Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56061
Automatic Translation
1, 1, 1
1Sensors and Electron Devices Directorate, US Army Research Laboratory

Summary

Biopanning bakteriell display bibliotek är en beprövad teknik för upptäckt av peptid affinitet reagenser, en robust alternativ till antikroppar. Halvautomatisk sorteringsmetod häri har effektiviserat biopanning för att minska förekomsten av falska positiva. Här visar vi tankeprocess och metoder som tillämpas i utvärdera kandidater och minimera nedströms analys.

Abstract

Biopanning bakteriell display bibliotek är en beprövad teknik för peptid affinitet reagens upptäckt för erkännande av både biotiska och abiotiska mål. Peptid affinitet reagenser kan användas för liknande applikationer till antikroppar, inklusive avkänning och therapeutics, men är mer robust och kunna utföra i mer extrema miljöer. Viss anrikning av peptid fånga ombud till ett protein mål sevärdheter förstärks med halvautomatisk sorteringsmetoder som förbättra bindande och tvätta steg och därför minska förekomsten av falska positiva bindemedel. En halvautomatisk sorteringsmetod beskrivs häri för användning med en kommersiell automatiserade magnetiska-aktiverad cell sortering enhet med en oinskränkt bakteriell display sortering bibliotek uttrycker slumpmässiga 15-mer peptider. Med smärre ändringar, dessa metoder är utdragbar till andra automatiserade enheter, andra sortering bibliotek och andra organismer. Ett primärt mål i detta arbete är att ge en heltäckande metod och förklara den tankeprocess som tillämpas i analysera och minimera den resulterande poolen av kandidater. Dessa tekniker inkluderar analys av den-cell bindande med fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS), för att bedöma affinitet och specificitet under sortering och jämföra enskilda kandidater, och analysen av peptid sekvenser för att identifiera trender och konsensus-sekvenser för att förstå och potentiellt förbättra affinitet och specificitet för målet för intresse.

Introduction

Biopanning är en beprövad teknik för affinitet reagens upptäckt, med bakteriell visar biblioteken en bekväm källa för peptid affinitet reagens 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. Likaså att phage Visa 25,26 och jäst Visa 27,28, Peptiderna är utsatta på cellens yta och finns att binda till både biotiska och abiotiska mål, med dessa interaktioner driven av både peptid ryggraden och de unika egenskaperna hos den aminosyra sidokedjor 29. I motsats till phage display, bakterierna själva är självreproducerande och innehålla alla genetiska material krävs för visning utan eluering av bundna phage och återinfektion av celler. I motsats till jäst display är bakteriell display snabbare på grund av den snabba (cirka 20 min 30) fördubbling tid av Escherichia coli. De resulterande peptid affinitet Reagenserna kan produceras av celler för användning i en mängd avkänning plattformar 16,17,26 och har potential för användning som levande material när visas på-cell 2 , 31 , 32. jämfört med monoklonala antikroppar för erkännande av specifika mål, peptider är mycket mindre och mer flexibla, och peptid display bibliotek kan lätt manipuleras på DNA-nivå att undvika specifika aminosyror, såsom cystein 33 . Peptider utnyttjas alltmer för therapeutics 34,35,36 och andra tillämpningar där antikroppar vanligtvis skulle utnyttjas på grund av sin användarvänlighet upptäckten, reproducerbara syntetiska (off-cell ) produktionen och överlägsna underhåll av prestanda i extrema miljöer, som ger en funktionell reagens även efter exponering för hög temperatur eller långtidsförvaring utan kyl 37,38. Förmågan att övervinna kylkedjan för lagring av reagenser är av särskilt intresse för försvarsdepartementet, exempelvis som måste fungera i extrema miljöer. Termisk stabilitet var därför ett önskvärt inslag för affinitet reagenserna erkänner de valda målen ges som exempel i detta manuskript.

Nyligen, biopanning bakteriell display bibliotek har blivit ännu mer helt okomplicerade och driftssäkra med användning av halvautomatisk magnetiska-aktiverad cell sortering (Mac eller MCS) metoder 9,14,39. Dessa metoder har påvisats för biologiska mål med hjälp av flera liknande sortering plattformar med olika fördelar, inklusive en kommersiellt tillgängliga automatiserade magnetiska-aktiverad cell sortering (autoMACS eller autoMCS) instrument (se tabell över material) 1,14,15 och mer specialiserade enheter som inneslutar provet i en disponibel patronen 7,9 eller chip 39, en värdefull specifikation för användning med organismer eller toxiner som biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) eller högre7. Dessa semi automatiserade metoder skulle kunna utvidgas för att sortera för peptider kan binda till abiotiska material om material som är magnetiska eller har förmågan att vara belagd på en magnetisk pärla, och för användning med olika organismer (såsom anaeroba bakterier) om sortering och tillväxt villkorar är förändrad. Utöver sortering bakteriell display bibliotek, har kommersiella autoMCS instrumentet används här också använts delvis för de första stegen av upptäckten av mänskliga singel-kedjan antikroppsfragment visas på ytan av jäst, följt av ytterligare isolering använda fluorescerande aktiverad Cell sortering (FACS) 40. De främsta fördelarna till semi automation är minskade sortering tid och ansträngning och mer robust och reproducerbara eliminering av obundna celler från de magnetiska pärlorna under tvätta trappan, som leder till minskad falska positiva, färre krävs sortering rundor, och mindre komplicerade nedströms analys 9,14. När det gäller kommersiella autoMCS instrumentet, finns flera förinstallerade program som kan vara optimal för olika applikationer, såsom negativa försortering (utarmning), prioritera renhet, minimera slutliga provvolymen och öka eller minskar känsligheten för isolering av sällsynta celler 41.

Fokus för detta arbete är att demonstrera metoden för biopanning en bakteriell display bibliotek med hjälp av kommersiellt tillgängliga autoMCS instrumentet, och att förklara den tankeprocess som tillämpas i analysera och minimera den resulterande poolen av kandidater i för att underlätta förlängning till andra program. Visa biblioteket används här (se tabell material) 12,13 innehåller cirka 109- 1011 unika 15-mer peptider visas via en modifierad version av den bakteriella yttre membranprotein OmpX i en unconstrained naturen på cellytan, vilket förväntas vara representativa för den fria peptiden i lösning om framställts syntetiskt. Detta protein byggnadsställning innehåller dessutom en positiv kontroll P2X peptid på C-terminus för övervakning uttryck via bindning till YPet Mona. Dock bör ett köpta eller romanen bibliotek med lämplig mångfald och andra egenskaper som är nödvändiga för ansökan önskas fungerar på samma sätt med detta biopanning förfarande, även om vissa mindre ändringar kan krävas. En schematisk bild av detta biopanning protokoll illustreras i figur 1. Dessutom protokollet kunde anpassas till andra automatiserade magnetiska sortering plattformar och andra strategier för sortering. Manuell magnetiska sortering med bänkmonterade magnet har visats framgångsrikt, om än med mer komplicerade och tidskrävande nedströms analys som krävs beror på ökade falska positiva 14, och ändå ger ett alternativ till den autoMCS steg om inga automatiska magnetiska cell sortering enhet är tillgänglig.

Protocol

1. Biopanning bakteriell visas bibliotek använder autoMCS

Obs: Detta autoMCS-baserade sortering protokoll har varit tidigare beskrivna 14, och en mer grundlig ”utökat protokoll för nya användare” finns i de kompletterande material för detta manuskript för ytterligare detaljer, inklusive en förklaring av potential ändringar. Om en autoMCS-enhet är tillgänglig för sortering, se kompletterande protokollet från Sarkes et al. 2015 eftersom en manuell sortering protokollet beskrivs också i att arbeta 14. Protokollet autoMCS anpassats förutsatt här har varit ytterligare för att inkludera ytterligare negativa sortering steg för förbättrad specificitet 1,15. En schematisk bild av detta biopanning protokoll illustreras i figur 1.

