Summary
우리는 제자리에 액체 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 실시간 이미징 및 이온된 수 boehmite 입자의 원소 조성 분석에 대 한 절차를 제시.
Abstract
제자리에서 이미징 및 원소 분석 물에 (AlOOH) boehmite 입자의 액체 진공 인터페이스 (SALVI) 및 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 분석 시스템을 사용 하 여 실현 된다. 이 종이 방법에 설명 합니다 및 키 단계를 통합 하는 진공 SEM을 얻는 이차 전자 (SE) 이미지 높은 진공 상태에서 액체에서 입자의 호환 SAVLI. 에너지 흩어진 엑스레이 분광학 (EDX)는 이온된 (DI) 수만와 빈 채널을 포함 하 여 액체 및 제어 샘플에서 입자의 원소 분석을 얻을 하는 데 사용 됩니다. 액체에서 일시 중지 (AlOOH) 합성된 boehmite 입자는 액체 sem의 그림에서 모델로 사용 됩니다. 결과 입증 입자 좋은 해상도와 SE 모드에서 이미지가 포함 된 될 수 있습니다 (즉, 400 nm). AlOOH EDX 스펙트럼 알루미늄 (Al) 디 물과 비교할 때 빈 채널 제어에서 중요 한 신호를 보여준다. 제자리에서 액체 SEM 공부 많은 흥미로운 애플 리 케이 션 액체에서 입자를 강력한 기술입니다. 이 이렇게 액체 현미경 이미징 및 EDX 분석 SALVI를 사용 하 여 수행할 때이 방식을 사용 하 여 잠재적인 함정 줄일 하 고 기술적인 노하우를 제공 하는 것을 목표로.
Introduction
스캐닝 전자 현미경 (SEM) 고해상도 이미징1을 생산 하 여 다양 한 표본 조사에 널리 적용 되었습니다. 에너지 흩어진 엑스레이 분광학 (EDX) SEM와 관련 된 원소 구성1의 결정을 수 있습니다. 전통적으로, SEM는 이미징만 건조 하 고 단단한 샘플에 대 한 적용 됩니다. 지난 30 년 동안에서 환경 전자 현미경 (ESEM) 증기 환경2,3,,45부분 수산화 샘플 분석을 위해 개발 되었다. 그러나, ESEM는 원하는 고해상도6젖은, 완전히 액체 샘플의 이미지를 수 없습니다. 젖은 sem의 세포 또한 젖은 이미지 표본 SEM7,8;를 사용 하 여 개발 되었다 그럼에도 불구 하 고, 이러한 세포 생물학 견본을 위해 주로 개발 되었다 backscattered 전자 이미징, 그리고 그 디자인9,10응용 프로그램에 대 한 더 많은 액세스할 수 있습니다.
SEM을 사용 하 여 그들의 네이티브 액체 환경에서 다양 한 샘플 분석에 문제를 해결 하려면 우리는 진공 호환 미세 장치, 분석에 액체 진공 인터페이스 (SALVI), 높은 공간 해상도 보조 수 있도록 시스템 발명 SEM.에서 높은 진공 모드를 사용 하 여 액체 샘플의 전자 (SE) 이미징 및 원소 분석 이 새로운 기술은 다음과 같은 독특한 특징을 포함 한다: 1) 액체 직경; 1-2 µ m의 작은 조리개에서 직접 조사는 2) 액체 표면 장력;에 의해 구멍 내에 보관 된 그리고 3) SALVI는 휴대용이 고 더 이상의 분석 플랫폼11,12,13,,1415,16,17 적응 시킬 수 있다 ,18.
100 nm 두꺼운 실리콘 나이트 라 이드 (죄) 막 이루어져 SALVI 그리고 200 µ m 넓은 아닌입니다 (PDMS) 블록의 만든. 죄 막 창이 아닌 봉인에 적용 됩니다. 제작 내용과 주요 설계 고려 사항 이전 논문 및 특허11,,1920에 상세한 했다. 현재, 선도적인 제조 업체 및 현미경 검사 법에 대 한 소모품 공급의 배포자 SALVI 장치 액체 sem의 응용21,22에 대 한 상업적으로 판매 하는 라이센스를 구입 했다.
진공 기반 분석 악기에서 SALVI의 애플 리 케이 션 수성 솔루션 및 복잡 한 액체 혼합물 biofilms, 포유류 세포, 나노 입자, 전극 재료12, 등의 다양 한을 사용 하 여 입증 되었습니다. 14 , 17 , 20 , 23 , 그러나 24. 대부분 위에서 언급 한 작업의 핵심 분석 도구, 따라서 액체의 응용으로 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 (ToF-심즈)을 활용 하는, SALVI과 SEM 완전히 탐험 되지 않은. 이 작품에서 SALVI 액체 액체 현미경 이미징 및 EDX 원소 분석을 사용 하 여 큰 비 구형 콜 로이드 입자를 공부에 사용 되었습니다. 우리의 실험실에서 합성 하는 AlOOH 입자는 샘플에 의하여 이루어져 있다. Submicrometer 크기의 boehmite 입자 셨다 면 사이트에 높은-수준의 방사성 폐기물에 알려져 있습니다. 그들은 느리게 분해 하 고 폐기물 처리에 유 변 학적 문제가 발생할 수 있습니다. 따라서, 액체25boehmite 입자를 특성화 하는 기능이 중요 하다. 이 기술적인 접근 boehmite 입자 및 관련된 유 변 학적 특성의 향상 된 이해를 위한 다양 한 물리 화학적 조건에서 연구에 사용할 수 있습니다. 이 입자는 액체에 일시 중지 입자를 공부 하기 위하여 높은 진공 SEM SALVI를 적용 하는 방법을 단계별로 보여 활용 했다. SALVI과 sem의 통합 및 sem의 데이터 수집을 위한 주요 기술 포인트는 종이 내에서 강조 표시 됩니다.
