudo. Em 1 de PID, a estatística de teste de Kruskal-Wallis foi 69,72, p = 7.25e-16. Teste de post-hoc de Tukey mostrou que o grupo TBI foi significativamente diferente de grupos o ingênuo e o Sham (p = 4.9e-14, p = 9.1e-08, respectivamente). No dia 2, a estatística de teste de Kruskal-Wallis foi 62.84 e p = 2.26e-14, com o teste post-hoc mostrando TBI diferente de INGÊNUO e SHAM (p = 1.0 e-10, p = 2.1e-10 respectivamente). No dia 3, a estatística de teste de Kruskal-Wallis foi 62.69 e p = 2.44e-14. O teste post-hoc mostrou TBI diferente de ingênuo e SHAM, (p = 9.6e-12, p = 1.7e-08, respectivamente). Além disso, olhamos para ver se havia alguma diferença entre dias dentro de cada grupo. Usando um repetidas medidas ANOVA, para INGÊNUOS, não houve diferença entre os dias (p = 0,367). Para SHAM e TBI havia diferenças entre dias (p = 0,002, p = 3.90e-29, respectivamente). Post-hoc de comparações emparelhadas reveladas para SHAM dia 1 é significativamente diferente do dia 2 e dia 3 (p = 0,001, p = 0,01, respectivamente), e para TBI, dia 0 é significativamente diferente do formulário dias 1, 2 e 3 (p < 2e-16, p = 5.5 e-16 e p = 2.7e-13, respectivamente). 1 dia também é significativamente diferente do dia 3 (p = 0.036).

Em 6 meses após a lesão, comparações entre INGÊNUOS, SHAM e TBI foram feitas em cada dia, usando o teste de Kruskal-Wallis (Figura 3, direito). No dia 0, o valor da estatística de teste foi 3.36 e p = 0.187, então não havia diferenças no dia 0. Todos os meios eram abaixo de 2, indicando que todos os ratos e grupos preencheram os critérios para continuar no estudo. Em 1 de PID, a estatística de teste foi 6.11, p = 0,047; no entanto, a análise post-hoc usando teste post-hoc de Tukey mostrou que nenhum dos grupos foram significativamente diferentes quando respondendo por vários testes de hipóteses. No dia 2, a estatística de teste foi 4.09, p = 0,13, ns, e no dia 3, a estatística de teste foi 2.91, p = 0,23, ns. Assim, não houve diferença entre os grupos de lesão em qualquer dia.

Além disso, olhar para as diferenças entre dias dentro dos grupos de tratamento, uma ANOVA de medidas repetidas revelaram diferenças significativas entre os dias de INGÊNUO, SHAM e TBI (p = 0.0003, p = 2.61e-5, p = 5.59e-7, respectivamente; Figura 3, direita). Post-hoc testes demonstraram as diferenças a seguir. Para INGÊNUOS, dia 0 foi significativamente diferente dos dias 1, 2 e 3 (p = 0,002, p = 0,044, p = 0,004, respectivamente). Para Souza, todos os dias eram significativamente diferentes entre si: dia 0 foi significativamente diferente dos dias 1, 2 e 3 (p = 0,0006, p = 0,001, p = 0,0006, respectivamente); Dia 1 era significativamente diferente dos dias 2 e 3 (p = 0,031, p = 0,0006, respectivamente); e dia 2 era significativamente diferente do dia 3 (p = 0,044). Para TBI, dia 0 é significativamente diferente dos dias 1, 2 e 3 (p = 0,0005, p = 0,0008, p = 0,0005, respectivamente).

Os resultados do teste de feixe-pé são mostrados em dois pontos de tempo (Figura 4). Semelhante ao feixe-equilíbrio, este teste detecta déficits cedo após a lesão (Figura 4, à esquerda). No entanto, por 6 meses após a lesão, não há não há diferenças significativas entre os grupos (Figura 4, direita), sugerindo que a cicatrização ocorreu no grupo lesionado. Este resultado pode refletir os efeitos de idade mais avançada e aumento de peso.