  1. Negativa sortering för att ta bort bindemedel troligen korsreagerar med magnetiska pärlor
    1. Inokulera 500 mL Luria buljong Miller (LB) innehållande lämpligt antibiotikum med ca 1 x 1011celler av en skiftande bakteriell visar sortering bibliotek (se tabell material).
      Obs: Bakteriell display peptid biblioteket används här (se tabell material) innehåller cirka 109- 1011unika medlemmar 8,12 och odlas i LB innehållande 25 µg/mL kloramfenikol (LB Cm25). Återstoden av detta protokoll kommer att anta att det här biblioteket används.
    2. Inkubera vid 37 ° C under skakning på 225 RPM tills kulturen når en OD600 0,5 - 0,55. Inducera peptid uttryck med 0,04% w/v L-arabinos genom att späda ut en 4% lager 1: 100, skakar på 225 RPM för 45 min vid 37 ° C.
    3. Plats inducerad kultur på is. Centrifugera ungefär 2 x 1011 celler vid 6000 x g i 20 min vid 4 ° C. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1,5 mL PBS av försiktigt snurra.
      Obs: En OD600 1.0 ungefär lika med 1 x 109 celler/mL för E. coli.
      Obs: gör inte VORTEX som detta kan lysera celler; blandas för hand eller med kort skakar vid ≤ 225 RPM, 4° C.
    4. Överföra celler till mikrocentrifug rör och spinn på 6 000 x g för 5 min vid RT eller 4 ° C. Ta bort supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 0,5% bovint serumalbumin (BSA; PBS-B).
    5. Tvätta 300 µL av streptividin-belagda pärlor (ca 3 x 109 pärlor, se tabell material) i 1 mL PBS-B och Centrifugera i 5 min på ≥ 5, 000 x g (på RT). Placera röret i en bänk topp magnetiska partikel avgränsare. Ta försiktigt bort supernatanten, undvika pelleten.
    6. Återsuspendera pärlorna i cell plus PBS-B blandning beredd enligt ovan. Inkubera vid 4° C på en roterande plattform för 45 min. plats prover på is.
    7. Slå på autoMCS instrument för att initialisera systemet. Prime linjer med hjälp av tillverkarens springa och tvätta buffertar (se tabell material) genom att välja ”tvätta nu” längst ned på skärmen i menyn ”Separation”, sedan ”sköljning” och ”kör”.
    8. Prime systemet med PBS-B, använder PBS-B som både tvättbuffert och kör buffert i nästa steg. Välj menyn ”Separation” från det övre navigeringsfältet och välj ”tvätta nu”. Välj ”sköljning” och ”kör” för att prime systemet med färska PBS-B.
    9. Överföra cell och pärlan blandning från inkubation steg till en 15 mL koniska rör. Placera detta röret i provet slot, och Töm 15 mL koniska rör i positiva och negativa urval springor, en pre kylda (4 ° C) rack (se tabell material). Placera rack på instrumentet plattform.
    10. Tilldela en separation program för varje prov på sträckbänken (upp till 5 prover kan sorteras i en kör). Lägga till ett ”skölj” steg mellan varje prov och efter det sista provet. Välj ”kör” för att starta cellseparation. Välj ”OK” för att bekräfta att det finns tillräckligt buffert.
      Obs: Programmet ”Posselds” separation fungerar väl för sortering av negativa och positiva sortering rond 1 och ”Posseld” är att föredra för sortering rundor 2-4, men båda dessa program har använts med framgång för alla negativa och positiva sortering rundor 14 ,15 och andra program kan vara bättre för en viss tillämpning (beskrivs längre i diskussionen).
    11. När programmet är klar, ta bort racket och behålla den lämplig fraktionen. Här, för en negativ form, behålla negativa fraktioner (innehållande celler utan pärlor). Placera på is.
    12. Använd det negativa sortera bråket i sin helhet för att Inokulera 1L LB Cm25 med 0,2% w/v D-glukos. Växa över natten vid 37 ° C, skaka på 225 RPM.
    13. Innan du stänger av det autoMCS instrumentet, ändra springa och tvätta buffertar till tillverkarens springa och tvätta buffertar (se tabell material). Välj ”tvätta nu”, sedan ”sköljning” och ”kör”. När du är klar, vara säker där er 70% etanol i raden sanering, sedan trycka på ikonen ”power” i det övre högra hörnet av skärmen och välj ”Ja”.
    14. När avstängningen är klar (flaskorna blir lila), Stäng av maskinen.
    15. Nästa dag, använda den över nattliga kulturen för att göra frys bestånd med ca 1 x 1011celler per injektionsflaska i LB med 15% glycerol. Dessutom, eller alternativt använda denna kultur i nästa steg: ytterligare negativa sortering (avsnitt 1.2) eller den första omgången av positiva sortering (avsnitt 1.3).
  2. Negativa sortering för att ta bort bindemedel troligen korsreagerar med andra mål av intresse
    Anm.: Avsnitt 1.2 förs.cykeletapper om inga ytterligare negativa sortering behövs eller önskas. I så fall gå vidare till avsnitt 1.3. Kvarstående bindning till några oönskade mål kan bedömas genom FACS som i avsnitt 2: FACS analys av sortering rundor.
    1. För negativa sortering mot ett specifikt protein mål, till exempel ett liknande protein med potential att också binder till de upptäckta peptider 1,15, upprepa tillväxt och induktion steg 1.1.1 - 1.1.3, börjar med ett fryst lager streptividin-utarmat bibliotek från steg 1.1.15 eller övernattning kulturen från steg 1.1.12 (med OD600 uppskattning och Inokulera med 1 x 1011 celler).
    2. Överföra celler till mikrocentrifug rör och spinn på 6 000 x g för 5 min vid RT eller 4 ° C. Ta bort supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS som innehåller 600 nM biotinylerade korsa-reactive protein mål. Inkubera vid 4 ° C i 45 min på en roterande plattform.
      Obs: 600 nM är en föreslagna start koncentration, som kan ändras om en noterade nytta observeras. Biotinylation av protein mål kan uppnås och kvantifierade med reagens föreslog i tabellen av material.
    3. Under tiden, tvätta 100 µL av streptividin-belagda pärlor (ca 1 x 109 pärlor) i 1 mL PBS-B och Centrifugera under 5 minuter vid ≥ 5 000 x g (vid RT). Placera röret i en bänk topp magnetiska partikel avgränsare och noggrant ta bort supernatanten, undvika pelleten.
    4. Centrifugera mål-bundna cellerna vid 6000 x g för 5 min (RT eller 4° C), avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS-B. Återsuspendera pärlor i hela volymen av tvättade cellerna bundna till korsa-reactive protein mål. Inkubera vid 4° C på en roterande plattform för 30 min.
    5. Placera provet på is och slutför stegen 1.1.7 - 1.1.15 för en negativ form, att göra lämpliga frys bestånd. Fortsätt till avsnitt 1.3 för en positiv sortera om alla önskade negativa sortering har uppnåtts eller repetera avsnitt 1.2 till negativa form mot en annan potentiell korsa-reactive protein.
  3. Runda 1 positiv sortera
    Obs: Runda 1 positiv sortering mot ett specifikt protein mål är liknande till en negativ form mot ett specifikt sortering mål (se 1.2) förutom att den pärla-innehållande, positiva fraktionen behålls.
    1. Inokulera 500 mL LB Cm25 med ungefär 1 x 1011celler av en skiftande bakteriell Visa sortering bibliotek som har streptividin-utarmat och vuxit över natten (från steg 1.1.12) eller frysta (från steg 1.1.15) och upptinade på is, eller som har ytterligare utarmat pärmar till andra korsa-reactive protein mål (från steg 1.2.5), som önskat.
    2. Inkubera vid 37 ° C under skakning på 225 RPM tills kulturen når en OD600 0,5 - 0,55. Inducera peptid uttryck med 0,04% w/v L-arabinos genom att späda ut en 4% lager 1: 100, skakar på 225 RPM för 45 min vid 37 ° C.
    3. Plats inducerad kultur på is. Centrifugera ungefär 2 x 1011 celler vid 6000 x g i 20 min vid 4 ° C. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1,5 mL PBS av försiktigt snurra (för hand eller genom kort skakas vid ≤ 225 RPM, 4° C).
    4. Överföra celler till mikrocentrifug rör och spinn på 6 000 x g för 5 min vid RT eller 4 ° C. Ta bort supernatanten.
    5. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS som innehåller 600 nM biotinylerade protein mål av intresse. Inkubera vid 4 ° C i 45 min på en roterande plattform.
      Obs: 600 nM är en föreslagna start koncentration, som kan ändras om en noterade nytta observeras. Biotinylation av protein mål kan uppnås och kvantifierade med reagens föreslog i tabellen av material.
    6. Under tiden, tvätta 100 µL av streptividin-belagda pärlor (ca 1 x 109 pärlor) i 1 mL PBS-B och Centrifugera under 5 minuter vid ≥ 5 000 x g (vid RT). Placera röret i en bänk topp magnetiska partikel avgränsare och ta försiktigt bort supernatanten, undvika pelleten.
    7. När inkubation med målet är klar, Centrifugera mål-bundna cellerna vid 6000 x g för 5 min (RT eller 4° C) för att ta bort eventuella obundna målprotein. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS-B. Återsuspendera pärlor i hela volymen av tvättade celler bundet till protein mål. Inkubera vid 4° C på en roterande plattform för 30 min. plats på is.
    8. Slå på autoMCS instrument för att initialisera systemet. Prime linjer med hjälp av tillverkarens springa och tvätta buffertar (se tabell material) genom att välja ”tvätta nu” längst ned på skärmen i menyn Separation, och sedan ”sköljning” och ”kör”.
    9. Prime systemet med PBS-B, använder PBS-B som både tvättbuffert och kör buffert i nästa steg. Välj menyn Separation från det övre navigeringsfältet och välj tvätta nu. Välj skölj och kör till prime systemet med färska PBS-B.
    10. Överföra cell och pärla blandning från INKUBERINGSSTEGET ovan till en 15 mL koniska rör, sköljning röret med en ytterligare 500 µl av PBS-B och poolning tvätten med provet. Placera detta röret i provet slot, och Töm 15 mL koniska rör i positiva och negativa urval springor, en pre kylda (4 ° C) rack (se tabell material). Placera rack på instrumentet plattform.
    11. Tilldela en separation program för varje prov på sträckbänken (upp till 5 prover kan sorteras i en kör). Lägga till ett ”skölj” steg mellan varje prov och efter det sista provet. Välj ”kör” för att starta cellseparation. Välj ”OK” eller ”Fortsätt” för att bekräfta att det finns tillräckligt buffert.
      Obs: Programmet ”Posselds” separation fungerar väl för sortering av negativa och positiva sortering runda 1 och ”Posseld” är att föredra för sortering rundor 2-4, men båda dessa program har använts med framgång för alla negativa och positiva sortering rundor 14 , 15 och andra program kan vara bättre för en viss tillämpning (beskrivs längre i diskussionen).
    12. När programmet är klar, ta bort racket och behålla den lämplig fraktionen. Här, för en positiv sortera, behålla positiva bråktal (innehållande celler och pärlor). Placera på is.
    13. Innan du stänger av det autoMCS instrumentet, ändra springa och tvätta buffertar till tillverkarens springa och tvätta buffertar (se tabell material). Välj ”tvätta nu”, sedan ”sköljning” och ”kör”. När du är klar, vara säker där er 70% etanol i raden sanering, sedan trycka på ikonen ”power” i det övre högra hörnet av skärmen och välj ”Ja”.
    14. När avstängningen är klar (flaskorna blir lila), Stäng av maskinen.
    15. Använd det positiva sortera bråket i sin helhet för att Inokulera 1L LB Cm25 med 0,2% w/v D-glukos. Växa över natten vid 37 ° C, skaka på 225 RPM.
    16. Nästa dag, använda den över nattliga kulturen för att göra frys bestånd i LB som innehåller 15% glycerol eller fortsätta att positiva sortering rond 2 i avsnitt 1.4.
  4. Efterföljande positiva sortering rundor
    Obs: Vanligtvis fyra sortering rundor rekommenderas, även om tre sortering rundor är normalt tillräckligt 14,15. När slutar sortering biträds av beskrivs FACS analysen av sortering rundor i avsnitt 2. Koncentrationer av mål- och magnetiska pärla volym minska med varje efterföljande positiva sortering runda.
    1. Med hjälp av övernattning kultur från den föregående sortering rundan (eller en fryst cell lager från den omgången), Inokulera 5 mL LB Cm25 med 100 µl celler (1:50 utspädning). Inkubera vid 37° C under skakning på 225 RPM tills kulturen når en OD600 0,5 - 0,55.
    2. Inducera peptid uttryck med 0,04% w/v L-arabinos, skakar på 225 RPM för 45 min vid 37° C. Plats inducerad celler på is.
      Obs: Denna inducerad kultur kan också användas för att bedöma affinitet och specificitet för sortering rundan påbörjade det från, som beskrivs i avsnitt 2 nedan.
    3. Centrifugera 1 x 108 celler vid 6000 x g i 5 min på RT eller 4 ° C. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 50 µL PBS med halva koncentrationen av biotinylerade protein mål räntesats som används för den föregående omgången av sortering (därför 300 nM för rond 2, 150 nM för rond 3 och 75 nM för rond 4 från vår föreslagna utgångspunkt). Inkubera i 45 min på is (eller vid 4 ° C en roterande plattform).
    4. Under tiden, tvätta streptividin-belagda pärlor (15 µL för rond 2, 8 µL för omgången 3, och 4 µL för omgång 4) i 1 mL PBS-B och Centrifugera under 5 minuter vid ≥ 5 000 x g (vid RT). Placera röret i en bänk topp magnetiska partikel avgränsare och noggrant ta bort supernatanten, undvika pelleten. Återsuspendera pärlor i 50 µL PBS-B.
    5. Efter 45 min inkubering med målet i steg 1.4.3, Centrifugera cellerna vid 6000 x g i 5 min på RT eller 4° C, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i den 50 µL tvättas pärlor från 1.4.4. Förvara provet på is och slutför stegen 1.3.7 - 1.3.13 för en positiv form.
    6. Inokulera en 5 mL kultur LB Cm25 kompletteras med 0,2% w/v D-glukos med det hela positiva, pärla-innehållande bråket från sortera.
    7. Nästa dag, Använd övernattning kulturen att göra frys bestånd i LB som innehåller 15% glycerol och/eller fortsätta till nästa positiva sorteringen runda, återvänder till steg 1.4.1.
      Obs: Den inducerade kulturen från 1.4.2 för att bedöma affinitet och specificitet som beskrivs i avsnitt 2 nedan hjälp kan avgöra när du ska stoppa sortering. Om två sortering omgångar i rad Visa liknande affinitet, eller en senare omgång visar minskad affinitet för målet av intresse, detta en önskvärd plats för att stoppa sortering. Efter finalrundan, återgå till steg 1.4.1 men stanna på 1.4.2.