프로토콜은 SALVI 및 액체 SEM 이미지를 사용 하 여 미래에 액체 SEM의 다양 한 응용 프로그램에서이 새로운 기술을 활용에 관심이 있는 자들에 대 한 액체 샘플 분석의 데모를 제공 합니다.
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Protocol
1. AlOOH 액체 샘플 준비
참고: 표본 또는 챔버 내부에 SEM 맨 손으로 만지지 마십시오. 파우더 무료 장갑 항상 때 SALVI 장치를 처리 하 고 SEM에 장착 무대 표면 분석 하는 동안 잠재적인 오염을 방지 하기 위해 착용 한다.
- AlOOH 재고 솔루션 (1 mg/mL)
- 10mg 10 mL 디 물 솔루션을 만들고 1 mg/mL AlOOH 주식에 AlOOH 분말의 분해.
- Ultrasonicate 5 분에 대 한 재고 솔루션
참고: 재고 솔루션의 pH는 약 4.6 산도 미터에 의해 측정. PH의 해결책 조정 및 그것은이 작품에 사용 되지.
- 10 µ g/mL의 희석 솔루션
- 1 mg/mL AlOOH 재고 솔루션 10 µ g/mL을 1 mL 피 펫을 통해 99 mL 디 물에 분배 하 여 희석.
- Ultrasonicate 5 분에 대 한 솔루션
참고: 재고 솔루션의 pH는 약 5.8 희석 후 pH 미터에 의해 측정.
2. 코트 탄소 SALVI 죄 막 창 스퍼터
- 삽입 막대 홀더에 탄소 막대.
참고: 막대 홀더는 경첩 단된 뚜껑에 연결 된 조각으로 확인 될 수 있다. - 핀셋의 쌍을 사용 하 고는 SALVI에 테이프를 조심 스럽게 제거 ' s 죄 막 창 프레임.
참고: 테이프 표면 분석 전에 죄 멤브레인을 보호 하기 위해 사용 됩니다. - 챔버 내부에 탄소 coater는 coater의 무대에서 SALVI 장치의 소계 튜브를 해결 하기 위해 탄소 테이프를 사용 하 여 똑바로 SALVI 장치를 보호 합니다. 뚜껑을 닫습니다.
- 보도 " 전원 " 진공 펌프를 시작 하는 버튼.
- 보도 " 전압 " 탄소 coater의 전면 패널에서 단추와 4.6 V까지 조정 하 여 값을 설정 (▲)와 아래 (▼)이이 작업에 대 한 단추.
참고: 전압 설정은 다양 한 탄소 coaters에 따라 달라질 수 있습니다. - 코팅 두께 모니터 전환 하 여 그것의 " 파워 " 버튼. 취소의 화면에 표시 읽기 " 두께 (nm) " 버튼을 눌러 0 " 0 " 읽기 0이 아닌 경우. 보도 " 타이머 " 탄소 coater에서 ' s 30을 증 착 시간을 설정 하려면 전면 패널 위쪽을 조정 하 여 s (▲)와 아래 (▼) 단추.
- 계속 탄소 coater ' s 작동 모드 전환 버튼으로 자동 " 자동 ◄ ► 수동 "를 " 자동 ". 스위치는 " 시작/중지 " 버튼을 " 시작 " 진공 탄소 coater에서 진공 게이지에 의해 측정 된 약 4 × 10 -4 mbar를 도달 하는 때 ' s 전면 패널.
- 두께 모니터 나타냅니다 탄소 코팅 20에 도달 했습니다 일단 nm, 보도 " 중지 " 코팅 프로세스를 종료 하 고 진공 물개 환기 버튼.
- 뚜껑 열고 꺼내 장치를 처리할 때 비닐 장갑을 사용 하 여 탄소 코팅 SALVI 장치.
참고: 탄소와 샘플 코팅 충전 효과 억제 하 여 sem의 이미징에 필요한 SE 신호 개선 샘플에 전도성 레이어를 만듭니다. 장치 sem의 단계에서 설치 될 준비가 될 때까지 안전 하 게 커버와 깨끗 한 페 트리 접시에 코팅된 장치를 저장 합니다. 수 있도록 죄 막 충분히 코팅, 코팅 후 장치를 시각적으로 확인 하는 것이 좋습니다. 스퍼터 코팅의 두 번째 시간 10까지 측정 두께 함께 적용할 수 있는 코팅 하지 않으면 충분히 두꺼운, nm.
3. 장치 및 사용 SEM/Focused 이온 빔 (거짓말)는 게 Apertures을 SALVI 죄 막 사용 하 여 거짓말에 탑재
- 오픈 SEM 악기에 관련 된 현미경 제어 소프트웨어를 sem의 견본 약 실 열고
- 컨트롤 컴퓨터.
참고: 제어 소프트웨어 SEMs 다양 한 인해 다를 수 있습니다. - 클릭 하 여 견본 약 실 환기 " 환기 " 아래 관련된 현미경 제어 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)에 " 빔 제어 " 챔버 문 열려면 탭.
- 신중 하 게 (완료 한 후 배기) 챔버 문 엽니다.
- SEM 스테이지로 SALVI 장치 탑재
참고: 경우 그것은 그대로 시각적으로 보고 죄 막의 표면을 확인 하거나 장착 하기 전에 가벼운 현미경을 사용 하 여. Sem의 무대에 마운트 SALVI 장치 견본 챔버 내부 Everhart Thornley 탐지기 (ETD) 검출기를 만지지 해야 합니다.- 선택 표준 현미경 샘플 홀더 토막입니다. 적절 한 볼트와 육각 렌치를 사용 하 여 무대의 중심에는 스텁 수정.