Para comparar o INGÊNUO, SHAM e TBI cada dia mais cedo após lesão, utilizou-se uma ANOVA One-Way. Não havia diferenças no dia 0 (F = 0,859, p = 0,426) e latências todos estavam abaixo de 5 s, indicando que todos os ratos preencheram os critérios para continuar no estudo. Na PID 1, havia uma estatística de teste significativo de 15,36, p = 1.18e-6. Teste de post hoc de Tukey indicou uma diferença significativa entre a TBI e INGÊNUO (p = 0.000004) e TBI e SHAM (p = 0,0001). No dia 2, houve uma diferença significativa entre os grupos (F = 9,49, p = 0,0002). Teste post-hoc revelou diferenças entre a TBI e INGÊNUO (p = 0,0002) e TBI e SHAM (p = 0,005). No dia 3, a estatística de teste global igual a 6,27, p = 0,0025, indicando que existem diferenças entre os grupos. Teste post-hoc de Tukey mostrou que novamente, TBI era diferente do INGÊNUO e SHAM (p = 0,003, p = 0,035, respectivamente).

Usando uma medida repetida One-Way ANOVA, diferenças entre dias dentro dos grupos de tratamento foram exploradas. Primeiro é a suposição de esfericidade foi verificada para cada grupo. O fator dentro de (dia), não satisfaziam a suposição de esfericidade dos grupos INGÊNUO ou SHAM, assim, a correção de continuidade, com efeito de estufa-Grier foi aplicado a esses grupos. Para Souza, não houve diferença entre os dias (p = 0,066), INGÊNUA e TBI havia (p = 0,006, p = 2.89E-7, respectivamente). Comparações post-hoc de INGÊNUO, mostrou a diferença era entre dia 0 e 1 dia (p = 0,003). Para TBI, as diferenças eram entre dia 0 e dias 1, 2 e 3 (p = 9.2e-6, p = 0,0005, p = 0,002, respectivamente), e havia uma diferença entre o dia 1 e dia 3 (p = 0,018).

Em 6 meses após a lesão, não havia diferenças significativas entre INGÊNUOS, SHAM ou TBI em qualquer dia (dia 0, F = 0,315, p = 0.732; Dia 1, F = 0,336, p = 0.717; Dia 2, F = 0,5, p = 0,61; Dia 3, F = 1,17, p = 0,322; Figura 4, direita). Ao comparar as diferenças entre os dias dentro de cada grupo, havia uma diferença significativa no grupo TBI (p = 0,026), com dia 0 sendo diferente dos dias 1, 2 e 3 (p = 0,026, p = 0,002, p = 0,002). Não havia diferenças entre qualquer dias para INGÊNUO ou SHAM (p = 0,104, p = 0,063, respectivamente).

Dados da versão de memória de trabalho do labirinto de água Morris podem ser graficamente em uma variedade de maneiras. Aqui demonstramos os resultados por 3 meses (Figura 5, à esquerda), e a linha de 12 meses (Figura 5, direita) após a lesão, utilizando os dois gráficos para representar a evolução temporal e parcelas de caixa para fornecer um resumo geral dos dados (Figura 5, inferior). Podemos então Visualizar julgamento 1 comparações e julgamento 2 comparações independentemente em cada dia, bem como diferenças globais devido a lesão. Latências de julgamento 1 representam a memória de referência e latências de julgamento 2 retratam a memória de trabalho.

Os dados de 3 meses após a lesão de ratos são mostrados na Figura 5, à esquerda. Para julgamento 1 (Figura 5, esquerda superior), ao comparar INGÊNUO, SHAM e TBI, só dia 4 mostrou diferença significativa entre os grupos (F = 4.12, p = 0,025), com teste o post-hoc de Tukey, indicando que o TBI era diferente do INGÊNUO (p = 0,019). Para julgamento 2 (Figura 5, médio esquerdo), houve uma diferença significativa no dia 1 (F = 5.93, p = 0,006), com análise post-hoc indicando que TBI era diferente do SHAM (p = 0,005). As medidas repetidas ANOVA não encontrou uma diferença geral entre grupos de lesão em 3 meses (p = 0,56). Estes resultados sugerem que estes ratos têm déficits pequenos, mas significativos em referência, bem como a memória trabalhando em 3 meses após a lesão.

Aos 12 meses após a lesão, comparar o julgamento 1 INGÊNUO, SHAM e TBI (Figura 5, direita), repetido medidas ANOVA demonstraram um efeito geral significativo de lesão (F = 3.94, p = 0,03). Comparações emparelhadas revelaram que TBI foi significativamente diferente de ambos INGÊNUO e SHAM (p = 0,043 e p = 0,006., respectivamente) (Figura 5, canto inferior direito). Além disso, comparando grupos de lesão em cada dia, usando uma ANOVA One-Way, foi detectada uma diferença significativa no dia 3 (F = 7.28, p = 0,003). Comparação de post-hoc revelou que TBI era diferente do SHAM (p = 0,0018) (Figura 5, canto superior direito). Para julgamento 2, as medidas repetidas ANOVA encontraram diferença significativa devido a lesão (F = 3,97, p = 0,029), com post-hoc de comparações emparelhadas detectar a diferença entre a TBI e SHAM (p = 0,017) (Figura 5 , canto inferior direito). One-Way ANOVA cada dia encontrado diferenças significativas nos dias 2 e 4. No dia 2 (F = 4,02, p = 0,028), teste de post-hoc de Tukey encontrado que TBI era diferente do SHAM (p = 0,023). No dia 4 (F = 4.12, p = 0,026), análise post-hoc encontrou uma diferença entre a TBI e SHAM (p = 0,025) (Figura 5, direita média).