2. FACS analys av sortering rundor

  1. Använda de inducerade cellerna från steg 1.4.2 för varje sortering runda eller identiska kulturer, lägga 5 µL inducerad celler till 25 µL av varje av följande beredda lösningar för bindande bedömning (se även tabell material): PBS ensam; PBS med 150 nM YPet Mona (YPet 12,13, positiv kontroll för uttryck), om tillgänglig; 900 nM protein mål konjugerat med ett fluorescerande färgämne, såsom amine-reaktivt färgämne med utsläpp/excitation vid 493 nm⁄518 nm (Target-488); 900 nM korsa-reactive protein hanteringspaketobjekt används för negativa sortering märkt med den samma fluorescerande färgämnen (Cross-Reactive Protein-488); och 900 nM streptividin-R-fykoerytrin (SAPE). Inkubera i ice för 45 min.
    Obs: Om fortsätter direkt från steg 1.4.2, detta steg kommer att alltid göras dagen efter biopanning för den rundan avslutades eftersom down-valt biblioteket odlades över natten sedan subkultiveras och inducerad följande dag. Kulturer odlas och framkallas på liknande sätt från frysta sortering runda bestånd kan också användas; i så fall kan alla ronder vara testade och jämförde i en enda experiment.
  2. Centrifugera celler vid 6000 x g i 5 min på RT eller 4° C. Ta bort supernatanten och lagra prover på is.
    Obs: Cell pellets kan förvaras på is tills alla prover för analys.
  3. Slå på instrumentet FACS, öppna programvaran, uppstart systemet, och kalibrera instrumentet efter tillverkarens instruktioner 43,44.
  4. Inom FACS programvaran, klicka på ”administratör” och klicka på önskad mapp eller skapa en ”ny mapp”. Klicka på ”nya Experiment” ikonen längst upp till vänster på skärmen. Högerklicka på ikonen för att ”Byt namn” experiment. Inom det experimentet, klicka på ”globala kalkylblad”.
  5. Klicka på ikonen ”Dot Plot”, klicka på den globala kalkylblad kalkylbladet för att skapa denna spridningsdiagram. Dot tomt diagrammet själv, klicka på Välj den ”Inspector” ikonen längst upp till vänster på skärmen och justera axlarna till biexponentiell display genom att markera rutorna bredvid ”Y” och ”X-axeln” i det öppna fönstret. Stäng fönstret biexponentiell display genom att klicka på X.
  6. Skapa en ”ny tub” genom att klicka på ikonen längst upp till vänster på skärmen och Byt namn på preparatet med lämplig information genom att högerklicka på ikonen preparatet under ”globala kalkylblad” och välja ”Byt namn”. Expandera preparatet genom att klicka på (+) tecknet, då dubbel klick på ikonen tube, högerklicka på den och igen välj ”rename” för att beskriva provet.
  7. Använd denna dot tomt graf med standard SSC-A vs FSC-A att köra negativa kontrollprov i PBS ensam genom dubbel klickande på det röret eller välja på pilen bredvid den. Precis innan du kör provet, Omsuspendera cellpelleten i 500 µL is kallt FACS kör buffert och överför provet till en FACS tube (se tabell material), blanda väl genom pipettering och snärta röret. Placera de återsuspenderade cellerna på prov injektion röret (SIT) av instrumentet. Tryck på ”förvärva” med ”händelser till Display” på 30.000-50.000 och ”händelser till Record” på 10.000, dataflödet i låg takt (starta; öka om det behövs), och ”sitta spola” valt.
    Obs: Lämplig hastighet (låg, medel eller hög) är den hastighet som antalet händelser/s är ungefär mellan 200 och 2000.  Använd detta intervall för alla steg.
  8. Samtidigt förvärva, justera fotomultiplikatorn röret (PMT) spänning tröskel vid behov genom att välja fliken ”tröskelvärde” Klicka på och ändra ”värde”. Justera spänningen för framåt och side scatter (FSC och SSC) sådan att negativ kontroll celler i PBS ensam sjunka något nedanför mitten.
    Obs: Ytterligare parametrar (såsom SSC) kan läggas till i fliken ”tröskel” genom att använda ikonen ”Lägg till”. Typiskt, PMT spänningar på ca 700 V till 1000V för både SSC och FSC fungerar bra för E. coli.
  9. Om provet läser ordentligt, justera flödet för att Visa 200-2000 händelser/s och tryck på ”Spara Data”. När du är klar inspelning, ta bort röret från SIT och placera på is.  Välj ikonen ”Polygon Gate” och Använd musen för att rita en grind runt majoriteten av cell befolkningen i spridningsdiagram. Högerklicka på dot tomt och välj ”Visa befolkningen hierarki”.
  10. Använd denna ”P1” gate som förälder genom att klicka på ”P1” i hierarkin befolkningen. Skapa en ny dot tomt efter steg 2.5. Högerklicka på varje axel och ändra y-axeln till FITC-A och x-axeln till FSC-A. Utfärda utegångsförbud för den negativa kontrollen (PBS ensam) använda ikonen ”polygon gate”, med grinden så tätt som möjligt runt övre och vänstra sidan av befolkningen.
    Obs: dubbelkolla befolkningen hierarkin för att utfärda utegångsförbud för P1 är förälder till P2 grinden. Om det inte är, visas den i linje med P1 grinden och ”alla händelser” blir överordnat; ta bort porten och återskapa den efter steget 2.10.
  11. Välj ”P2” i hierarkin befolkningen, högerklicka och välj ”Invertera gate”. Högerklicka på dot tomten med P2 gate och välj ”Visa populationer”. Välj ”P2” och ”inte P2” för visning (mindre än 1% av befolkningen bör falla utanför porten).
  12. Högerklicka på dot tomten med P2 gate och välj ”Skapa statistik Visa”. Högerklicka på fönstret statistik Visa och välj ”Redigera statistik Visa”. Klicka på fliken ”befolkning” och lägga till eller ta bort populationer, som önskat, inklusive överordnade befolkningen, P1 (P2 och inte P2 bör redan vara visas). Klicka på fliken ”statistik” och Lägg till ”FITC-A Median” och någon annan statistik av intresse. Stäng fönstret genom att trycka på OK.
  13. Skapa en liknande dot tomt graf för PE-A vs FSC-A och gate använder PBS ensam prov (tidigare tomter kan dupliceras och ändras). Använd det här kalkylbladet för att köra alla prover (inklusive negativ kontroll cellerna inkuberas med varje fluorophore-märkt mål) på detta sätt, inspelning av cirka 10 000 händelser för varje.
    Obs: Cellerna som faller utanför porten efter inkubation med proteinet Target-488, positiva kontrollen, etc. är bindemedel till att protein, och värdet från ”inte PX” (där X är antalet gated befolkningen för att grafen) bokföras som % bundna YPet. När du använder SAPE som en negativ kontroll, Använd PE-A vs FSC-A tomten. Median fluorescensintensiteten (MFI) P1 bör också registreras som detta ger information utöver % bindande, att Visa omfattningen av bindande i relativa termer, och är mer robust i närvaro av extremvärden 45. Median fluorescensintensitet kan vara normaliserade (nMFI) genom att dividera MFI av varje peptid av MFI en byggnadsställning endast negativ kontroll (med ingen N-terminala peptid), eller en klon som innehåller en peptid-sekvens som inte binder målet av intresse, efter inkubation konjugerad till samma fluorophore 14med samma mål. Om dessa negativa kontrollen celler är tillgängliga kan uninduced cellerna inkuberas med samma mål och märkt med samma fluorophore också användas för normalisering.