- 스텁 탄소 이중 면 테이프의 두 스트립 위.
- 스틱 세 신 막 면 스텁에 탄소 테이프에 SALVI 장치
- 안전 하 게 SEM 금속 스텁 SALVI PDMS 블록 바인딩할 구리 테이프 한 면의 추가 2 개의 스트립을 사용 하 여 스텁에 SALVI 무력화. 또한, 구리 테이프를 사용 하 여 죄 프레임과 금속 스텁 연결 하. 테이프가 완전히 죄 막 커버 하지 않는 다는 것을 확인.
참고: 탄소와 구리 테이프의 사용 수 있도록 SEM 측정 중 죄 막에서 제거를 위한 연속 접지 경로. 그것은 접지를 보장 하 고 분석 하는 동안 충전 감소 하기 때문에 죄 프레임의 가장자리에 테이프의 위치를 확실히 중요 하다. 장치의 하단 탄소 이중 면 테이프를 통해 SEM 스텁 전체 접촉이 있어야 합니다. 테이프 처리의 가능한 손상을 방지 하려면 죄 막을 커버 하지 해야 합니다.
- 견본 챔버를 펌프
- 견본 약 실 문을 닫습니다. 선택은 " 높은 진공 " 아래 SEM 소프트웨어 GUI 모드는 " 빔 제어 " 페이지.
- 클릭은 " 펌프 "에 단추는 " 빔 제어 " 진공 청소기로 청소를 시작 하 고 적용 하 압력 손으로 챔버 문 원하는 진공 설정 될 때까지 페이지.
참고: 챔버 압력 이상 1.0 × 10 -5 Torr 도달 해야 하 고 이미징 하기 전에이 값 이하로 꾸준히 유지 해야 합니다. 이 영상에 대 한 높은 해결 해상도 사용 하는 중요 한 단계입니다. 압력 설정 GUI의 오른쪽 모서리에서 모니터링할 수 있습니다.
- 거짓말을 사용 하 여 죄 막에 구멍을 만들어
- 영역을 클릭 하 여 이미징 전자 빔 활성화는 " 일시 중지 " 도구 모음에 아이콘. 클릭 하 여 전자 빔 켜고는 " 빔에 "에 단추는 " 빔 제어 " 페이지. ETD 검출기 및 SE 모드에서 이미지를 선택 하는 " 감지기 " 드롭 다운 메뉴.
참고: 검출기는 SEMs의 다른 구성을 인해 달라질 수 있습니다. 렌즈 검출기 액체 SEM 분석에 대 한 적용 됩니다. - 링크는 Z 좌표 값을 실제 Free를 클릭 하 여 작업 거리 (FWD) 값은 " 링크 " 도구 모음에 아이콘. 좌표의 텍스트 상자에 숫자 10을 입력 하 여 작동 거리 (WD) 10 mm로 설정 " Z "에 " 탐색 " 때 페이지는 " 실제 " 거리 선택.
참고: WD SEMs 다양 한 인해 다를 수 있습니다. - 0.47 나, 8 가속 전압에 전자 빔의 전류를 설정 케빈, 그리고 해상도를 1024 × 884에서 해당 목록 영역을 이미징 하는 전자 빔에서 도구 모음에 표시 하는 상자.
참고: 전류와 전압 설정을 다른 SEMs에 따라 달라질 수 있습니다. - 복잡 하 게 아닌 (0.2 m m x 1.5 m m)를 찾아는 " X "와 " Y " 제어 모니터에 라이브 이미지 관찰 하 수동 사용자 인터페이스 (MUI) 보드에 손잡이 이동. 마우스를 사용 하 여 다른 한쪽에서는 아닌에 평행 하는 선을 그립니다. 클릭 " xT 맞춤 기능 "의 메뉴 드롭 다운에서 " 단계 " 선택 하 고 도구 모음에서 탭 " 수평 "는 아닌 정렬.
- 준비가 무대 기울기 0 °에서 값을 선택 하 여는 " T " 목록 상자에는 " 탐색 " 페이지. 근처에 아닌 명백한 입자 기능을 찾아서 사용 하 여 스테이지를 이동 하 여 노란색 십자가 아래 센터는 " X "와 " Y " 손잡이 이동. 1000 X와 트위스트 기능 확대는 " 대비 ", " 밝기 ", " 대략 ", 및 " 좋은 " 입자 기능의 이미지를 최적화 하려면 MUI에 손잡이.
- 경사 15 ° 단계에서 값을 선택 하 여는 " T " 목록 상자에는 " 탐색 " 페이지. 사용 " Z 제어 " 바퀴 기능 전자 빔 후 무대를 기울이면 지역 이미징의 화면에 노란색 십자가 아래 다시 끌어서 마우스를 아래로 눌러.
- 무대 다시 30 ° 기울기와 다시는 십자가 사용 하 여 아래 기능을가지고 있는 " Z 제어 ". 0 °로 다시 무대를 기울기 고 기능;의 위치를 관찰 eucentric 높이 확인 기능이 크게 이동 하지 않습니다 경우.
참고: eucentric 높이 찾기 이온 빔과 전자 빔 정밀 밀링 좋은 거짓말을 달성 하기 위해 동일한 위치에 초점을 계속 수행 됩니다. 기능은 0 °로 다시 무대를 기울이기 후 크게 이동 하는 경우 단계 3.4.6에서에서 프로세스를 반복 합니다. 최고의 정확도 대 한 각 새로운 탑재 된 샘플에 대 한 eucentric 높이 조정 합니다.
- 무대 다시 30 ° 기울기와 다시는 십자가 사용 하 여 아래 기능을가지고 있는 " Z 제어 ". 0 °로 다시 무대를 기울기 고 기능;의 위치를 관찰 eucentric 높이 확인 기능이 크게 이동 하지 않습니다 경우.
- 52 ° 단계에서 값을 선택 하 여 기울기는 " T " 목록 상자에는 " 탐색 " 페이지.
참고: 틸팅도 SEMs 다양 한 인해 다를 수 있습니다. - 비활성화는 " 일시 중지 " 이온 빔 이미징 영역에 있는지 확인 버튼을 클릭 하 여 도구 모음에 아이콘. 갈륨 소스 이온 빔에 클릭 하 여 설정 된 " 빔에 " 아래 단추는 " 빔 제어 " 페이지.
30의 이온 빔 가속 전압을 설정 하는
- 케빈과 빔 0.3 나 해당 전압 및 현재 목록 상자에서이 값을 선택 하 여 도구 모음에 있는 현재. 게는 아닌이 센터 지역 이미징.
- 의 목록 상자에서이 기능을 선택 하 여 패턴으로 동그라미를 선택 " 패턴 "에 " 패턴화 " 페이지. 설정는 " 외경 " 1 µ m는 " 안 직경 " 0 µ m는 " Z 크기 " 500 nm, 그리고 " 연연 시간 " 해당 텍스트 상자에 1 µs에.
- 유형
- " 시 "에 " 응용 프로그램 " 텍스트 상자에 대 한-에--밀링할 검색 창이의 주요 구성 요소는 실리콘 나이트 라 이드 때문에. 클릭은 " 메뉴/시작 패턴 패턴 "는 아닌 커버 검색 창에 구멍을 밀링 시작 버튼. 둥근 구멍의 시리즈를 밀링 과정 여러 번을 반복 합니다. 실험에서 여러 가지 구멍을 만들 수 있습니다.
참고: 구멍은 다른 아닌의 한쪽에서 떨어져 100 µ m. 죄 막에 빔을 피해를 최소화 하기 위해 빠르게 이동 합니다. 프로세스를 보통 밀링 SEM 거짓말의 추적 하 고 쉽게는 apertures 번호 아닌 매우 왼쪽 또는 오른쪽 측면에서 시작 됩니다. 연산자는 아래 또는 채널 및 개인 취향의 방향에 따라 위 로부터 선택할 수 있습니다. Sem의 거짓말 밀링 인지 확인 완료 하 고 적절 한 표본에서 apertures에서 탐색할 수 있도록.
- 영역을 클릭 하 여 이미징 전자 빔 활성화는 " 일시 중지 " 도구 모음에 아이콘. 클릭 하 여 전자 빔 켜고는 " 빔에 "에 단추는 " 빔 제어 " 페이지. ETD 검출기 및 SE 모드에서 이미지를 선택 하는 " 감지기 " 드롭 다운 메뉴.
- 0 °로 다시 무대에서 0을 선택 하 여 기울기는 " T " 목록 상자에는 " 탐색 " 페이지. 클릭 하 여 전자 빔, 이온 빔 해제 " 빔에 " 때 해당 빔 지역 영상 활성화 됩니다. 클릭 " 환기 "에 " 빔 제어 " 페이지 견본 약 실 환기.
4. 액체 샘플 SALVI 로드
- SALVI 디 물을 사용 하 여 청소 신중 하 게 그것은 완전히 배출 된 후 SEM 챔버 문 열고 하 고 무대에 SALVI 장치를 두고.
참고: 장치를 탑재 하 고 초점에 시간을 절약 하려면 것이 좋습니다 샘플을 로드할 때 무대에 장치를 유지 하. - 1 디 물 살 균 주사기로, 주사기, 소계 튜브 어댑터를 사용 하 여 미세 소자의 입구와 연결 그리고 3-5 분에 대 한 액체를 천천히 주입
참고: 주사기 펌프는 SALVI에 주입 솔루션은 필요한 모든 단계에 대 한 좋습니다. 이것을 설정 하 여 1 mL 균 주사기 포함 하는 솔루션 일정 한 속도로 흐름-주사기 펌프를 이용 하 여 100-250 µ L/분의 유량을 줄일 수 있는 피해 가능성이 죄 막이이 단계에서 수행할 수 있습니다. - 단계 4.1.2 세 번 10 µ g/mL AlOOH, 샘플의 농도 위해 1 단계에서 준비의 1 mL를 사용 하 여 탑재 디 물에 의해 희석 하지 반복.
- 는 주입 후 주사기를 제거. 입구와 출구의 SALVI 폴 리 에테르 에테르 케 톤 연합을 사용 하 여 연결 합니다. 실험실 잎사귀와 SALVI 외부 액체를 건조. 소계 튜브 또는 아닌 어떤 거품이 있다면 다시 실행 AlOOH 샘플 주입 없이 거품 소계 튜브 내에서 볼 수 있습니다 때까지.
참고: 손가락 강화 폴 리 에테르 에테르 케 톤 연합. 사용 하지 마십시오 너무 많은 강도 연합을 강화 하는 때 죄 막에 손상 될 수 있습니다 SALVI 장치 안에 중요 한 내부 압력 증가 만들지 마십시오.
참고:는 아닌 내부 거품 수 있습니다 스캔 영향을 원인과 이미지 쉬ift입니다. 장치 이외의 모든 액체는 진공 상태에 영향을 미칠 것입니다, 그리고 따라서 SALVI과 소계 튜브의 외부 해야 철저 하 게 건조 진공 챔버에 삽입 하기 전에. 또한, 장치에 물리적 손상 (예를 들어, 튜빙, 깨진 죄 막 창에) 유출 하는 필요는 없습니다. 그렇지 않으면, 챔버 압력 원하는 높은 진공 도달 하지 않을 수 있습니다, 튜브, 거품 형성 수 있습니다 및 액체 샘플 진공 청소기로 청소 하는 동안 손실 됩니다.
- SALVI 디 물을 사용 하 여 청소 신중 하 게 그것은 완전히 배출 된 후 SEM 챔버 문 열고 하 고 무대에 SALVI 장치를 두고.
5. 액체 현미경 이미징 및 원소 분석 실시
- ETD 검출기 SE 모드를 사용 하 여 이미지 견본 챔버 문 닫습니다. 선택은 " 높은 진공 " 아래 SEM 소프트웨어 GUI 모드는 " 빔 제어 " 페이지. 클릭은 " 펌프 "에 단추는 " 빔 제어 " 진공 청소기로 청소를 시작 하 고 원하는 진공 설립 때까지 챔버 문에 손 압력을 적용 하는 페이지.
- 활성화 영역을 클릭 하 여 이미징 전자 빔은 " 일시 중지 " 도구 모음에 아이콘. 클릭 하 여 전자 빔 켜고는 " 빔에 "에 단추는 " 빔 제어 " 페이지. ETD 검출기 및 SE 모드에서 이미지를 선택 하는 " 감지기 " 드롭 다운 메뉴.
8 가속 전압을 설정 하는
- 케빈과 빔 전류 0.47 nA에 해당 목록 상자 이미징 영역 전자 빔에서 GUI 도구 모음에 표시 됩니다. 숫자를 입력 하 여 WD 7 mm로 설정 " 7 " 좌표 텍스트 상자에 " Z "에 " 탐색 " 때 페이지는 " 실제 " 거리 선택.
참고: 빔 전압, 전류 및 작동 거리의 매개 변수 다른 SEMs에 따라 달라질 수 있습니다.
- 케빈과 빔 전류 0.47 nA에 해당 목록 상자 이미징 영역 전자 빔에서 GUI 도구 모음에 표시 됩니다. 숫자를 입력 하 여 WD 7 mm로 설정 " 7 " 좌표 텍스트 상자에 " Z "에 " 탐색 " 때 페이지는 " 실제 " 거리 선택.
- 1000 ×를 트위스트 기능 확대는 " 대비 ", " 밝기 ", " 대략 ", 및 " 좋은 " 입자 기능의 이미지를 최적화 하려면 MUI에 손잡이.
- 전자 빔 왜곡 하 여 영역을 이미지의 라이브 영상에 첫 번째 구멍 센터는 " X "와 " Y " MUI 보드에 손잡이 이동. 복잡 하 게 확대 200000 × 입자 이미지 확대는 " 확대 " MUI 보드에 손잡이. 화면 해상도 선택 " 1024 × 884 " 도구 모음에서 목록 상자에서.
- 도구 모음에서 목록 상자에서 30 µs로 스캔 속도 설정합니다. 전자 빔 이미징 영역에에서 표시 된 현재 이미지의 스냅샷을 F4 키를 누릅니다.
- 증분 번호를 포함 하 여 정의 된 파일 이름으로 이미지 as.tif 파일을 원하는 위치에 저장 하려면 Ctrl + S 키.
- 왜곡 하 여 축소는 " 확대 " 노브를 다음 인접 한 구멍을 찾습니다. 반복 단계 5.1.4-구멍의 나머지 부분에 AlOOH 입자 이미지를 5.1.6 작업.
- EDX를 사용 하 여 원소 분석
- 에너지 흩어지는 분광학 (EDS) 검출기 챔버에 삽입.
- 전자 빔 이미징 영역에 샘플을 보기 위해 현미경 제어 모니터 및 SE 모드에 ETD 검출기를 선택 합니다. 8로 가속 전압을 설정 케빈, 0.47 나 고 7 m m 단계 5.1.2에서에서 설명한 WD 전류.
- 복잡 하 게 확대 200000 X와 함께 각 구멍에 AlOOH 입자 확대는 " 확대 " MUI 보드에 손잡이.
참고: 전자 빔 더 지역화 된 원소 정보를 제공 하기 위해 같은 자리에 초점을 유지. AlOOH의 이미지 그림 1a에 제공 됩니다. - 오픈 관련된 EDAX 소프트웨어.
참고: 관련된 소프트웨어 다른 악기에 따라 달라질 수 있습니다 ' 구성. - 클릭 " 새로운 스펙트럼을 녹음을 시작 " 사용자 인터페이스 (UI)를 수집 EDX 스펙트럼에서에서. 선택 " 피크 ID " 스펙트럼의 가능한 요소를 선택 하. 입력 관찰된 요소, 예를 들어,이 경우에, 산소에는 " 요소의 " 필드. 클릭 " 추가 " 스펙트럼에 요소를 적용 하.
- 클릭 " 파일 "을 클릭 하 고 "으로 저장 ". 추가 플롯 그래프 소프트웨어를 사용 하 여 원하는 파일 이름을 사용 하 여 스펙트럼 데이터 in.csv 형식으로 저장.
- 단계 5.3.3-5.3.6 각 구멍에서 EDX 스펙트럼을 기록 하는 작업을 반복.
- 클릭 하 여 전자 빔 해제를 마친 후 이미징 및 스펙트럼 구멍의 각각에 대 한 기록, " 빔에 "에 단추는 " 빔 제어 " 이미징 영역 전자 빔에 때 페이지. 클릭 하 여 sem의 챔버 환기 " 환기 " 동일한 페이지에. 조심 스럽게 챔버 문 오픈 후 모든 테이프를 제거 하 여 무대에서 샘플을 걸릴.
- 빈 아닌 디 물 사용 하 여 제어 실험을 수행 하는 절차를 반복.
6. EDX 스펙트럼 플롯
- 그래프 소프트웨어에 파일 가져오기 the.csv 스펙트럼.
- 플롯으로 x 축과 강도 에너지 레벨을 사용 하 여 스펙트럼을 받았고 그림 2a , 2b, 2 c 에서처럼 복원된 스펙트럼 표시를 y 축으로는 EDX에 의해 처리.
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Representative Results
대표 결과 입자 몇 군데는 어떻게 보여 제시는 제자리에서 액체 현미경 이미징 EDX와 결합을 사용 하 여 분석 하 고. 결과 SE 이미지와 EDX 스펙트럼을 포함. SE 이미지 100000 X 및 그림 1에서 200000 X 확대 수준에서 얻은 했다. 그림 1a 는 AlOOH의 SE 이미지 묘사 그림 1b 디 물, 그리고 그림 1 c 는 빈 채널에 구멍. 이미지를 적용 하 여 얻은 했다 8 SE 케빈 가속 전압 및 0.47 나 빔 전류. 활용 하는 화면 해상도 1024 × 884 30 µs. 스캔 속도와 대응 하 게, 그림 2 는 물 (그림 2a), 디 물 샘플 (그림 2b)와 빈 채널 (에서 구멍에 AlOOH 입자에서 감지 EDX 스펙트럼 그림 2 c) 측정된 원소 구성에 따라. EDX 스펙트럼 같은 현재와 전압으로 SE 이미지에 대 한 설정 사용 하 여 얻은 했다. 정보 깊이 낮은 전압의 선택 샘플 표면에 얕은 지역에서 이다. 원소 스펙트럼의 원시 데이터 출력된 as.csv 파일 이며, 프레 젠 테이 션을 위한 그래픽 소프트웨어를 사용 하 여 플롯 합니다.
그림 1: SE 이미지. 이러한 이미지를 적용 하 여 얻은 했다 8 SE 케빈 가속 전압 및 0.47 나 빔 전류. 활용 하는 화면 해상도 1024 × 884 30 µs. (1a) AlOOH, 200에서의 스캔 속도와 X, (1b) 디 물 100, 000 000 X (1 c)와 빈 채널 200, 000 X. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: EDX 스펙트럼. EDX 스펙트럼 8 SE 모드에서 취득 되었다 kV 가속 전압 및 0.47 나 빔 전류. (2a) 물에서 AlOOH 스펙트럼. (2b) 스펙트럼의 디 물 샘플. (c)는 빈 채널에 구멍의 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Sem의 높은 해상도1나노 (nm) 수준에 유기 및 무기 재료의 표면 특성에는 강력한 기술입니다. 예, 그것은 널리 지질 자료26 , 반도체27등 단단하고 건조 샘플을 분석 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 그것은 전자 현미경1에 필요한 높은 청소기 환경 내에서 액체의 비 호환성으로 인해 젖은 액체 샘플을 특성화에 제한이 있다. 종종 SEM 시료 준비 탈수 또는 소 표본에 대 한 그리고 특히 생물 표본2동결을 요구 한다. 결과적으로, 그것은 자연스럽 게 수 화 또는 액체 샘플의 정보를 정확 하 게 잡으려고 도전 그들의 본질적인 정보 샘플 준비 과정28,29동안 손실 될 수 있습니다. 이 포함 될 수 있습니다 하지만 셀, 솔루션, 복잡 한 액체, 및 전기 화학 반응에서 입자의 나노 입자의 합성 생물학 활동에 국한 되지 않습니다. 이미지의 해상도 ESEM 수 제어 증기 환경에서 수 화 된 샘플 이미지를, 비록 높은 진공 모드30,,3132 에서 고체 시료의 SEM 이미지 높이 도달 하지 못했습니다. , 33. 최근, 젖은 샘플 전자 투명 박막6 에 의해 보호 되었다 또는 때 SEM을 고용 했다와 backscattered 전자는이 접근을 사용 하 여 이미지에 대 한 수집 된 표본 캡슐30 에 의해 봉인.
SALVI는 가장 및 ToF 심즈 같은 진공 기반 인스트루먼트를 사용 하 여 액체의 표면 분석 활성화 다양 한 미세 인터페이스입니다. 11 , 12 , 13 , 14 SALVI 사용 하 고 최적화 sem의 조건 우리의 기술에서 SE 이미지와 EDX 구성 정보를 제공할 수 있습니다. 그림 1a 선물 boehmite 입자의 SE 이미지 디에서 물 미크론 규모 (400 nm) 및 200, 000의 높은 확대. SEM 이미지 액체, 액체에서 입자 볼 하 고 표면 장력20죄 막 내에서 안전 하 게 개최 수 확인 형태학과 boehmite 입자의 분포를 보여 줍니다. 반면, 그림 1b 100000 × 확대 수준에서 구멍 내의 디 물의 SE 이미지를 묘사. 물을 직접 증거가 외부 유출 없이 그것의 표면 장력에 의해 보류 될 수 있습니다 제공 합니다. 또한, 챔버 압력 유지 되었다 일정 1.0 × 10-5 Torr에서 측정 하는 동안. 그림 1 c 선물 빈 채널에 구멍 200000 × 확대; 아무것도 같은 현재 및 전압 설정에서 구멍 안에 관찰 된다. 이 방법을 통해 SE 액체 이미징 기능 SE 이미지를 보고 젖은 SEM 기술30을 사용 하 여 인수 backscattered 전자 이미지의 마이크로미터 해상도에 비해 높은 해상도 제공 합니다.
EDX 원소 매핑 각각 디 물, 디 물만, 빈 채널에 AlOOH 입자를 사용 하 여 수행 됩니다. 마지막 두 참조 컨트롤로 사용 됩니다. 알루미늄 최대 약 1.5에서 발생 하는 그림 2a같이 중요 한 신호, 아니 눈에 띄는 피크 디 물과 빈 채널 EDX 스펙트럼에서 동일한 에너지에 나타나는 동안 케빈. 산소 신호는 AlOOH와 디 물이이 신호 물에서 오는 것 확인에서 지배적 이다. 이 추가 입자 이미징 동안 물에 몰입 하는 확인 합니다. 그림 2a, 2b, 2 c C와 Si 봉우리 검색 창과 검색 영역을 각각 형성 하는 죄 막에 탄소 코팅에서 있습니다. N 피크 죄 막에서 이기도합니다. EDX 비교 boehmite 입자는 실제로 관찰 된 나타내는 물에서 AlOOH의 알루미늄 성분의 검출을 보여줍니다.
이전 서류에 우리 디 물과 면역 글로불린 G (IgG) 골드 나노 입자12,20를 사용 하 여 미세 세포 및 높은 진공 SEM 이미지 및 액체 샘플의 특성 사용의 타당성을 증명 하고있다. 이 이전 작품에서 금 나노 입자는 10 보다 작은 nm. 이 작품에서는, 우리는 그 boehmite 보여줍니다 훨씬 더 큰 크기를 가진 입자 (< 100 nm) 또한 액체 SEM. 통해 공부 될 수 있다 구멍 크기는 충분 한 이미징 영역 아직 충분 한 표면 장력 내에서 액체를 보장 하기 위해 계산 되었다. 원래, 구멍 갈륨 이온 빔 초기 발명12,20장치 조립 전에 직경 2 µ m의 둥근 apertures를 사용 하 여 날조 되었다. 이 업데이트에서 우리 표시 장치는 조립 후 탐지 apertures를 만들 수 있습니다 전체 과정을 더 효율적. 한 분석, 필요에 따라 많은 검색 창을 열 수도 있습니다 실험 전에 구멍에 의해 제한 되지 않는다. 2 µ m 직경 검색 창을 ToF-심즈, 같은 기술에 적합 되며 그것은 또한 액체 SEM.에서 가능 SEM의 높은 확대 기능 때문에 새로운 결과 작은 조리개를 보여줍니다 (예를 들어, 1 2 µ m) SEM을 (그림 1a)에서 잘 작동.
몇 가지 기술적인 세부 사항에서 에서 수 있도록 원래의 액체 SEM 측정 성공 언급 가치가 있다. 첫째, 장치 측정 하는 동안 충전을 줄이기 위해 탄소 또는 골드 코팅 될 필요가 있다. 둘째, 장치 장착이이 절차에서 매우 중요 하다. 장착 무대 장치의 느슨한 접촉 중요 한 충전, 초점, 그리고 가난한 이미지에 어려움이 발생 합니다. 셋째, 하나 같은 장치를 사용 하 여 하나 이상의 샘플을 분석 하 고 싶다면, 샘플 시퀀스 생각 몇 가지 필요 합니다. 장치 일회용 이지만, 그것은 가능성이 장치를 한 번 이상 사용할 수 있습니다. 예를 들어 한 입자와 같은 용 매를 사용 하 여 관심의 다른 종 샘플의 분석 이어서 컨트롤 샘플의 데이터를 얻기 위해 물 또는 용 매를 사용할 수 있습니다. 후 SALVI 장치 보안 및 탐지 구멍 SEM/거짓말을 사용 하 여 만든 샘플 소개를 소개 하는 것이 좋습니다. 검색 창 막에 구멍을 밀링 전적으로 사용 됩니다. 막 다른 악기에 의해 준비 하거나 막 만들 경우 구멍으로 사용할 수 있는 공급 업체에서 거짓말을 사용 하 여 SEM 분석 이전에 구멍을 만들 필요는 없습니다. 샘플 소개에 대 한 샘플 단계에서 장치를 이동 하 고 다시 그것을 다시 또한 장치와 샘플 단계 사이의 가난한 연결의 위험을 추가 하 고 다른 작업 거리에서 발생 하는 동안 시간을 많이 낭비. Sem의 연산자 수 있습니다 또한를 촛점을 채널을 찾을 수 있고 마이크로미터 크기 라운드 검색 창을 다시.
서브 마이크론 해상도 정확한 원소 정보 연구에서 전시, 우리는 높은 진공 모드 sem의 진공-호환 미세 셀 (즉, SALVI)의 통합 식별에 널리 이용 될 수 있다 그를 구상 하 고 자연스럽 게 다양 한 관찰 표본, 지질 표본, 생물 학적 샘플 및 액체에서 합성 접한 수 화 된. 기술 개선에액체 SEM 접근 이전 논의, 다른 크기의 서브 마이크론 입자의 큰 다양 한이 새로운 접근법을 사용 하 여 조사 수 있습니다 보여 줍니다. 궁극적으로, 현장에서 액체 SEM 높은 진공 SEM.를 사용 하 여 액체에서 표본을 연구에 더 많은 기회를 엽니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 감사 하는 평화로운 북 서 국립 연구소 (PNNL) 핵 과정 과학 이니셔티브 (NPSI)-지원에 대 한 실험실 지시 연구와 개발 (LDRD) 기금. 박사 Sayandev Chatterjee 합성된 boehmite 입자 제공. 경 음악 액세스 W. R. 윌 환경 분자 과학 실험실 (EMSL) 일반 사용자 제안을 통해 제공 되었다. EMSL은 사무실의 생물학과 환경 연구 (BER) PNNL에 주최 국가 과학적인 사용자 시설입니다. PNNL는 Battelle 계약 드 AC05 76RL01830 아래 DOE에 대 한에 운영 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Coater | Cressington | 208 Carbon | It is accompanied with thickness monitor MTM-10. |
| SEM | FEI | Quanta 3D FEG | It provides highly resolved scanning electron microscopy and elemental analysis. |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, vacuum compatible microfluidic cell that enables the characterization of the liquid sample using vacuu- based scientific instrument. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | The polyether ether ketone union is used for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 mL |
| Pipette Tip 1 | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µL |
| Pipette Tip 2 | Rainin | 17001865 | 20 µL |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | It is used to inject the liquid sample into the SALVI device. |
| pH meter | Fisher Scientific/accumet | 13-636-AP72 | It is used for measuring the pH of AlOOH in DI water. |
| Barnstead Ultrapure Water System, UV/UF | Thermo Scientific Barnstead | Nanopure diamond D11931 | It is used for producing DI water. |
| Centrifuge tubes | Fisher scientific/Falcon | 15-527-90 | 15 mL |
| Bransonic ultrasonic cleaner | Sigma-Aldrich | 2510 | It is used to ultrasonicate the AlOOH liquid sample. |
| Balance | Mettler Toledo | 11106015 | XS64 |
| AlOOH | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | It is synthesized by scientists at Pacific Northwest National Laboratory. |
| xT microscope Control | FEI | Quanta 3D FEG | Default microscope control software of SEM Quanta 3D FEG |
| EDAX Genesis software | EDAX | N/A | The software is used for collecting the EDX elemental information of the samples. |
| Teflon tubing | SUPELCO | 58697-U | It is used for introducing the sample into the microchannel and holding adequate volume of liquid. |
References
- Goldstein, J., et al. Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis: A Text for Biologists, Materials Scientists, and Geologists. , 2nd ed, (1992).
- Donald, A. M. The use of environmental scanning electron microscopy for imaging wet and insulating materials. Nat Mater. 2 (8), 511-516 (2003).
- Rossi, M. P., et al. Environmental Scanning Electron Microscopy Study of Water in Carbon Nanopipes. Nano Lett. 4 (5), 989-993 (2004).
- Nune, S. K., et al. Anomalous water expulsion from carbon-based rods at high humidity. Nat Nano. 11 (9), 791-797 (2016).
- Soumya, E. A., et al. Scanning Electron Microscopy (SEM) and Environmental SEM: Suitable Tools for Study of Adhesion Stage and Biofilm Formation. , (2012).
- Thiberge, S. Y., Nechushtan, A., Sprinzak, D., Moses, E. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (10), 3346-3351 (2004).
- Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (10), 3346-3351 (2004).
- Thiberge, S., Zik, O., Moses, E. An apparatus for imaging liquids, cells, and other wet samples in the scanning electron microscopy. Rev Sci Instrum. 75 (7), 2280-2289 (2004).
- QuantomiX WETSEM®. , Available from: http://www.wetsem.com/ (2017).
- Wet Cell Kit. , Available from: http://www.2spi.com/catalog/instruments/silicon-nitride-wet-cell-kits-use-instructions.html (2017).
- Yu, X. -Y., et al. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. USA patent. , 8,555,710 (2011).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Ding, Y., et al. In situ Molecular Imaging of the Biofilm and Its Matrix. Anal Chem. 88 (22), 11244-11252 (2016).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Hua, X., et al. Chemical imaging of molecular changes in a hydrated single cell by dynamic secondary ion mass spectrometry and super-resolution microscopy. Integr Biol. 8 (5), 635-644 (2016).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of a hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Yu, J., et al. Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging. Chem Commun. 52 (73), 10952-10955 (2016).
- Yang, L., et al. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J Vac Sci Technol, A. 29 (6), (2011).
- Yang, L., et al. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- SPI Supplies Inc. , Available from: http://www.2spi.com/ (2017).
- Wet Cell II Liquid Probe System for SEM/EDS, EPMA and TOF-SIMS. , Available from: http://www.2spi.com/item/12130-ab/ (2017).
- Yao, J., et al. Switchable 1,8-diazabicycloundec-7-ene and 1-hexanol ionic liquid analyzed by liquid ToF-SIMS. Surf Sci Spectra. 23 (1), 9-28 (2016).
- Yu, J., et al. Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging. Chem Commun. 52 (73), 10952-10955 (2016).
- Clark, S. B., Buchanan, M., Wilmarth, B. Basic Research Needs for Environmental Management. , Department of Energy. (2016).
- Mills, O. P., Rose, W. I. Shape and surface area measurements using scanning electron microscope stereo-pair images of volcanic ash particles. Geosphere. 6, 805-811 (2010).
- Li, S., Jiang, F., Yin, Q., Jin, Y. Scanning electron acoustic microscopy of semiconductor materials. Solid State Commun. 99 (11), 853-857 (1996).
- Dohnalkova, A. C., et al. Imaging Hydrated Microbial Extracellular Polymers: Comparative Analysis by Electron Microscopy. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1254-1262 (2011).
- Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Barshack, I., et al. A Novel Method for "Wet" SEM. Ultrastruct Pathol. 28 (1), 29-31 (2004).
- Cameron, R. E., Donald, A. M. Minizing sample evaporation in the Environmental Scanning Microscope. J Microsc. (Oxford, U. K.). 173 (3), 227-237 (1994).
- Danilatos, G. D. REVIEW AND OUTLINE OF ENVIRONMENTAL SEM AT PRESENT. J Microsc (Oxford, U.K.). 162 (3), 391-402 (1991).
- Stokes, D. J. Recent advances in electron imaging, image interpretation and applications: environmental scanning electron microscopy. Philos Trans R Soc, A. 361 (1813), 2771-2787 (2003).