Figure 1
Figura 1. Diagrama do labirinto de água. Este diagrama demonstra as localizações de plataforma possíveis (1, 2, 3, 4) e pontos de partida (N, S, E, W) para o labirinto de água Morris de memória de trabalho. Ratos são permitidos dois ensaios de cada par de localização/plataforma inicial. Há um intervalo entre trial de 15 s e resto 4 min em uma câmara de aquecimento entre pares de ensaios para um total de quatro pares de ensaios para cada sessão diária. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Resultados de teste do neuroscore Todos os ratos foram treinados para tarefas simples de testes reflexas antes do dia 0 (ver texto para obter detalhes sobre treinamento, testes e pontuação). Os resultados são mostrados como mediana (linha preta), primeiros e terceiros quartis (limites de caixa) e 10th e 90th percentis (barras de erros). A média também é mostrada pelo linhas vermelhas e pontos distantes como pontos pretos. Os dados são apresentados para a linha de base do dia 0 e dias pós-lesão 1-3. Os resultados do post-hoc t-teste para cada ponto de tempo são mostrados nos gráficos: * p < 0,001 vs TBI dia 0; ^ p < 0,001 vs mesmo dia INGÊNUO. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Resultados de teste do feixe-balanço Todos os ratos foram treinados para equilibrar na trave, até que eles poderiam equilibrar por 60 s para três ensaios consecutivos (veja texto para detalhes sobre treinamento, testes e pontuação). Em testes subsequentes, ratos foram marcados em uma escala de 1-6 com 1 significando equilíbrio normal e 6 não significando nenhuma tentativa de permanecer na trave. Os resultados são mostrados como mediana (linha preta), primeiros e terceiros quartis (limites de caixa) e 10th e 90th percentis (barras de erros). A média também é mostrada pelo linhas vermelhas e pontos distantes como pontos pretos. Os dados são apresentados para a linha de base do dia 0 score, dias pós-lesão 1-3 (à esquerda) e 6 meses após a lesão (à direita). Os resultados do post-hoc t-teste para cada ponto de tempo são mostrados nos gráficos. Para dias 0-3: * P < 0,001vs TBI dia 0; ^ p < 0,001 vs mesmo dia INGÊNUO; @ p < 0,001 vs mesmo dia SHAM. 6 meses: * p < 0,001vs TBI dia 0; # p < 0,001 vs INGÊNUO dia 0; & p < 0,001 vs SHAM dia 0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Resultados de teste do feixe-Walk Todos os ratos foram treinados para desviar o feixe enquanto tecelagem entre postagens para escapar para uma caixa de segurança. Eles foram treinados até que preencheram critérios de ≤ 5 s em três ensaios consecutivos (veja texto para detalhes sobre treinamento, testes e pontuação). Teste de linha de base foi concluída no dia 0 e ratos foram subsequentemente testados em dias 1-3 após lesão (à esquerda). Um subconjunto dos ratos era também retestado em 6 meses após a lesão (à direita). Os resultados são graficamente como a mediana (linha preta), primeiros e terceiros quartis (limites de caixa) e 10th e 90th percentis (barras de erros). A média é também indicada pelo linhas vermelhas e pontos distantes como pontos pretos. Os resultados dos testes post-hoc para cada ponto de tempo são mostrados nos gráficos. Para dias 0-3: * P < 0,001vs TBI dia 0; ^ p < 0,001 vs mesmo dia INGÊNUO; @ p < 0,001 vs mesmo dia SHAM; 6 meses: * p < 0,001vs TBI dia 0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. Resultados da memória trabalhando Morris água labirinto. Os resultados são mostrados para grupos distintos de ratos em 3 meses (coluna esquerda) e 12 meses (coluna direita). Os painéis superiores mostrar as latências médias (o tempo que levou os ratos para encontrar a plataforma escondida) sobre os primeiros ensaios do emparelhamento trial-dois para cada um dos cinco dias de testes. Os painéis de médios mostrar as latências médias dos julgamentos de segunda em cada dia. Resultados da análise post-hoc são mostrados nos gráficos (* p < 0.05 vs mesmo dia SHAM; ^ p < 0.05 vs mesmo dia INGÊNUO). Os painéis inferiores resumir os resultados mostrando a mediana (linha preta), 25th 75th percentis (limites de caixa) e 10th e 90th percentis (barras de erros). A média também é mostrada pelo linhas vermelhas e pontos distantes como pontos pretos. Resultados da análise post-hoc são mostrados nos gráficos (*p < 0.05 vs mesmo julgamento SHAM, ^ p < 0.05 vs mesmo INGÊNUO de julgamento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Quando realizar qualquer tipo de teste comportamental, é fundamental para ser consistente. Este detalhe inclui muitas considerações que parecem insignificantes, mas tem um grande impacto sobre a resposta do animal. Um passo importante que não pode ser esquecido é a aclimatação de animais para casa-gaiola/moradia antes de qualquer experiência. Esta preparação reduz os efeitos da resposta ao estresse fisiológico dos animais, que podem alterar os resultados comportamentais18. Da mesma forma, é absolutamente essencial que todo esforço é feito para lidar com todos os animais da mesma maneira. Essa consistência inclui, como mencionada anteriormente, aclimatação à moradia e também aclimatação à manipulação e transporte entre quartos antes do treinamento ou teste. Este conceito não pode ser exagerado. Manipulação de animais desleixada é desastrosa para qualquer teste comportamental19. Da mesma forma, todo o esforço precisa ser feita para testar os animais ao mesmo tempo do dia, se durante o seu ciclo escuro ou claro. Para os testes aqui discutidos, testes na fase clara ou escura são aceitável, desde que os testes são realizados de forma consistente. Testes feitos em momentos diferentes durante o ciclo circadiano foi mostrado para alterar os resultados comportamentais18,20. Além disso, o manipulador, bem como o animal deve ser em um estado de calma, livre de stress para aumentar a precisão dos resultados.

Particularmente no caso do Neuroscore, negativos e falsos positivos são comuns. Falsos positivos normalmente ocorrem quando um animal não é totalmente habituado ao manuseio e teste. O animal deve ser completamente relaxado, então a resposta observada é reflexivo e não devido ao aperto da reacção fora de estresse ou medo de músculos. Um manipulador tenso pode influenciar os resultados através da transmissão de estresse para o animal. Portanto, segurando o rato muito solto ou muito apertado podem tanto ser problemáticos. Além disso, se o manipulador estiver nervoso, isso pode confundir a reação dos ratos. Há também o risco de que um observador inexperiente irá interpretar mal a resposta do rato. Bom treinamento e muita prática são essenciais para o sucesso e a consistência da Neuroscore.