3. sekvens analys av potentiella kandidater och bedömning av bindande samhörighet

  1. Peptid sekvensen bestämning
    1. Välj och sekvens tiotals eller hundratals bakteriekolonier från den sista rundan av biopanning (vanligtvis rundor 3 eller 4 är tillräckligt 14).
    2. Analysera sekvensen data med filen makro som vi har utvecklat (se stödinformationen för kod, ”Sub eCPX_Sequencing”) på särskilt analysera de sekvenser som genereras från biopanning 15mer bakteriell display biblioteket som anges i tabellen i material. Använd programmet kalkylblad som visas i tabellen av material eller annan kompatibel programvara.
      Obs: Ett antal verktyg finns tillgängliga online som kan också stöd i DNA sekvensen analys 47. Om program, använda en annan etablerad metod för sekvensanalys och hoppar till steg 3.1.3.
      1. Ladda ner uppsättningen sekvens filer (.seq filer, textdokument fungerar också) och extrahera dem till en ny mapp. Vid behov, flytta eller kopiera mappen till datorns hårddisk (i motsats till en nätverksmapp) för förbättrad hastighet.
      2. Öppna ett nytt kalkylblad fönster. Se till att aktivera makron och aktivera alla funktioner, om dessa meddelanden dyker upp.
        Obs: Steg 3-6 nedan bör endast måste slutföras första gången makrot används. För efterföljande analys, helt enkelt ”köra the makro” börjar på steg 7.
      3. Kopiera hela innehållet i makrot finns i filen ”Sub eCPX_Sequencing”.
        Obs: Den aktuella versionen är inställd med flankerande sekvenser för 15-mer biblioteket som visas i tabellen av material och kommer att översätta aminosyrorna mellan dem. Ytterligare sekvenser kan tas emot genom att kopiera 5' flankerande sekvenser i kolumn A och 3' flankerande sekvenser i kolumn B i kalkylbladet, upp till 10 sekvenser för varje, innan du kör makrot.
      4. I tomt kalkylbladsfilen, Välj fliken ”Visa”, sedan dubbelklicka på ”makron”. Välj mappen personal.xlb. Om detta inte är tillgänglig, spela in ett makro för att göra detta visas.
      5. Klicka på ”Skapa” eller ”step in”, beroende på vad som kan lyftas. Klistra in hela makro i modulen.
      6. Klicka på Spara-ikonen eller gå till filen, Spara. Avsluta modulen. Om ett fönster dyker upp, tryck på OK.
      7. Kör makrot: gå till mappen där filerna desired.seq finns. Klicka på baren bredvid ikonen för mappen överst för att visa mappens plats. Kopiera den.
      8. Gå till fönstret nya kalkylblad. Välj fliken visning, dubbel klicka sedan på makron. Välj ”eCPX_Sequencing” från listan och klicka på ”Kör”.
      9. I rutan som dyker upp, klistra in filens plats kopierade i steg 7 och tryck enter. Makrot ska börja gå igenom sekvenserna och organisera dem i tabeller i olika blad.
      10. Använda ”Sammanfattning tabell” plåt för att avgöra om det blir nödvändigt att kontrollera spårningsfiler för fel och göra korrigeringar manuellt (om sekvenser innehåller ”X” eller kunde inte översättas).
        Anmärkning: Tabellen ”Sammanfattning” visar den översatta peptid sekvenser, sorterade efter aminosyrasekvens (från A till Z), såvida inte en sekvensering fel förhindrade översättning. Ett ”X” betecknar en enskild aminosyra som inte kunde fastställas.
    3. När sekvenserna är översatt, organiserad, och sekvensering fel korrigeras, kontrollera listan sorterad peptid sekvens på bladet ”Sammanfattning bord” för någon upprepande sekvenser.
    4. Växa över natten kulturer för sekvenserade kolonier av intresse (inklusive den repetitioner eller peptider med märkbara trender till ett minimum) i 5 mL LB Cm25 vid 37 ° C, skaka på 225 RPM, och spara frys lager nästa dag i LB som innehåller 15% glycerol, som i steg 1.4.7. testa peptiderna med repeterade sekvenser för bindande affinitet och specificitet med hjälp av FACS metoder beskrivs i avsnitt 3.3 och använda FASTA format sekvenslistan (fullständig förteckning och upprepar endast) för att justera de sekvenser med rekommenderad justering och analysprogram, som i avsnitt 3.2.
  2. Sequence Alignment med Clustal Omega, Kalign och liknande program
    1. Kopiera sekvenser i FASTA format från FASTA kalkylbladet på makrot eller annars skapa en lista över FASTA filer från sekvenserna anpassas (exempelvis från steg 3.1.3).
      Obs: Kolumn A innehåller de FASTA filerna i nummerordning av ”Seq #” medan kolumn B visar dem sorterade efter ”AA sequence” från bladet ”Sammanfattning bord”. I listan över peptid sekvenser sorterade efter aminosyrasekvens visas oanvändbara sekvenser på toppen, som tom vektor (som ”# Tom”) och dessa sekvenser där varken hittades 5' eller 3' sökvillkoren (som ”# värde”). Denna funktion möjliggör enkel uppdatering eller borttagning av dessa sekvenser från analysen.
    2. Öppna Clustal Omega48 eller Kalign49 programvara genom att gå till webbplats 50,51, eller använda andra Rekommenderad programvara för sekvens justering. Kopiera och klistra in listan FASTA sekvens och mata in det i rutan under ”sekvenser i alla format som stöds”. Ändra ”lucka öppen straff” till 30 under ”fler alternativ” i Kalign (detta inte är möjligt i Clustal Omega), men annars hålla standardinställningarna innan du klickar på ”Skicka”.
    3. Analysera sekvens justering med Jalview 52,53 programvara direkt inom Clustal Omega och Kalign online-programvara genom att välja fliken ”resultatet Sammanfattning” ovanför anpassning och sedan klicka på ikonen ”Jalview”.
      Obs: om program, eller för analys av sekvens linjeföring genereras av alternativa program, Ladda ner 54 programvaran separat och kopiera och klistra in justeringen i fönstret analys, som öppnas genom att klicka på ”Arkiv”, ”Input anpassning”, och ” från lärobok ”. Detta ger en möjlighet att enkelt avgöra om det finns en konsensus-sekvens i inmatningssekvensen justeringen.
  3. Jämföra affinitet och specificitet med FACS
    1. Inokulera 5 mL LB Cm25 kompletteras med 0,2% w/v D-glukos med varje enskild isolatet av intresse (från steg 3.1.4 och/eller kolonier av intresse från ytterligare sekvens analysen i avsnitt 3.2, etc.) och en lämplig negative control (display byggnadsställning endast eller en peptid som inte binder målet, som beskrivs i not för steg 2.13). Växa över natten vid 37 ° C, skaka på 225 RPM.
    2. Använda de över natten kulturerna för att Inokulera 3 mL LB Cm25 med 60 µl celler (1:50 utspädning). Inkubera vid 37° C under skakning på 225 RPM tills kulturen når en OD600 0,5 - 0,55. Inducera peptid uttryck med 0,04% w/v L-arabinos plus 2 mM EDTA (för underlättande av peptid displayen 42), skakar på 225 RPM för 45 min vid 37 ° C.
    3. Plats inducerad kulturer på is. För varje isolat, tillsätt 5 µL celler på 25 µL PBS ensam eller PBS som innehåller: 150 nM YPet 12,13 (positiv kontroll för uttryck), om tillgänglig; 250 nM Target-488; 250 nM korsa-reactive proteinernas-488; och 250 nM SAPE (se 2.1 för mer detaljer). Inkubera i ice för 45 min.
    4. Centrifugera celler vid 6000 x g i 5 min på RT eller 4° C. Ta försiktigt bort supernatanten genom att dra vätska från motsatt sida av pelleten. Lagra cell pellets på is tills alla prover och är redo för analys.
    5. Återsuspendera varje cellpelleten i 500 µL is kallt FACS kör buffert, blanda väl genom pipettering och snärta röret, strax före behandlingen med hjälp av en flödescytometer (se tabell material).
      Obs: Se steg 2.13 noterar för ytterligare förklaring av gating och beräkning av nMFI för att jämföra affinitet och specificitet. Icke-bindemedel eller icke-specifik bindemedel kan nu tas bort från vidare analys, och de högsta affinitet bindemedel bör utvärderas av sekvens justering följande avsnitt 3.2 att leta efter ytterligare trender som kan ha missats vid den första sekvenserade befolkningen. Avsnitt 3.2 och 3.3 kan upprepas efter behov som nya trender och samförstånd sekvenser noteras. Denna analys kan innehålla mer slumpmässiga sekvenser om trender inte ses.

Representative Results

Med användning av automatiserad magnetiska-aktiverad cell sortering (autoMCS) snarare än manuell magnetiska cell sortering, reduceras betydligt falska negativa kandidater vid biopanning av bakteriell display bibliotek 9,14. Negativa sortering steg kan också vara läggas som behövs för att minska icke-specifik bindemedel till målet för intresse, och det föreslås ett minimum för att lägga till ett negativt slag mot den magnetiska pärlor själva på framsidan. Detta negativa urval mot de magnetiska pärlorna själva slutfördes innan fyra rundor av biopanning vald bakteriell Visa bibliotek för skyddande antigen (PA) bindemedel, som visas i figur 2, och innan ytterligare negativa urval mot rivax och fyra rundor av positiva urval för abrax, som visas i figur 3. Pärlorna används här är konjugerat till streptividin för fångst av biotinylerade proteiner, så att oavsiktlig isolering av peptider som binder till streptividin själv är ett bekymmer och kontrolleras med hjälp av FACS med streptividin-konjugerat till fykoerytrin (figur 3 , SAPE). På ett minimum, ska bindning till streptividin testas för några lovande enskilda kandidater vid bedömningen av bindning till målproteinet. Både procent bindande och nMFI för SAPE bör låga värden i alla sortering ronder. Bindning till streptividin kan öka något med varje sortering runda, som inträffade i figur 3, eftersom befolkningen upprepade gånger exponeras för streptividin-belagda magnetiska pärlor efter varje sortering runda. Om nivån på bakgrunden streptividin bindande blir problematiskt att nedströms analys, kunde ytterligare negativa sortering mot de magnetiska pärlorna utföras efter positiva sortering rundan där streptividin bindande befolkningen ökade i för att minska nedströms screening av falska positiva. När proteiner eller material är tillgängliga som specifikt kan störa efterföljande användning av peptiden för ett visst program, eller som förväntas korsreagerar med affinitet reagenser för målet på grund av strukturella eller sekvens likheten, ytterligare negativa sortering mot som protein eller material rekommenderas. Ett exempel är negativa sortering mot rivax före isolering av abrax bindande peptider, på grund av den strukturella likheten och sekvenshomologi dessa två proteiner 1,15. Igen, korsa-reactive bindande proteiner används för negativa sortering steg kan övervakas under analysen av sortering rundor med FACS (figur 3Rivax-488). I bästa fall är procent bindande och nMFI låga, som i detta exempel.

När de är tillgängliga, kan en fast positiv kontrollpeptid, såsom P2X peptiden på C-terminus av uppvisning ställningen produceras av bakteriell display biblioteket används i representativa resultat här, hjälpa till att avgöra om brist på bindande samhörighet i FACS-analysen är på grund av bristande uttryck för displayen schavotten själv, snarare än brist på affinitet till peptide(s) för målet. I figur 2 och figur 3, YPet Mona bindande till denna P2X peptid övervakas och visar att de första omgångarna av sortering uttrycker ställningen dåligt. Detta är sannolikt huvudsakligen på grund av den höga frekvensen av stop kodon i N-terminala peptider i slumpmässiga biblioteket, vilket innebär att ställningen själv inte producerades. Andra effekter kan dessutom bidra, till exempel förekomsten av peptider med oväntade toxiska effekter till den E. coli, eller minskad tillväxt eller peptid display priser av andra skäl (t ex mutationer i det bakteriella genomet). Tillägg av EDTA under induktion kan förbättra uttryck under dessa första omgångarna av sortering 42, men har ännu inte testats. Bindning till YPet Mona i varje biopanning förbättras befolkningen avsevärt av rond 3. Jämför figur 2 och figur 3, är det också uppenbart att uttrycket nivå kan förbättras genom att öka induktionstiden till 90 min (som i figur 2YPet Mona) snarare än 45 min (som i figur 3YPet Mona), även om 45 min är vanligtvis tillräckligt. Observera att nMFI för YPet Mona är normaliserat till YPet Mona bindande nivå av negativa kontrollen cellerna, så värdena nära 1.0 är typiska om uttrycket nivå är acceptabel. Normalisera YPet Mona MFI till PBS enbart MFI från samma prov är också ett giltigt sätt att jämföra relativ uttrycksnivåerna, men ger mycket högre värden (jämför figur 2 och figur 3 med resultat från Sarkes et al. 2015 15).

Anrikning av biblioteket för peptider bindning till specifika mål för intresse uppnås vanligtvis inom tre positiva sortering rundor, men fortsätter att en fjärde omgång sortering kan vara fördelaktigt, som visas i figur 2 och figur 3 . Här procent bundna celler och nMFI fortsätter att öka från rond 3 att runda 4 för både exempel mål, PA och abrax, som är förpackade i rött i figur 2 och figur 3, respektive. Den högsta affinity peptid sekvenser kan redan finnas i rond 3 men sannolikt att ytterligare berika i rond 4 också, vilket underlättar down-urval av potentiella kandidater 14. Analys av sekvenser från rond 4 tenderar att avslöja upprepande sekvenser, och dessa upprepande sekvenser är en utmärkt utgångspunkt för affinitet och specificitet analys och samförstånd sekvensen bestämning. Makrot eCPX_Sequencing tillhandahålls som ett komplement till detta manuskript hjälper till att effektivisera denna första analys, som visas i figur 4. Början med en mapp i .seq eller textfiler, DNA-sekvensen som ligger mellan valda 5' och 3' sekvenser är översatt, anordnas av aminosyrasekvens och analyseras för antal enskilda aminosyra rester i varje peptid. Den sorterade listan av isolerade peptid sekvenser, kan som visas på skärmbilden Sammanfattning tabell blad i figur 4, användas för att enkelt avgöra vilka sekvenser upprepas och vid vilken frekvens. Cellerna i kalkylbladet som innehåller upprepande sekvenser beskrivs i olika färger för enklare analys. Det rekommenderas att kontrollera dessa upprepande sekvenser för samförstånd sekvenser och andra trender. Detta underlättas av sekvens justering programvara såsom Kalign och Clustal Omega och analys kan utföras på hela sekvensen utdata (inklusive både upprepande och icke-repeterade sekvenser den frekvens som de dök upp) och down-markerat listan över upprepande sekvenser (med eller utan deras relativa frekvens). Representativa resultat för PA och abrax upprepande sekvenser, utan att ta frekvens hänsyn visas i figur 5A och 5B, respektive. Observera att i figur 5A PA målet, flera av de enskilda upprepande sekvenserna själva innehåller sekvensen samförstånd WFCFTC (eller en liknande sekvens), understruken med rött, vilken fastställdes genom att tillämpa Jalview programvara analys en Kalign sekvens anpassningen av upprepande sekvenser. Detta samförstånd, fastställdes som WXCFTC, tidigare vara PA bindande konsensus, vilket ger förtroende i sortering metod 9. I figur 5B, där upprepande sekvenser för målet abrax analyserades på samma sätt, blev resultatet helt annorlunda. Först fanns det bara fem sekvenser som upprepas i rond 4 av biopanning för abrax pärmar, i motsats till de femton upprepande sekvenser som isolerats från rond 4 av biopanning PA pärmar (även om 44% fler kolonier var också sekvenserade för PA). För det andra, ingen av de fem upprepande sekvenserna innehöll mest lovande ”konsensus” sekvensen (FWAWF, underströk i lila), även om kandidaten AX-A15 innehöll den sekvens som bäst matchade (FWDTWF). Ytterligare analys, inklusive bindande affinitet och specificitet beslutsamhet, bidragit till att ge konsensus av FWDTWF fastställs utifrån de översta fem kandidaterna till abrax bindning i figur 5 c, som förklaras nedan.

En representativ koloni från varje upprepande sekvens kan analyseras ytterligare för på-cell affinitet och specificitet med FACS, som i figur 6A för upprepande sekvenser från biopanning för abrax bindande peptider. Här är det tydligt att alla fem upprepande sekvenser har högre affinitet för abrax, det avsedda målet, rivax, strukturellt likartade proteinet används för negativa sortering eller streptividin, som är närvarande under Sortera på grund av de magnetiska pärlor används för biopanning. Detta är förenligt med de redan lovande resultat för affinitet och specificitet av sortering rundor visas i figur 3, där det framgår att berikning för bindning till det avsedda målet, abrax, ökar med varje runda av biopanning medan affinitet för liknande protein, rivax, är inte. Dock en tillfredsställande samförstånd sekvens var inte beslutsamt för abrax sortera med hjälp av upprepande sekvenser från rond 4 ensam (figur 5B och ovan diskussion). Återvänder till 100 sekvenserade kolonierna från rond 4, dock noterades av ögat när söker efter sekvenser liknar den bästa matchningen för den förutspådda konsensus att en ytterligare kandidat, AX-A12, innehöll FWDTWF sekvensen som noterades i isolera AX-A15 , och att en annan kandidat, AX-A14, innehöll en liknande sekvens, DWNTWF. Dessa och andra sekvenser som antingen innehöll likheter med den upprepande sekvenser, visat likheter med andra icke upprepande sekvenser, eller valdes slumpmässigt, analyserades av FACS för bindande affinitet och specificitet. De testade rangordnas i Sarkes et al. 2016 1 och de översta 5 pärmar från denna analys visas i figur 6B, med konsensus sekvens bedöms vara FWDTWF, visas i figur 5 c.

En liknande analys av bindande affinitet för upprepande peptid sekvenser i runda 4 i biopanning för peptider som känner igen PA målet visade att de bästa bindemedel, som rankas av förhållandet mellan PA-488 nMFI:SAPE nMFI, innehöll samförståndet som WXCFTC eller liknande sekvens (tabell 1). Använder detta förhållande, sekvenser självorganiserade in dem som innehöll samförståndet och dem som inte gjorde. Toppkandidater, alla innehållande sekvenser besläktade med konsensus, analyserades på samma sätt till de metoder som beskrivs ovan för abrax i figur 6, som presenteras i Sarkes et al. 2015 14. Dessa resultat visar att för vissa mål, analys av peptider med repeterade sekvenser kan vara tillräcklig att få pärmar med betydande affinitet och specificitet för ett valt mål, och att fastställa en konsensus-sekvens som får i sig tillräckligt för bindning. Observera dock att antalet repetitioner inte nödvändigtvis återspeglar det relativa affinitet för målet av intresse (tabell 1). När analys av upprepande sekvenser ensam inte är tillräckliga för att fastställa ett mönster, är det bra att växla mellan sekvensanalys och bindande att begränsa poolen av kandidater och omvärdera trenderna bland dessa kandidater med högre affinitet . Även när en trend observeras från att analysera de upprepande sekvenserna ensam, kan ytterligare icke upprepande sekvenser visar samma trender eller andra trender, vid vidare utredning.