Em geral, a principal preocupação com estes testes é a falta de uma grande diferença e às vezes não há diferença, entre os grupos de tratamento. Desde que os animais podem reagir diferentemente a diferentes manipuladores, ruídos, tempos de dia e potencialmente, temporadas21, todo esforço deve ser feito para reduzir todos os possíveis fatores de confusão.

Os resultados das tarefas de feixe-equilíbrio e feixe-pé mostrados aqui demonstram que estes testes são úteis no início após lesão para detectar os déficits na função vestibulomotor. Normalmente estes défices resolução tempo1,14. Neste modelo, por 6 meses após a lesão, resolveram os défices induzida por lesão. Os resultados do ponto de tempo 6 meses indicam que não existem diferenças entre NAIVE, SHAM ou ratos feridos; no entanto, todos os ratos foram relaxantes nas jaulas em casa por 6 meses, envelhecendo e ganhando peso. Assim, quando que eles são re-testados em 6 meses depois da cirurgia (ou equivalentes no caso de INGÊNUO), eles são essencialmente tornar-se velho e gordo, e portanto todos os grupos não executam bem como eles em comparação com sua linha de base dia 0 resultados.

Outra consideração importante é que o teste de comportamento utilizado é o teste correto. Por exemplo, os testes utilizados aqui são pensados para representar a função de áreas específicas do cérebro. Um exemplo é o sistema vestibular, que é importante para o equilíbrio. Áreas do cérebro envolvidas na função sensório-motor, tais como o córtex incluindo córtex sensório-motor, o tálamo, os neurônios corticoespinhal, gânglios basais, nigro-estriado, para citar alguns, são todos os envolvidos na coordenação de vestibulomotor. Assim, déficits no balanço de feixe ou feixe-pé indicam possíveis défices nestas áreas. Além disso, o hipocampo e córtex pré-frontal estão envolvidos na aprendizagem e memória funções testaram pelo labirinto de água de memória de trabalho. Mesmo quando o teste correto é escolhido, as limitações dos testes que são empregados devem ser mantidas em mente. Por exemplo, nenhum dos testes aqui apresentados são sensíveis a défices de humor, como depressão, ansiedade ou interações sociais, tais como agressão, impulsividade ou tomada de decisão. Para reiterar, é imperativo para escolher o teste apropriado para a área de comportamento e cérebro a ser avaliada.

Interpretação e análise de dados comportamentais devem ser abordados com cautela. É altamente recomendável incluir análises de poder de cada tipo de ensaio, separadamente, porque, usando um resultado comportamental como uma medida de um déficit neural, é, por natureza, uma medida bruta de um efeito sutil. Além disso, testes diferentes requerem diferentes tipos de análises estatísticas. Por exemplo, os testes de Neuroscore e feixe-equilíbrio descritos são dependentes a interpretação de um observador treinado para marcar o comportamento usando uma escala ordinal. Esses tipos de dados não são contínuos e estatísticas não é normalmente distribuídas, então não paramétricas devem ser usadas, tais como o teste de Kruskal-Wallis, como demonstrado nas seções 6.1 e 6.2. Alternativamente, o feixe-pé e testes de labirinto de água de memória de trabalho produzem dados que são contínuos e normalmente distribuídas, então paramétricas estatísticas podem ser usadas, como ANOVA One-Way ou medidas repetidas ANOVA de duas vias, conforme demonstrado em seções 6.3 e 6.4.

As tarefas comportamentais apresentadas aqui têm resistido ao teste do tempo e dar resultados reprodutíveis, particularmente quando emparelhado com o modelo FPI em ratos, embora existam muitos outros métodos de ensaio comportamental da lesão cerebral. O neuroscore é uma curta avaliação realizada com um mínimo de equipamento. Outros testes de reflexos e de força estão disponíveis e podem ser incorporados uma avaliação neurológica, tais como a tarefa de pulsão lateral, o teste de acinesia, o teste do plano inclinado e força de preensão (ver Fujimoto et al 22 e ouro et al 23). o feixe-equilíbrio e feixe-pé tarefas descritas são medidas dos défices vestibulomotor após lesão. Coordenação de Vestibulomotor pode ser considerada uma medida do comportamento locomotor bruto, enquanto outras medidas dos défices locomotoras brutos incluem o Rotarod, polo rotativo e abrir a atividade de campo. A capacidade de nadar, medida como velocidade de mergulho durante o labirinto de água, é também uma indicação da coordenação motora bruta22,23. A tarefa de labirinto de água de memória de trabalho conclui este conjunto de testes de detecção de ambos os défices de memória (indicados pelo julgamento 1) de referência e trabalhando os défices de memória (indicados pelo julgamento 2 ou a diferença entre julgamento 1 e 2 de julgamento). Outras medidas da função cognitiva incluem o labirinto radial do oito braço, o labirinto de Barnes, o teste de reconhecimento de objeto romance e diferentes variações do labirinto de água. Estas variações incluem o labirinto de água original Morris e o labirinto de Lashley III (novamente ver Fujimoto et al . 22 e ouro et al 23). esta bateria de testes tem provado para ser útil cedo depois da lesão e, em graus variados, fora a 12 meses após a lesão1.

Além disso, as tarefas demonstradas aqui podem ser usadas com diferentes cepas, sexo e idade dos ratos; no entanto, acomodações podem precisar de ser feitas para diferentes tamanhos e em casos de maior fragilidade. Por exemplo, ratos mais velhos, mais pesados precisam de um raio mais amplo para a tarefa de feixe-equilíbrio e ratos envelhecidos, frágil, pode precisar de menor duração dos tempos de nadar na água de labirinto. Assim, há espaço para a flexibilidade nestes testes e potencial para desenvolvimento de novos testes para acomodar as hipóteses e situações diferentes.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos Ian Bolding assistência com preparação cirúrgica de temas e Elizabeth Sumner para sua edição meticulosa. Estes estudos foram concluídos como parte de uma equipe financiada pela The Moody projeto para pesquisa de lesão cerebral traumática translacional.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley rats Charles Rivers Laboratories
251 Ballardvale St
Wilmington, MA 01887-1096
Phone: 800-522-7287		 CD-IGS rats, strain code 001 male, albino, 300-350g at arrival
Name Company Catalog Number Comments
Beam-Balance
Beam home built wood, 25" l x 1" h x 3/4" w sealed with polyurethane varnish
C-clamp Home Depot 1422-C 2 1/2"
barrier Home Depot styrofoam, 18" x 17 1/2"
table (for both BB & BW) generic office supply 37" h x 30" w x 60" l
Name Company Catalog Number Comments
Beam-Walk
Beam home built wood 38-1/2" l x 1-3/4" h x 1" w sealed with polyurethane varnish (~ 37" off floor)
escape box home built woodpainted black 12 1/2 " l x 9" h x 7-1/4" w
nails (pegs) 2"
hinges
clamps
white noise machine San Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121
Phone: (858)530-2600		 http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf
light Home Depot
Name Company Catalog Number Comments
Morris Water Maze
fiberglass pool manufacturer unknown
(similar to one made by SDI) San Diego Instruments 7000-0723 72" diameter x 30" deep (~ 500 gal)
plexiglass platform hand-made by Maggie Parsley 10 cm diameter, 26" tall with silicone applied to the surface of the platform to provide a gripping surface
(similar to one made by SDI) SDI 7500-0272
plexiglass animal boxes w/ lids UTMB Machine Shop 2 boxes, 10" w x 16" L x 9" h
spot lights/ heat lamps Home Depot 3 around pool, 2 over boxes to dry animals
AnyMaze San Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121
Phone: (858)530-2600		 /9001 http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/

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References

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Detecção de défices comportamentais em ratos após lesão cerebral traumática
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Hausser, N., Johnson, K., Parsley, M. A., Guptarak, J., Spratt, H., Sell, S. L. Detecting Behavioral Deficits in Rats After Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (131), e56044, doi:10.3791/56044 (2018).

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