Figure 1
Figur 1: Schematisk av biopanning protokoll för bakteriell display bibliotek. Enligt illustrationen, biopanning bakteriell display bibliotek är en cyklisk process. Varje cell i bakteriell display bibliotek innehåller (se tabell material) plasmid-DNA som behålls så länge cellerna odlas i närvaro av antibiotika som plasmiden innehåller en motstånd gen (choloramphenicol i detta fall). Varje plasmid kodar också proteinet display byggnadsställning som exponerar en slumpmässig peptid på utsidan av cellen. Eftersom varje cell bör bara innehålla en enda plasmid DNA-sekvens, bör varje cell endast visa en enda peptid, på flera platser i cellmembranet. Beroende på graden av bibliotek mångfald i början av biopanning och efter varje sortering runda, DNA-sekvensen får eller får inte unika från cell till cell. Biopanning börjar med tillväxt och induktion av cell biblioteket att visa enskilda peptider på deras yttre membran. Dessa peptider kan sedan interagera med ett målprotein (som är biotinylerade eller annars taggad för capture). För magnetiska-aktiverad cell sortering (MCS), obundna protein avlägsnas och cellerna inkuberas med magnetiska pärlor som är belagda med ett capture protein (streptividin i detta exempel, som har en stark växelverkan med biotin). Hela kulturen utsätts sedan för en magnet att separera bundna celler från obundna celler. Använda en automatiserad magnetiska sortering enhet är att föredra för cellseparation att minska falska positiva. Illustrationen är en positiv form, där de celler som är bundna till och samtidig eluera med magnetiska pärlor behålls. För en negativ sorterar, som vi utför vanligtvis på framsidan, är processen samma förutom att cellerna som tvättas bort av de magnetiska pärlorna behålls i stället. Bibliotek fraktionen av intresse, bunden (positiv sortera) eller obundna (negativa sortering), vuxit över natten och används i nästa omgång av sortering. Varje efterföljande omgång av positiva biopanning kräver en minskning av koncentrationen och pärla målvolymen att förbättra stringens. Efter varje omgång av biopanning bedöms affinitet och specificitet av peptiderna för protein mål med hjälp av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) för att avgöra när du ska sluta biopanning och börja undersöka enskilda kandidater. Som behövs, utförs DNA-sekvensering och peptid sekvens analysen. Dessa analys steg kanske i sig en cyklisk process, särskilt för att avslöja trender i de enskilda isolaten efter den sista omgången av biopanning. Vid denna punkt, är peptid sekvens trender eller samförstånd korrelerade med bindande affinitet och specificitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: exempeldata för FACS analys av sortering rundor: PA mål. Bindande samhörighet som bestäms av FACS visas efter 4 omgångar av biopanning (positiv sortera) den valda bakteriella Visa bibliotek för peptider bindande målet, skyddande antigen (PA). Detta utfördes efter först utföra en negativ form mot streptividin-belagda magnetiska pärlor. För bindande bedömning, förmåddes celler med 0,4% L-arabinos för 90 min före inkubation med mål och kontroll lösningar och analysera av FACS. Bindande affinitet analys för det avsedda målet är förpackade i rött. Här visas spridningsdiagram av FITC-A vs FSC-A och värden för procent celler bunden (jämfört med gated negativa kontrollen inkuberas med PBS ensam) och normaliserade median fluorescensintensiteten (nMFI, jämfört med peptid-fri negativ kontroll inkuberas med samma fluorophore-märkt protein) induceras celler som inkuberades i 45 min med: PBS buffert ensam, 150 nM YPet Mona (positiv kontroll för peptid uttryck) eller 250 nM PA-488 (märkt mål). Observera den ökande anrikningen i bindande affinitet för målet av intresse efter varje omgång av biopanning. I motsats till figur 3slutfördes alla autoMCS cell separationer med hjälp av programmet Posselds. En del av dessa data kan också visualiseras i spridningsdiagram av FITC-H vs FSC-H i Sarkes et al. 2015 14 för jämförelse till den FITC-A vs FSC-A tomter visas här. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: exempeldata för FACS analys av sortering rundor: abrax target. På samma sätt som figur 2, visas här är jämförande affinitet för en komplett biopanning experiment, som bestäms av FACS. Bakteriella display biblioteket utsattes för negativa sortering mot streptividin-belagda magnetiska pärlor, som i figur 2, men var sedan genomgå en ytterligare omgång negativa sortering mot en homolog protein med liknande struktur och funktion, rivax, innan du utför 4 rundor av positiv biopanning för peptider bindning till det avsedda målet, abrax. För bindande bedömning, förmåddes celler med 0,4% L-arabinos för 45 min innan bindande mål, positiva och negativa kontroller och läsning på FACS. Bindande affinitet för det avsedda målet är förpackade i rött. Här visas spridningsdiagram av FITC-A vs FSC-A (eller PE-A vs FSC-A när det gäller SAPE) och värden för procent celler bunden (jämfört med gated negativa kontrollen inkuberas med PBS ensam) och nMFI av inducerad celler som inkuberades i 45 min med : PBS buffert ensam, 150 nM YPet Mona (positiv kontroll för peptid uttryck), 250 nM Abrax-488 (märkt protein mål), 250 nM Rivax-488 (märkt potentiellt korsa-reactive protein mål) eller 250 nM SAPE (negativ kontroll för direkta bindning till streptividin-belagda magnetiska pärlor). Observera den ökande anrikningen i affinitet för målet för intresse, abrax, efter varje omgång av biopanning, och minimal affinitet för strukturellt likartade protein, rivax. Till skillnad från figur 2, positiva biopanning omgång 1 utfördes med hjälp av autoMCS Posselds program medan efterföljande sortering rundor slutfördes med hjälp av programmet Posseld, som föreslagits för biopanning i detta manuskript. Denna data kan också visualiseras i spridningsdiagram av FITC-H vs FSC-H i Sarkes et al. 2016 15 för jämförelse till den FITC-A vs FSC-A tomter visas här. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: exempel sekvensanalys utgång med ”eCPX_Sequencing” makro. Visas är en skärmdump av 48 sekvenserade kolonier från rond 4 av biopanning valt bakteriell display biblioteket PA pärmar med metoden Posselds. Bladet ”Sammanfattning tabell” visas här. Observera att kolonierna var numrerade i alfabetisk ordning efter deras givna filnamn under sekvenseringsprocessen och att rutorna kring sekvenser som upprepas minst en gång markeras med olika färger för enklare dataanalys. Makrot eCPX_Sequencing tillhandahålls som en tilläggskod fil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: sekvens justering och samförstånd bestämning för två distinkta protein mål. Alla bilder som visas här genererades med Jalview programvara med Clustal_X färg efter att anpassa sekvenser med Kalign online analys programvara 51. (A) anpassning av upprepande sekvenser från PA biopanning rond 4 (motsvarar tabell 1). (B) justering av upprepande sekvenser från abrax biopanning rond 4 (motsvarar figur 6A). (C) justering av topp 5 kandidater från abrax biopanning rond 4, som bestäms av FACS analys av enskilda kandidater (motsvarar figur 6B). Den röda linjen betonar samförstånd sekvensen i A och C, medan den lila linjen i B understryker föregångaren till sekvensen samförstånd fastställas för abrax bindande vid prövningen av upprepande sekvenser endast belysa potentialen måste testa affinitet använda FACS innan ett samförstånd kan bestämmas i vissa fall. Liknande anpassningar genereras med olika analysprogram kan ses i Sarkes et al. 2015 14 och Sarkes et al. 2016 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: exempel affinitet och specificitet för enskilda kandidater analyseras med FACS. Här visas normaliserade median fluorescensintensiteten (nMFI) fastställs med hjälp av FACS för A) upprepande sekvenser och B) de översta 5 kandidaterna, som bestäms av jämförande affinitet för målet, abrax, från runda 4 i biopanning. Data representerar genomsnittet (staplar) och standardavvikelsen (felstaplar) av tre oberoende replikera experiment. Observera att alla kandidater visas är ganska specifik för abrax (abrax-488, gröna staplar) över ett strukturellt likartade protein, rivax (Rivax-488, röda staplar), och den negativa kontrollen för streptividin (SAPE, svarta fält). Även om två av de upprepande sekvenserna i en (AX-07 och AX-15) var också bland de topp 5 kandidaterna i B, kanske jämförelse av resultat i A och B visar att analys av upprepande sekvenser ensam inte är tillräckligt att isolera de högsta affinity peptiderna. Data som visas här var anpassad från Sarkes et al. 2016 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Table 1
Tabell 1: förhållandet mellan specifik bindning till icke-specifik bindning för enskilda upprepa kandidater. I det här exemplet visas antalet upprepade sekvenser och förhållandet mellan PA (target) nMFI till SAPE (negativ kontroll) nMFI för upprepande kandidat sekvenser från PA biopanning rond 4. Dessa data var sorterade efter relativ PA nMFI:SAPE nMFI proportion och analyseras för förekomst av det kända WXCFTC samförståndet, eller en liknande sekvens, som visas i fetstil och understruken. Märke att sekvenserna själv ordna så att dessa kandidater med konsensus har den högsta PA nMFI:SAPE nMFI förhållandet, och därför samverka mer specifikt med målet. De resultat som visas är från ett enda FACS-experiment. Peptider med lägsta affinitet för målet uteslöts från ytterligare replikat och analys som publicerades i Sarkes et al. 2015 14.

Suppplemental fil 1: Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Suppplemental fil 2: Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Biopanning bakteriell display bibliotek har varit en framgångsrik strategi för isolering av affinitet reagenser och peptider erbjuder ett användbart alternativ till antikroppar för erkännande när specifika kriterier krävs, såsom stabilitet i extrema miljöer. Biopanning av dessa bibliotek har effektiviserats med hjälp av autoMCS metoder som beskrivs här, och en kommersiellt tillgängliga autoMCS plattform sträcker sig denna teknik till en mycket bredare publik. I jämförelse med traditionella alternerande MCS/FACS sorteringsmetoder för bakteriella Visa bibliotek, autoMCS metoder är billigare eftersom de inte kräver investeringar i ett dyrare FACS instrument klarar av sortering och isolera de bundna cellerna, snarare än typ av flödescytometer som används här, som endast kan hantera analys 14. De kritiska steg för lyckad biopanning av autoMCS inkluderar separation programval, negativa sortering mot potentiella cross-reaktanterna att minska falsklarm, övervakning bibliotek berikning med FACS för att avgöra när du ska sluta biopanning, och Smart analys av kandidat poolen för att undvika besvärliga screening av hundratals kandidater.

De exempel som beskrivs häri visar framgångsrika biopanning av den valda bakteriell display biblioteken för två separata mål, PA och abrax, men med något annorlunda analys strategier på grund av skillnader i peptid sekvenser för varje pool av kandidater efter fyra rundor av biopanning. PA var enklare fallet med sekvensanalys visar tydliga trender från peptid sekvenser som upprepas minst en gång i 144 kolonier. Detta var ensam nog att bestämma en konsensus sekvens för PA mål, och dessa kolonier som innehöll samförståndet eller en liknande sekvens var de bästa kandidaterna när det gäller förhållandet mellan bindning till PA kontra bindning till den negativa kontrollen streptividin. Dock kan detta inte alltid fallet. För abrax mål, sekvensering 100 kolonier ledde till fem upprepande sekvenser men trenden i dessa sekvenser var mindre klart, än en tendens att innehålla aromatisk aminosyra rester och asparaginsyra eller asparagin. Förutspådd ”konsensus” från den upprepande sekvenser endast kunde har tillverkats och testats för affinitet till abrax, men eftersom ingen förälder sekvenser innehöll den exakta samförstånd sekvensen, Vi återvände till listan över sekvenserade kolonier och observerade att andra kandidater som hade mer trender gemensamt med varandra. I själva verket innehöll två kolonierna en liknande sekvens till ”konsensus” från de upprepar enbart (FWDTWF istället för FWAWF), som hade samma trend av tryptofan, fenylalanin och asparaginsyra rester men med olika avstånd. En av dessa peptider var en upprepande sekvens, en var inte. Dessa två sekvenser, tillsammans med en tredje sekvens som innehåller en liknande variant, var bland de topp 5 pärmar testade när det gäller affinitet för abrax. Den översta bindaren övergripande, AX-A05, visas också liknande trender. Resultaten för abrax visar att en strategi som växlar flera gånger mellan sekvensanalys och affinitet och specificitet ibland kommer att krävas, beroende på det valda målet. Resultaten för abrax mål visar också nivån på specificitet som kan uppnås över ett mycket liknande protein (rivax 1,15).

AutoMCS program som valts för våra studier var Posselds och Posseld, som båda för positiva urval av märkt målceller med låg frekvens, mindre än 5% av den ursprungliga befolkningen. I båda fallen passera cellerna genom två magnetiska kolumner. När det gäller Posselds programmet, dock passera celler långsammare den första kolumnen att öka exponeringen tid 41. Utöver de programbeskrivningar som ges av tillverkaren av kommersiella autoMCS enheten (se Material tabell) 41, dessa program valdes efter en första jämförelse av flera potentiella program. Respektive programs förmåga att undvika att dra ut falska positiva från en homogen kultur av negativ kontroll celler, och att framgångsrikt isolera en känd binder till ett mål av intresse från en blandad kultur som innehåller negativa kontrollen celler spetsade med en minskande procentandel av kända bindemedlet, jämfördes. Om avsevärt avviker från de program som beskrivs här, kunde en liknande jämförelse vara bra i programval för det nya programmet. Dock tidigare publicerade resultat jämföra dessa två program (Posseld och Posselds) för isolering av peptid affinitet reagenser för PA visade att använda någon av dessa program för alla fyra rundor av biopanning ledde till isolering av peptider med liknande affinitet och specificitet för PA och bestämning av WXCFTC konsensus. Den största skillnaden var att Posseld, med dess snabbare flöde, sorterade snabbare och bindande affinitet för målet var därför högre efter bara två rundor av biopanning, medan använder Posselds ledde till mer unika sekvenser efter fyra rundor av biopanning 14. lära av detta, strategin har ändrats något när biopanning för abrax bindande peptider att införliva både fördelar: Posselds användes för rond 1 för att ge mer exponeringstid under detta kritiska steg där mångfalden är som störst, men sedan den programmet var bytte till Posseld för snabbare isolering av de högsta affinitet bindemedel under omgångar 2-4 1,15. Detta tycktes vara idealisk för abrax, särskilt sedan den nMFI och procent bindande var både högre för abrax sortering rond 4 jämfört med PA sortering rond 4 med antingen program (figur 2 och figur 3 och Sarkes et al. 2015 ( 14), men en direkt jämförelse med en strategi jämfört med andra med samma mål skulle krävas för en mer övertygande jämförelse. Vilket program är bäst för ett visst program kan bero på den individuella mål, sortering biblioteket som används och nivån på peptid uttryck som uppnås med ändringar i de villkor som beskrivs här.

Inte diskuteras här är potentiella resultat från biopanning med abiotiska material, men vi har också använt samma bakterie display bibliotek för biopanning mot bulk aluminium 2. Denna studie utfördes inte använder autoMCS, men liknande studier kunde åstadkommas med autoMCS om materialet finns på, eller kunde vara belagd på eller konjugerat till, en magnetisk pärla. I den bulk aluminium studien var enskilda aminosyra analys och sekundärt strukturera modellering till hjälp för att förstå vad körde affinitet av de isolerade peptiderna, eftersom ingen konsensus sekvens var beslutsamma 2. Även med biologiska mål, kan det krävas att förstå vad som driver det affinitet för vissa mål, varför på kalkylbladet som genereras från ”eCPX_Sequencing” makro finns en flik med individuella frekvensanalys. Om ingen upprepande sekvenser ses förutom avsaknaden av samförstånd, och rester frekvens visar inget mönster, men kan andra typer av analys krävas. Dessutom kan det vara nödvändigt att undvika screening ett mycket större antal kandidater för down-urval av dem med tillräcklig affinitet till det önskade målet ytterligare sortering rundor.

Med den ökande tillgången till nästa generations sekvensering, kunde en mer grundlig undersökning utföras att bestämma de mest lovande kandidaterna innan testning affinitet och att fastställa omfattningen av anrikning efter varje omgång av biopanning. Dock kan sekvenser som går vidare till bindande analys steg behöva återskapas genom kloning, om de inte är av tillräckligt hög frekvens för att enkelt isolera med rutinmässiga kolonin sekvensering av tiotals eller hundratals kolonier. Som denna teknik framsteg, blir billigare och mer rutin, och särskilt med en option för kolonin isolering, kommer det sannolikt vara det bästa sättet att analysera biopanning data. Det kan leda till förtydligandet av vägen enskilda sekvenser och hela biblioteket, utvecklas. Dessutom kan kan bakterierna i sortering biblioteket mutera över tiden, vilket kunde bias sortering mot celler med snabbare tillväxt eller bakterier som överuttrycka genomisk proteiner kan binda ett material även utan display byggnadsställning och peptid uttryck, för instans. Därför, när lovande kandidater dyker upp, är det värt att isolera plasmiden DNA, retransforming färsk E. coli, och bekräftar peptid bindande via FACS. Om du planerar att använda peptiden i en cell-fria format, bedömas också affinitet för fri peptiden. Till exempel producerades peptid affinitet reagenser upptäckte genom bakteriell display för målet SEB syntetiskt off-cell och analyseras av mer traditionella metoder såsom enzymkopplad immunosorbant assay (ELISA), och på-cell (via FACS) och off-cell (via ELISA) affinitet jämfördes med hjälp av Kds bestäms av både metoder 7.

Även om styrkan av biotin-streptividin samverkan gör det en perfekt strategi för avskiljning av protein mål och bundna peptider, kan proceduren ändras för andra fånga strategier. Direkt koppling av protein till magnetiska pärlor, till exempel epoxi och karboxylsyra pärlor, har varit framgångsrik och tar bort ett bindande steg. Direkt fastsättning kan dock hindra potentiella bindningsställen på en specifik eller icke-specifik sätt, beroende på bifogad fil strategi. En ytterligare fördel med streptividin pärlor är att mindre stabil protein mål kan vara färska biotinylerade i 30 min eller lagras frysta, om det behövs, medan pärlorna själva tenderar att kräva längre inkubation med proteinet för cross-linking och är allmänhet lagras vid 2-8° C. Den föreslagna starta koncentrationen av biotinylerade protein rikta här, 600 nM, har varit framgångsrika för flera mål, men det kan vara möjligt att isolera peptid fånga reagenser med ökad affinitet om denna koncentration minskar. Dessutom kan denna metod utvidgas till och ändras för andra bakteriella display bibliotek och andra organismer. Dessa åtgärder kan exempelvis utföras i frånvaro av syre för användning med anaerober eller i andra miljöer för användning med extremophiles att isolera peptider med unika egenskaper. Peptider och/eller konsensus fastställs för ett visst mål sevärdheter kan potentiellt användas på-cell som en levande material eller syntetiskt producerade off-cellen. Syntetiskt producerade peptider kan vara ytterligare mognat för utveckling av ännu högre affinitet och mer robust Protein katalyseras fånga (PCC) ombud för användning i sensorer eller för andra applikationer där antikroppar vanligtvis skulle användas för bindning eller erkännande 38,55. Molekylär modellering kan också användas för att fastställa bindande läge av peptiden med sitt mål, som utfördes nyligen för abrax bindande peptider och samförstånd som anges i figur 5 c 1. Sammantaget biopanning bakteriell display bibliotek för peptid affinitet reagenser är ett snabbt, enkelt och kraftfullt alternativ till produktionen av antikroppar för erkännande och detektion av protein mål, och detta halvautomatisk biopanning strategi har producerat pålitliga resultat med långtgående program.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja

Acknowledgments

Författarna vill erkänna stöd av US Army Research Laboratory (ARL) postdoc Fellowship-programmet, administreras av Oak Ridge associerade universiteten genom ett kontrakt med ARL, genom utnämningen av Dr Justin P. Jahnke. Resterande finansiering tillhandahölls av sensorer och Electron enheter direktoratet på ARL. Författarna vill även tacka Daugherty labbet på UCSB för att dela den bakteriella display bibliotek och information för kloning YPet Mona reagens, Dr Bryn Adams för stöd i kloning YPet Mona reagens på ARL, Dr Joshua Kogot för hans inledande arbete på och utbildning i biopanning av bakteriell display bibliotek, Alena, lugna Edgewood kemiska och biologiska Center för att dela plasmider som används för att uttrycka och rena abrax och rivax proteiner, Brandi Dorsey för teknisk support för isolering av PA bindande peptider, Qin Guo för teknisk support av preliminära experiment för isolering av abrax bindande peptider och Dr Jessica Terrell för bra diskussioner kring detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545 Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB) Fisher Scientific BP1426-500 Growth medium
Chloramphenicol Fisher BioReagents BP904-100 Antibiotic
Agar Fisher Scientific BP2641-500 Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library Cytomx Therapeutics N/A; http://cytomx.com/contact/ On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose Sigma A3256-500G Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) Amresco 0780-10L Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh Thermo Scientific PI21327 Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific PI28005 Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads Invitrogen 65601 Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9647-100G Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose Sigma G8270-1KG Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona UCSB and ARL N/A Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester Thermo Scientific 46403 For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) Thermo Scientific S866 Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow Becton, Dickinson, and Company 342003 Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns Miltenyi Biotech 130-021-101 For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer Miltenyi Biotech 130-091-221 For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution Miltenyi Biotech 130-092-987 For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol VWR E505-4L Decontamination of autoMACS
Glycerol Sigma G6279-1L For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack Miltenyi Biotec 130-092-952 For MACS Separation
BD FACSCanto II Becton, Dickinson, and Company 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software Becton, Dickinson, and Company 659523 For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator Thermo Scientific A13346 Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing Genewiz N/A; https://www.genewiz.com/ DNA and Colony Sequencing Services
Excel Microsoft 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA) List Biological Laboratories, Inc. 171 Target protein used as example for representative results.
Abrax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sarkes, D. A., Hurley, M. M., Stratis-Cullum, D. N. Unraveling the Roots of Selectivity of Peptide Affinity Reagents for Structurally Similar Ribosomal Inactivating Protein Derivatives. Molecules. 21 (11), 1504 (2016).
  2. Adams, B. L., Finch, A. S., Hurley, M. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N. Genetically Engineered Peptides for Inorganics: Study of an Unconstrained Bacterial Display Technology and Bulk Aluminum Alloy. Adv. Mater. 25 (33), 4585-4591 (2013).
  3. Bessette, P. H., Rice, J. J., Daugherty, P. S. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Des. Sel. 17 (10), 731-739 (2004).
  4. Daugherty, P. S. Protein engineering with bacterial display. Curr. Opin. Struct. Biol. 17 (4), 474-480 (2007).
  5. Getz, J. A., Schoep, T. D., Daugherty, P. S. Peptide Discovery Using Bacterial Display and Flow Cytometry. Methods Enzymol. 503, 75 (2012).
  6. Kenrick, S. A., Daugherty, P. S. Bacterial display enables efficient and quantitative peptide affinity maturation. Protein Eng. Des. Sel. 23, 9-17 (2010).
  7. Kogot, J. M., et al. Screening and characterization of anti-SEB peptides using a bacterial display library and microfluidic magnetic sorting. J. Mol. Recognit. 27 (12), 739-745 (2014).
  8. Kogot, J. M., Pennington, J. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N., Pellegrino, P. M. Population Enrichment and Isolation with Magnetic Sorting, DTIC Document No. ARL-TN-0452. Report No. ARL-TN-0452. , US Army Research Laboratory, Sensors and Electron Devices Directorate. Adelphi, MD. (2011).
  9. Kogot, J. M. Screening of peptide libraries against protective antigen of Bacillus anthracis in a disposable microfluidic cartridge. PLOS ONE. 6 (11), e26925 (2011).
  10. Little, L. E., Dane, K. Y., Daugherty, P. S., Healy, K. E., Schaffer, D. V. Exploiting bacterial peptide display technology to engineer biomaterials for neural stem cell culture. Biomaterials. 32 (6), 1484-1494 (2011).
  11. Pennington, J. M., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Pellegrino, P. M., Stratis-Cullum, D. N. Isolation and characterization of anti-SEB peptides using magnetic sorting and bacterial peptide display library technology. SPIE Defense, Security, and Sensing. 83581Z-1-83581Z-6 International Society for Optics and Photonics. , (2012).
  12. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Eng. Des. Sel. 21 (7), 435-442 (2008).
  13. Rice, J. J., Schohn, A., Bessette, P. H., Boulware, K. T., Daugherty, P. S. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Sci. 15 (4), 825-836 (2006).
  14. Sarkes, D. A., Dorsey, B. L., Finch, A. S., Stratis-Cullum, D. N. Method for Discovery of Peptide Reagents Using a Commercial Magnetic Separation Platform and Bacterial Cell Surface Display Technology. J. Anal. Bioanal. Tech. 6 (4), 1 (2015).
  15. Sarkes, D. A. Rapid discovery of peptide capture candidates with demonstrated specificity for structurally similar toxins. SPIE Commercial+ Scientific Sensing and Imaging. 986305-1-986305-10 International Society for Optics and Photonics. , (2016).
  16. Stratis-Cullum, D., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Val-Addo, I., Pellegrino, P. M. Chapter 30, Bacterial display peptides for use in biosensing applications. On Biomimetics. Pramatarova, L. , InTech. 629-642 (2011).
  17. Stratis-Cullum, D. N., Finch, A. S. Current Trends in Ubiquitous Biosensing. J. Anal. Bioanal. Tech. S7 (009), (2013).
  18. Rockberg, J., Löfblom, J., Hjelm, B., Uhlén, M., Ståhl, S. Epitope mapping of antibodies using bacterial surface display. Nature Methods. 5 (12), 1039-1045 (2008).
  19. Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L., Georgiou, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10444-10448 (1993).
  20. Georgiou, G. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15 (1), 29-34 (1997).
  21. Löfblom, J., Wernérus, H., Ståhl, S. Fine affinity discrimination by normalized fluorescence activated cell sorting in staphylococcal surface display. FEMS Microbiol. Lett. 248 (2), 189-198 (2005).
  22. Kjærgaard, K., Sørensen, J. K., Schembri, M. A., Klemm, P. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl. Environ. Microbiol. 66 (1), 10-14 (2000).
  23. Kishimoto, J., Fukuma, Y., Mizuno, A., Nemoto, T. K. Identification of the pentapeptide constituting a dominant epitope common to all eukaryotic heat shock protein 90 molecular chaperones. Cell stress & chaperones. 10 (4), 296-311 (2005).
  24. Westerlund-Wikström, B. Peptide display on bacterial flagella: principles and applications. International journal of medical microbiology. 290 (3), 223-230 (2000).
  25. Gaskin, D. J., Starck, K., Turner, N. A., Vulfson, E. N. Phage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification. Enzyme Microb. Technol. 28 (9), 766-772 (2001).
  26. Goldman, E. R. Phage-displayed peptides as biosensor reagents. J. Mol. Recognit. 13 (6), 382-387 (2000).
  27. Boder, E. T., Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15 (6), 553-557 (1997).
  28. Cherf, G. M., Cochran, J. R. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications. , 155-175 (2015).
  29. London, N., Movshovitz-Attias, D., Schueler-Furman, O. The structural basis of peptide-protein binding strategies. Structure. 18 (2), 188-199 (2010).
  30. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  31. Jahnke, J. P., Terrell, J. L., Smith, A. M., Cheng, X., Stratis-Cullum, D. N. Influences of Adhesion Variability on the "Living" Dynamics of Filamentous Bacteria in Microfluidic Channels. Molecules. 21 (8), 985 (2016).
  32. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature materials. 13 (5), 515-523 (2014).
  33. Löfblom, J., Frejd, F. Y., Ståhl, S. Non-immunoglobulin based protein scaffolds. Current opinion in biotechnology. 22 (6), 843-848 (2011).
  34. Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discov. Today. 9 (12), 525-529 (2004).
  35. Pini, A., Falciani, C., Bracci, L. Branched peptides as therapeutics. Current Protein and Peptide Science. 9 (5), 468-477 (2008).
  36. Gongora-Benitez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. Peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2013).
  37. Coppock, M. B., et al. Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays. SPIE Sensing Technology+ Applications. 910711-1-910711-6 International Society for Optics and Photonics. , (2014).
  38. Coppock, M. B. Protein Catalyzed Capture Agents with Tailored Performance for In Vitro and In Vivo Applications. Peptide Science. , (2016).
  39. Bessette, P. H., Hu, X., Soh, H. T., Daugherty, P. S. Microfluidic library screening for mapping antibody epitopes. Anal. Chem. 79 (5), 2174-2178 (2007).
  40. Chao, G. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1 (2), 755-768 (2006).
  41. Miltenyi Biotec GmbH. autoMACS™ Pro Separator User Manual, Version 1.1. , Miltenyi Biotec GmbH. Bergisch Gladbach, Germany. (2007).
  42. Henriques, S. T., et al. A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry. PLOS ONE. 8 (11), e80474 (2013).
  43. BD FACSCanto II Operator Course Workbook. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  44. BD FACSCanto II Instructions For Use. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  45. Chan, L. Y., Yim, E. K., Choo, A. B. Normalized Median Fluorescence: An Alternative Flow Cytometry Analysis Method for Tracking Human Embryonic Stem Cell States During Differentiation. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (2), 156-165 (2012).
  46. Genewiz. DNA Sequencing Services. , Available from: https://www.genewiz.com/ (2017).
  47. Honegger, A., PluÈckthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. Journal of molecular biology. 309 (3), 657-670 (2001).
  48. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7 (1), 539 (2011).
  49. Lassmann, T., Sonnhammer, E. L. Kalign-an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. BMC bioinformatics. 6 (1), 298 (2005).
  50. EMBL-EBI. Clutal Omega. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (2017).
  51. EMBL-EBI. Kalign. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/ (2017).
  52. Clamp, M., Cuff, J., Searle, S. M., Barton, G. J. The jalview java alignment editor. Bioinformatics. 20 (3), 426-427 (2004).
  53. Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M., Barton, G. J. Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  54. Jalview. , Available from: http://www.jalview.org/Download (2017).
  55. Farrow, B., et al. A chemically synthesized capture agent enables the selective, sensitive, and robust electrochemical detection of anthrax protective antigen. ACS Nano. 7 (10), 9452-9460 (2013).

Tags

Biokemi fråga 130 bakteriell display biopanning peptid affinitet reagens autoMACS biosensing
Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sarkes, D. A., Jahnke, J. P.,… More

Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter