Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Semi-automatisert Biopanning av bakteriell vise bibliotekene for peptid affinitet reagens oppdagelsen og analyse av resulterende isolerer

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56061
Automatic Translation
1, 1, 1
1Sensors and Electron Devices Directorate, US Army Research Laboratory

Summary

Biopanning bakteriell skjerm biblioteker er en velprøvd teknikk for oppdagelse av peptid affinitet reagenser, en robust alternativ til antistoffer. Halvautomatisk sorteringsmetoden her har strømlinjeformet biopanning for å redusere forekomsten av falske positiver. Her viser vi trodde prosessen og teknikker brukt i evaluere kandidater og minimere nedstrøms.

Abstract

Biopanning bakteriell skjerm biblioteker er en velprøvd teknikk for peptid affinitet reagens funn for anerkjennelse av både biotiske og abiotiske mål. Peptid affinitet reagenser kan brukes lignende programmer til antistoffer, inkludert sensing og therapeutics, men er mer robuste og kan utføre i mer ekstreme miljøer. Bestemt anriking av peptid fange agenter til et protein mål av interesse er forbedret med semi-automatisert Sorteringsmetodene forbedre bindende vaske trinnene og dermed redusere forekomsten av falske positive bindemidler. En semi-automatisert Sorteringsmåte er beskrevet her for bruk med en kommersiell automatisert magnetisk-aktivert celle sortering enhet med en ubegrenset bakteriell skjerm sortere biblioteket uttrykke tilfeldig 15-mer peptider. Med små modifikasjoner, disse metodene er utvidbart til andre automatiserte enheter, andre sortering biblioteker og andre organismer. Et hovedmål for dette arbeidet er å gi en omfattende metodikk og forklare tankeprosessen brukt analysere og minimere den resulterende pool av kandidater. Disse teknikkene omfatter analyse-celle bindingen med fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS), for å vurdere tilhørighet og spesifisitet under sortering og sammenligning personlige kandidater, og analyse av peptid sekvenser for å identifisere trender og konsensus sekvenser for å forstå og potensielt forbedre affinitet til og spesifisitet for mål av interesse.

Introduction

Biopanning er en velprøvd teknikk for affinitet reagens oppdagelsen, med bakteriell vise biblioteker en praktisk kilde for peptid affinitet reagenser 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. Tilsvarende vil phage vise 25,26 og gjær vise 27,28, peptidene er utsatt på cellens overflate og er tilgjengelig til å binde til både biotiske og abiotiske mål, med disse interaksjoner drevet av både peptid ryggraden og de unike egenskapene til de aminosyre side-kjeder 29. I motsetning til phage skjerm, bakterier seg selvreplikerende og inneholder alle genetisk materiale som kreves for visning uten elueringsrør av bundne phage og infeksjon av celler. I motsetning til gjær display er bakteriell skjerm raskere på grunn av den raske (ca 20 min 30) dobling tid av Escherichia coli. Resulterende peptid affinitet reagensene kan produseres av cellen for bruk i en rekke sensing plattformer 16,17,26 og har potensial for bruk som levende materiale når vises celle 2 , 31 , 32. sammenlignet med monoklonale antistoffer for anerkjennelse av konkrete mål, peptider er mye mindre og mer fleksible, og peptid skjerm biblioteker kan lett manipuleres på DNA-nivå for å unngå bestemte aminosyrer, som cystein 33 . Peptider er stadig utnyttes for therapeutics 34,35,36 og andre programmer der antistoffer ville vanligvis benyttes på grunn av deres brukervennlighet oppdagelsen, reproduserbare syntetisk (av-celle ) produksjon og overlegen vedlikehold av ytelse i ekstreme miljøer, gir en funksjonell reagens selv etter eksponering for høy temperatur eller langtidslagring uten kjøling 37,38. Muligheten til å overvinne den kalde kjeden for lagring av reagenser er av spesiell interesse for det amerikanske forsvarsdepartementet, for eksempel som må fungere i ekstreme miljøer. Termisk stabilitet var derfor for affinitet reagenser erkjenner de valgte målene gitt som eksempler i dette manuskriptet.

Biopanning bakteriell skjerm biblioteker har nylig blitt enda mer enkle og pålitelige med bruk av semi-automatisert magnetisk-aktivert celle sortering (Mac eller MCS) metoder 9,14,39. Disse metodene har vist for biologiske mål ved hjelp av flere lignende sortering plattformer med ulike fordeler, inkludert en kommersielt tilgjengelig automatisert magnetisk-aktivert celle sortering (autoMACS eller autoMCS) instrument (se tabell over materialer) 1,14,15 og mer spesialiserte enheter som omslutter prøven i en engangs patron 7,9 eller chip 39, en verdifull spesifikasjon for bruk med organismer eller giftstoffer som grad 2 (BSL-2) eller høyere7. Metodene halvautomatisk kan utvides for å sortere for peptider kunne binde til abiotiske materialer hvis materialet er magnetisk eller har muligheten til å være belagt på en magnetisk perle, og for bruk med ulike organismer (for eksempel anaerob bakterier) hvis sortering og vekst betingelser er endret. I tillegg til sortering bakteriell skjerm biblioteker, har kommersielle autoMCS apparatet brukes her også blitt brukt delvis for første trinn av oppdagelse av menneskelig single-kjeden antistoff fragmenter vises på overflaten av gjær, etterfulgt av ytterligere isolasjon bruke lysstoffrør aktivert celle sortering (FACS) 40. Den primære fordeler til semi automatisering er redusert sortering tid og krefter og mer robust og reproduserbar eliminering av ubundet celler fra de magnetiske perlene under vask fremgangsmåten, fører til redusert falske positiver, færre nødvendig sortering runder, og mindre komplisert ned-stream analyse 9,14. Ved kommersiell autoMCS instrumentet, finnes det flere forhåndsinstallerte programmer som kan være optimal for forskjellige programmer, for eksempel negative pre-sortering (tømming), prioritere renhet, minimere siste eksempel volum og øker eller redusere følsomheten for isolering av sjeldne celler 41.

Fokus for dette arbeidet er å demonstrere metodikken for biopanning en bakteriell vise biblioteket ved hjelp av kommersielt tilgjengelig autoMCS apparatet, og for å forklare tankeprosessen brukt analysere og minimere den resulterende pool av kandidater i for å lette utvidelsen for andre programmer. Vis biblioteket her (se tabell av materialer) 12,13 inneholder ca 109- 1011 unike 15-mer peptider vises via en modifisert versjon av bakteriell ytre membran protein OmpX i en ubegrenset natur på celleoverflaten, som forventes å være representativt for den gratis peptid i løsning hvis produsert syntetisk. Denne protein stillaset inneholder i tillegg en positiv kontroll P2X peptid på C-terminus for overvåking uttrykk via binding til YPet Mona. Imidlertid skal kjøpt eller romanen bibliotek med egnet mangfold og andre egenskaper som er nødvendige for det bestemte programmet ønsket fungere på samme måte med denne biopanning fremgangsmåten om noen mindre endringer kan være nødvendig. En skjematisk av denne biopanning protokollen er illustrert i figur 1. I tillegg protokollen kan tilpasses til annet automatisert magnetiske sortering plattformer og andre sortering strategier. Manuell magnetiske sortering med en Borstemmaskin magnet har blitt vellykket demonstrert, men med mer komplisert og tidkrevende nedstrøms analyse kreves skyldes økt falske positiver 14og likevel gir et alternativ til den autoMCS trinnene hvis ingen automatisert magnetiske celle sortering enhet er tilgjengelig.

Protocol

1. Biopanning bakteriell vises biblioteker bruker autoMCS

Merk: Denne autoMCS-basert sortering protokollen har vært beskrevet tidligere 14, og en mer grundig "utvidet protokollen for nye brukere" er tilgjengelig i supplerende materiale for dette manuskriptet for ytterligere detaljer, inkludert en forklaring på potensialet endringer. Hvis en autoMCS enhet er tilgjengelig for sortering, kan du se supplerende protokollen fra Sarkes et al. 2015 siden en manuell sortering protokollen er også beskrevet som fungerer 14. AutoMCS protokollen tilpasset forutsatt her har blitt ytterligere for å inkludere flere negative sortering trinn for forbedret spesifisitet 1,15. En skjematisk av denne biopanning protokollen er illustrert i figur 1.

  1. Negativ sortering hvis du vil fjerne permer vil Cross-React med magnetiske perler
    1. Vaksinere 500 mL av Luria kjøttkraft Miller (LB) inneholder aktuelle antibiotika med ca 1 x 1011cellene i en mangfoldig bakteriell vise sortering bibliotek (se tabell av materialer).
      Merk: Bakteriell skjerm peptid biblioteket brukes her (se tabell av materialer) inneholder ca 109- 1011unike medlemmer 8,12 og dyrkes i LB inneholder 25 µg/mL chloramphenicol (LB Cm25). Resten av denne protokollen vil anta at dette biblioteket brukes.
    2. Ruge på 37 ° C med skjelvende på 225 RPM til kultur når en OD600 på 0,5 - 0.55. Indusere peptid uttrykk med 0,04% w/v-L-arabinose fortynne en 4% lager 1: 100, rister på 225 RPM for 45 min på 37 ° C.
    3. Sted indusert kultur på is. Sentrifuge ca 2 x 1011 cellene på 6000 x g for 20 min på 4 ° C. Fjern nedbryting og resuspend celler i 1,5 mL PBS av forsiktig virvlende.
      Merk: En OD600 1,0 omtrent lik 1 x 109 celler/mL for E. coli.
      Merk: gjør ikke VORTEX som dette kan lyse cellene, resuspend for hånd eller med kort risting på ≤ 225 RPM, 4° C.
    4. Overføre celler til microcentrifuge lysrør og spinn på 6000 x g for 5 min på RT eller 4 ° C. Fjerne nedbryting. Resuspend celle pellet i 1 mL fosfat bufret saltvann (PBS) som inneholder 0,5% bovin serum albumin (BSA; PBS-B).
    5. Vask 300 µL av streptavidin-belagt perler (ca 3 x 109 perler, se tabell av materialer) i 1 mL PBS-B og sentrifuge for 5 min på ≥5, 000 x g (på RT). Sett røret i benk toppen magnetiske partikler skilletegn. Fjern forsiktig nedbryting, unngå pellet.
    6. Resuspend perler i cellen pluss PBS-B blanding forberedt ovenfor. Ruge på 4° C på en roterende plattform for 45 min. sted prøvene på is.
    7. Slå på autoMCS instrument for å starte systemet. Prime linjer med produsentens løpe og vaskebuffere (se tabell av materialer) ved å velge "Vask nå" nederst på skjermen i menyen "Separasjon" og "Rense" og "Kjør".
    8. Prime systemet med PBS-B, med PBS-B både vaskebuffer og kjører Buffer i neste trinn. Velg "Separasjon" fra øvre navigasjonslinjen, og velg "Vask nå". Velg "Rense" og "Kjør" for å prime systemet med fersk PBS-B.
    9. Overføre cellen og perle blanding fra inkubasjon trinn til et 15 mL konisk rør. Plasser denne rør i prøven spor, og tømme 15 mL konisk rør i positive og negative utvalg sporene, av en pre kjølt (4 ° C) rack (se tabell av materialer). Sett stativet på instrumentplattformen.
    10. Tilordne en separasjon program for hvert utvalg på stativet (opptil 5 prøver kan sorteres i en løpe). Legge til et "Rense" trinn mellom hvert utvalg og etter siste prøven. Velg "Kjør" for å starte cellen separasjon. Velg "OK" for å bekrefte at det finnes nok buffer.
      Merk: "Posselds" separasjon programmet fungerer godt for sortering av negative og positive sortering runde 1 og "Posseld" foretrekkes for sortering runder 2-4, men begge disse programmene har blitt brukt for alle negative og positive sortering runder 14 ,15 og andre programmer kan være bedre for et bestemt program (nærmere beskrevet i diskusjon).
    11. Når programmet er fullført, Fjern brettet og beholde riktig brøken. Her, en negativ form, Behold negative brøker (inneholder celler uten perler). Plasser på isen.
    12. Bruk negative Sorter brøken i sin helhet for å vaksinere 1L LB Cm25 med 0,2% w/v-D-glukose. Vokse over natten ved 37 ° C, rister på 225 RPM.
    13. Før du slår av autoMCS maskinen, kan du endre løpe og vask bufferne til produsentens løpe og vaskebuffere (se tabell av materialer). Velg "Vaske nå", og "Rense" og "Kjør". Når ferdig, Husk det er 70% etanol i dekontaminering linjen, og trykk "strømikonet" øverst i høyre hjørne av skjermen og velge "Ja".
    14. Når Systemavslutningen er fullført (flaskene vil være lilla), slå av maskinen.
    15. Neste dag, bruke overnatting kulturen for å gjøre fryser aksjer med ca 1 x 1011celler per medisinglass i LB med 15% glyserol. I tillegg, eller alternativt bruke denne kulturen i neste trinn: flere negative sortering (paragraf 1.2) eller den første runden av positiv sortering (inndelingen 1.3).
  2. Negativ sortering hvis du vil fjerne bindemidler kan Cross-React med andre mål av interesse
    Merk: Delen 1.2 kan hoppet hvis lenger negative sortering er nødvendig eller ønsket. I så fall gå videre til delen 1.3. Gjenværende binding til noen uønskede mål kan bli vurdert av FACS som i avsnitt 2: FACS analyse av sortering runder.
    1. Negativ sortering mot et bestemt protein mål, for eksempel et lignende protein med potensial også bind til oppdaget peptider 1,15, gjenta vekst og induksjon 1.1.1 - 1.1.3, begynner med en frossen lager av streptavidin-utarmet biblioteket fra trinn 1.1.15 eller over natten kultur fra trinn 1.1.12 (benytter OD600 å anslå og vaksinere med 1 x 1011 celler).
    2. Overføre celler til microcentrifuge lysrør og spinn på 6000 x g for 5 min på RT eller 4 ° C. Fjerne nedbryting. Resuspend celle pellet i 1 mL PBS med 600 nM biotinylated cross-reactive protein mål. Inkuber ved 4 ° C i 45 min på en roterende plattform.
      Merk: 600 nM er en foreslått Start konsentrasjon, som kan endres hvis en bemerket fordel er observert. Biotinylation av protein mål oppnås og kvantifisert bruke reagensene foreslo i tabellen av materialer.
    3. I mellomtiden vaske 100 µL av streptavidin-belagt perler (om 1 x 109 perler) i 1 mL PBS-B og sentrifuge for 5 min ≥ 5000 x g (på RT). Sett røret i en benk toppen magnetiske partikler skilletegn og nøye fjerne nedbryting, unngå pellet.
    4. Sentrifuge mål-bundet cellene på 6000 x g i 5 min (RT eller 4° C), fjerne nedbryting og resuspend celle pellet i 1 mL PBS-B. Resuspend perler i hele volumet av vasket celler bundet til cross-reactive protein mål. Ruge på 4° C på en roterende plattform for 30 min.
    5. Plasser prøven på is og fullført trinnene 1.1.7 - 1.1.15 for en negativ form, gjør riktig fryser aksjer. Fortsette å delen 1.3 for en positiv form hvis alle ønsket negative sortering er oppnådd, eller gjenta paragraf 1.2 negative Sorter mot en annen potensiell cross-reactive protein.
  3. Runde 1 positiv form
    Merk: Runde 1 positiv sortering mot et bestemt protein målet er lik en negativ slag mot et bestemt sortering mål (se 1.2) bortsett fra at perle inneholder, positiv brøken beholdes.
    1. Vaksinere 500 mL LB Cm25 med ca 1 x 1011cellene i en mangfoldig bakteriell vise sortering bibliotek som har vært streptavidin-utarmet og blitt overnatting (fra trinn 1.1.12) eller frosne (fra trinn 1.1.15) og tinte på is, eller som er Videre utarmet av dokumentordnere til andre cross-reactive protein mål (fra trinn 1.2.5), som ønsket.
    2. Ruge på 37 ° C med skjelvende på 225 RPM til kultur når en OD600 på 0,5 - 0.55. Indusere peptid uttrykk med 0,04% w/v-L-arabinose fortynne en 4% lager 1: 100, rister på 225 RPM for 45 min på 37 ° C.
    3. Sted indusert kultur på is. Sentrifuge ca 2 x 1011 cellene på 6000 x g for 20 min på 4 ° C. Fjern nedbryting og resuspend celler i 1,5 mL PBS av forsiktig virvlende (for hånd eller med kort risting på ≤ 225 RPM, 4° C).
    4. Overføre celler til microcentrifuge lysrør og spinn på 6000 x g for 5 min på RT eller 4 ° C. Fjerne nedbryting.
    5. Resuspend celle pellet i 1 mL PBS med 600 nM biotinylated protein mål av interesse. Inkuber ved 4 ° C i 45 min på en roterende plattform.
      Merk: 600 nM er en foreslått Start konsentrasjon, som kan endres hvis en bemerket fordel er observert. Biotinylation av protein mål oppnås og kvantifisert bruke reagensene foreslo i tabellen av materialer.
    6. I mellomtiden vaske 100 µL av streptavidin-belagt perler (om 1 x 109 perler) i 1 mL PBS-B og sentrifuge for 5 min ≥ 5000 x g (på RT). Sett røret i benk toppen magnetiske partikler skilletegn, og fjern forsiktig nedbryting, unngå pellet.
    7. Når inkubasjon målet er fullført, sentrifuge mål-bundet cellene på 6000 x g i 5 min (RT eller 4° C) for å fjerne en ubundet målet protein. Fjerne nedbryting og resuspend celle pellet i 1 mL PBS-B. Resuspend perler i hele volumet av vasket celler bundet til protein mål. Ruge på 4° C på en roterende plattform for 30 min. sted på is.
    8. Slå på autoMCS instrument for å starte systemet. Prime linjer med produsentens løpe og vaskebuffere (se tabell av materialer) ved å velge "Vask nå" nederst på skjermen i separasjon-menyen og "Rense" og "Kjør".
    9. Prime systemet med PBS-B, med PBS-B både vaskebuffer og kjører Buffer i neste trinn. Velg separasjon fra øvre navigasjonslinjen og velg vask. Velg skyll og kjøre Prime systemet med fersk PBS-B.
    10. Overføre cellen og perle blanding fra inkubasjon steg over slik 15 mL konisk skylling røret med en ekstra 500 µl av PBS-B og pooling vask med prøven. Plasser denne rør i prøven spor, og tømme 15 mL konisk rør i positive og negative utvalg sporene, av en pre kjølt (4 ° C) rack (se tabell av materialer). Sett stativet på instrumentplattformen.
    11. Tilordne en separasjon program for hvert utvalg på stativet (opptil 5 prøver kan sorteres i en løpe). Legge til et "Rense" trinn mellom hvert utvalg og etter siste prøven. Velg "Kjør" for å starte cellen separasjon. Velg "OK" eller "Fortsette" å bekrefte at det finnes nok buffer.
      Merk: "Posselds" separasjon programmet fungerer godt for sortering av negative og positive sortering runde 1 og "Posseld" foretrekkes for sortering runder 2-4, men begge disse programmene har blitt brukt for alle negative og positive sortering runder 14 , 15 og andre programmer kan være bedre for et bestemt program (nærmere beskrevet i diskusjon).
    12. Når programmet er fullført, Fjern brettet og beholde riktig brøken. Her, for en positiv form, Behold positiv brøker (inneholder celler og perler). Plasser på isen.
    13. Før du slår av autoMCS maskinen, kan du endre løpe og vask bufferne til produsentens løpe og vaskebuffere (se tabell av materialer). Velg "Vaske nå", og "Rense" og "Kjør". Når ferdig, Husk det er 70% etanol i dekontaminering linjen, og trykk "strømikonet" øverst i høyre hjørne av skjermen og velge "Ja".
    14. Når Systemavslutningen er fullført (flaskene vil være lilla), slå av maskinen.
    15. Bruk positiv form brøken i sin helhet for å vaksinere 1L LB Cm25 med 0,2% w/v-D-glukose. Vokse over natten ved 37 ° C, rister på 225 RPM.
    16. Neste dag, bruke overnatting kulturen for å gjøre fryser aksjer i LB som inneholder 15% glyserol og/eller fortsette å positiv sortering runde 2 i delen 1.4.
  4. Påfølgende positiv sortering runder
    Merk: Vanligvis fire sortering runder anbefales, selv om tre sortering runder er vanligvis tilstrekkelig 14,15. Når å stanse sorteringen er assistert av beskrevet FACS analyse av sortering runder i del 2. Konsentrasjoner av mål og magnetiske perle volum redusere med hver påfølgende positiv sortering runde.
    1. Bruke overnatting kulturen fra forrige sortering runde (eller en frossen celle lager fra runden), vaksinere 5 mL LB Cm25 med 100 µl celler (1:50 fortynning). Ruge på 37° C med skjelvende på 225 RPM til kultur når en OD600 på 0,5 - 0.55.
    2. Indusere peptid uttrykk med 0,04% w/v-L-arabinose, rister på 225 RPM for 45 min på 37° C. Sted indusert celler på is.
      Merk: Denne indusert kultur kan også brukes til å vurdere forpliktende tilhørighet og spesifisitet for sortering rundt det stammer fra, som beskrevet i del 2 nedenfor.
    3. Sentrifuge 1 x 108 celler 6000 x g for 5 min på RT eller 4 ° C. Fjerne nedbryting og resuspend celle pellet i 50 µL PBS med halv konsentrasjonen av biotinylated protein mål av interesse brukes for den forrige runden av sortering (derfor 300 nM for runde 2, 150 nM for runde 3 og 75 nM for runde 4 fra våre foreslåtte startpunkt). Inkuber for 45 min på is (eller 4 ° C en roterende plattform).
    4. I mellomtiden vaske streptavidin-belagt perler (15 µL for runde 2, 8 µL for runde 3 og 4 µL for runde 4) i 1 mL PBS-B og sentrifuge for 5 min ≥ 5000 x g (på RT). Sett røret i en benk toppen magnetiske partikler skilletegn og nøye fjerne nedbryting, unngå pellet. Resuspend perler i 50 µL PBS-B.
    5. Etter 45 min incubation målet i trinn 1.4.3, sentrifuge cellene på 6000 x g for 5 min på RT eller 4° C, fjerne nedbryting og resuspend cellene i den 50 µL vasket perler fra 1.4.4. Holde eksempel på is og fullført trinnene 1.3.7 - 1.3.13 for en positiv form.
    6. Vaksinere en 5 mL kultur LB Cm25 med 0,2% w/v D-glukose med hele positiv, perle inneholder brøken fra sorteringen.
    7. Neste dag, bruke overnatting kulturen til fryseren aksjer LB som inneholder 15% glyserol og/eller fortsette til neste positive sorteringen rundt, tilbake til trinn 1.4.1.
      Merk: Bruke indusert kulturen fra 1.4.2 for å vurdere forpliktende tilhørighet og spesifisitet som beskrevet i § 2 nedenfor kan hjelpe bestemme når du skal stoppe sortering. Hvis to sortering runder på rad viser lignende forpliktende tilhørighet, eller en senere runde viser redusert forpliktende tilhørighet for mål av interesse, dette en ønskelig sted for å stanse sorteringen. Etter den siste runden, gå tilbake til trinn 1.4.1 men stopp på 1.4.2.

2. FACS analyse av sortering runder

  1. Bruke indusert cellene fra trinn 1.4.2 for hver sortering runde, eller identiske kulturer, legge til 5 µL indusert celler 25 µL av hver av følgende forberedt løsninger for bindende vurdering (se også tabell av materialer): PBS alene; PBS med 150 nM YPet Mona (YPet 12,13, positiv kontroll for uttrykket), hvis tilgjengelig. 900 nM protein målet konjugert til en fluorescerende farge, for eksempel Amin-reaktive dye med utslipp/eksitasjon på 493 nm⁄518 nm (mål-488); 900 nM cross-reactive protein målet (r) brukes for negative sortering merket med samme fluorescerende fargestoff (Cross-Reactive Protein-488); og 900 nM streptavidin-R-phycoerythrin (SAPE). Ruge på is 45 min.
    Merk: Hvis fortsetter direkte fra trinn 1.4.2, dette trinnet vil alltid gjøres dagen etter biopanning for den runden var fullført siden ned utvalgte biblioteket ble dyrket over natten da subcultured og indusert dagen. Også du kan bruke kulturer vokst og indusert tilsvarende fra frosne sortering runde aksjer; i så fall kan alle runder være testet og sammenliknet i et enkelt eksperiment.
  2. Sentrifuger cellene på 6000 x g for 5 min på RT eller 4° C. Fjern nedbryting og lagre prøver på is.
    Merk: Cellen pellets kan lagres på is til alle prøvene er klar for analyse.
  3. Slå på apparatet FACS, åpne programvaren, oppstart systemet, og kalibrere maskinen etter produsentens instruksjoner 43,44.
  4. I FACS programvaren, klikk på "Administrator" og klikk på ønsket mappe eller opprette en "ny mappe". Klikk på "Ny eksperimentet"-ikonet øverst til venstre på skjermen. Høyreklikk ikonet for å "gi" eksperiment. I dette eksperimentet, klikk på "Global regneark".
  5. Klikk på ikonet "Dot plott", klikk på globale regnearket regnearket til å opprette denne scatterplot. Klikk på dot tomten grafen selv, og velg "Inspektør"-ikonet øverst til venstre på skjermen og justere aksene biexponential vise ved å velge boksene ved siden av "Y" og "X-aksen" i det åpne vinduet. Lukk vinduet biexponential visning ved å klikke X.
  6. Opprette en "ny Tube" ved å klikke ikonet øverst til venstre på skjermen og gi deg prøven med riktig informasjon ved å høyreklikke ikonet prøven under "global regneark" og velge "gi nytt navn". Utvid prøven ved å klikke på (+) tegn, og deretter dobbeltklikker du på ikonet rør, høyreklikk på den og igjen Velg "endre" for å beskrive prøven.
  7. Bruk denne dot tomten grafen med standard SSC-A vs FSC-A for å kjøre en negativ kontroll prøven i PBS alene av dobbel klikker på at tube eller klikke pilen ved siden av. Bare før du kjører eksemplet, resuspend celle pellet i 500 µL isen kalde FACS kjører buffer og overføre prøven til en FACS rør (se tabell av materialer), blande godt av pipettering og flicking røret. Plass resuspended cellene på eksempel injeksjon tube (SIT) av apparatet. Trykk "kjøpe" med "Hendelser å utfoldelse" på 30.000-50,000 og "Hendelser til Record" på 10.000, dataflyt hastigheten lav (startes; øke hvis nødvendig), og "Sitte flush" valgt.
    Merk: Riktig hastighet (lav, middels eller høy) er hastigheten som antall hendelser/s er ca mellom 200 og 2000.  Bruk dette området for alle trinnene.
  8. Mens anskaffe, justere photomultiplier tube (avdrag) spenning terskelen om nødvendig ved å velge kategorien "Terskelen" Klikk på og endre "Value". Justere spenning for fremover og side xy (FSC og SSC) slik at negativ kontroll celler i PBS alene faller litt under sentrum.
    Merk: Flere parametere (for eksempel SSC) kan legges i kategorien "Terskelen" fra "Legg til"-ikonet. Vanligvis avdrag spenninger til ca 700 V til 1000V for både SSC og FSC fungerer bra for E. coli.
  9. Hvis prøven leser riktig, justere infusjonshastigheten for å vise 200-2000 hendelser/s og trykk "Record Data". Når innspillingen, Fjern rør fra SIT og plasser på is.  Velg ikonet "Polygon Gate" og bruke musen til å tegne en gate rundt flertallet av befolkningen cellen i scatterplot. Høyreklikk på dot tomten og velg "Vis befolkningen hierarki".
  10. Bruk denne "P1" gate som forelder ved å klikke på "P1" i befolkningen hierarkiet. Opprette ny dot tomten etter trinn 2.5. Høyreklikk hver akse og endre y-aksen til FITC og x-aksen til FSC-A. Gate kontrollen negative (PBS alene) bruker ikonet "polygon gate", med porten så tett som mulig rundt toppen og venstre side av befolkningen.
    Merk: Dobbeltsjekk befolkningen hierarkiet for å sikre at P1 porten forelder av P2 gate. Hvis ikke vil vises i tråd med P1 porten og "Alle hendelser" blir overordnet. Slett porten og gjenopprette den etter trinn 2.10.
  11. Velg "P2" i befolkningen hierarkiet, høyreklikk og velg "Inverter gate". Høyreklikk på dot tomten med P2 gate og velg «Vis befolkninger». Velg befolkningen "P2" og "Ikke P2" for visning (mindre enn 1% av befolkningen faller utenfor porten).
  12. Høyreklikk dot handlingen med P2 gate og velg "Opprett statistikk View". Høyreklikk Statistikkvinduet for visning og velge "Rediger statistikk View". Velg kategorien "Populasjoner" og legge til eller fjerne befolkninger, som ønsket, inkludert overordnede befolkningen, P1 (P2 og ikke P2 bør allerede vises). Klikk på fanen "Statistikk" og legge "FITC-A Median" og noen andre statistikk av interesse. Lukk vinduet ved å trykke OK.
  13. Opprette en lignende dot tomten graf for PE-A vs FSC-A og gate med PBS alene eksemplar (tidligere tomter kan dupliseres og endret). Bruk dette regnearket til å kjøre alle prøver (inkludert negativ kontroll celler inkubert med hvert fluorophore-merket mål) på denne måten, registrere 10.000 hendelser for hver.
    Merk: Cellene som faller utenfor porten etter inkubasjon med mål-488 protein, YPet positiv kontroll, etc. er bindemidler som protein, og verdien fra "Ikke PX" (der X er antall gated befolkningen for at grafen) som skal registreres som % bundet. Når du bruker SAPE som en negativ kontroll, bruk PE-A vs FSC-A tomten. Median fluorescens intensitet (MFI) P1 bør også registreres som dette gir informasjon utover % binding, til viser omfanget av binding i relative termer, og er mer robust i nærvær av outliers 45. Median fluorescens intensitet kan være normalisert (nMFI) ved å dele MFI av hver peptid av MFI stillaset eneste negative kontroll (med ingen N-terminal peptid) eller en klone som inneholder en peptid sekvens som ikke kan bindes mål av interesse, etter inkubasjon med samme mål konjugert til de samme fluorophore 14. Hvis disse negativ kontroll cellene er tilgjengelige, kan uninduced celler inkubert med samme mål og merket med de samme fluorophore også brukes for normalisering.

3. sequence Analysis potensielle kandidater og vurdering av bindende affinitet

  1. Peptid sekvens besluttsomhet
    1. Velg og sekvens titalls eller hundrevis av bakteriell koloniene fra den siste runde av biopanning (vanligvis runder 3 og/eller 4 er tilstrekkelig 14).
    2. Analysere sekvensen data med makrofilen som vi har utviklet (se støtteinformasjon for koden "Sub eCPX_Sequencing") til spesielt analysere sekvenser generert fra biopanning 15mer bakteriell vise biblioteket oppført i tabellen materialer. Bruk regneark-programvaren som er oppført i tabellen i materialer eller andre foretrukne kompatibel programvare.
      Merk: En rekke verktøy er tilgjengelig online som kan også hjelpe i DNA sekvens analyse 47. Hvis foretrukket, bruke en annen etablert metode for sekvensen analyse og går til trinn 3.1.3.
      1. Laste ned bildesekvensfiler (.seq filer, dokumenter også) og trekke dem inn i en ny mappe. Eventuelt flytter eller kopierer mappen til datamaskinens harddisk (i motsetning til en nettverksmappe) for bedre hastighet.
      2. Åpne et nytt regnearkvindu for. Sørg for å aktivere makroer og funksjoner, hvis meldingene vises.
        Merk: Trinn 3-6 under bør bare må fullføres første gang makroen brukes. For senere analyse, bare "kjøre the makro" fra og med trinn 7.
      3. Kopier hele innholdet i makroen finnes i filen "Sub-eCPX_Sequencing".
        Merk: Gjeldende versjon er satt opp med flankert sekvenser for 15-mer biblioteket oppført i tabell av materialer og vil oversette aminosyrer mellom dem. Flere sekvenser kan være angitt ved å kopiere 5' flankert sekvenser i kolonne A og 3' flankert sekvenser i kolonne B i regnearket, opp til 10 sekvenser for hver, før du kjører makroen.
      4. I filen tomt regneark, velg "Vis"-kategorien, og dobbeltklikk på "Makroer." Velg mappen personal.xlb. Hvis dette er tilgjengelig, kan du registrere en makro først for å gjøre dette vises.
      5. Klikk "Opprett" eller "gå inn", avhengig av hva kan utheves. Lim inn hele makroen i modulen.
      6. Klikk Lagre-ikonet eller gå til fil, lagre. Avslutt modulen. Hvis et vindu dukker opp, trykk på OK.
      7. Kjøre makroen: gå til mappen hvor filene desired.seq. Klikk på linjen ved siden av ikonet for mappen øverst for å vise mappeplasseringen. Kopiere den.
      8. Gå til vinduet for nye regneark. Velg kategorien Vis, og dobbeltklikk på makroer. Velg "eCPX_Sequencing" fra listen og klikk "Kjør".
      9. I boksen som dukker opp, lime filplasseringen kopierte i trinn 7, og trykk enter. Makroen bør starte går gjennom sekvenser og organisere dem i tabeller i forskjellige ark.
      10. Bruk "Tabell" arket for å avgjøre hvis det blir nødvendig å sjekke filer for feil og korrigerer manuelt (hvis sekvenser inneholde "X" eller kan ikke oversettes).
        Merk: "Sammendrag tabellen" viser oversatt peptid sekvenser, sortert etter aminosyresekvens (fra A til Z), med mindre en sekvensering feil forhindret oversettelse. En "X" angir en individuell aminosyre som ikke kunne fastslås.
    3. Når sekvensene er oversatt, organisert, og sekvensering feil korrigert, sjekk listen sortert peptid sekvens i "Tabell" arket for noen gjentatte sekvenser.
    4. Vokse overnatting kulturer for sekvensert kolonier av interesse (inkludert den gjentar og/eller peptider med merkbar trender minst) i 5 mL LB Cm25 på 37 ° C, rister på 225 RPM, og lagre fryser aksjer neste dag i LB som inneholder 15% glyserol, som i trinn 1.4.7. test peptidene med gjentatte sekvenser for innbinding affinitet og spesifisitet med FACS metodene beskrevet i Seksjon 3.3 og bruke FASTA formatet på listen rekkefølge (full liste og gjentar bare) til å justere sekvenser med foretrukket justering og analyse programmer, i del 3.2.
  2. Sekvensen justering Clustal Omega, Kalign og lignende programmer
    1. Kopier sekvenser i FASTA format fra FASTA regnearket til makroen, eller ellers lage en liste over FASTA filer fra sekvensene som skal justeres (som dem fra trinn 3.1.3).
      Merk: Kolonne A inneholder FASTA filene i numerisk rekkefølge av "Seq #" mens kolonne B vises sortert etter "AA sequence" fra "Tabell" arket. Listen over peptid sekvenser sortert etter aminosyresekvens vises ubrukelig sekvenser på toppen, som Tom vektor (som "# Tom") og de sekvensene i som verken søkekriteriene 5' eller 3 ble funnet (som "# verdi). Denne ansiktstrekk innrømmer for lett oppdatere eller fjerning av de sekvensene fra analyse.
    2. Åpne Clustal Omega48 eller Kalign49 programvare ved å gå til nettsiden 50,51, eller bruke andre foretrukne programvare for sekvensen justering. Avskrift og pasta listen FASTA sekvens og innspill den inn i boksen under "sekvenser i alle støttede formater". Endre "gap åpne straff" til 30 under "flere valgmulighetene" i Kalign (dette ikke er mulig i Clustal Omega), men ellers holder standardinnstillinger før du klikker "Send".
    3. Analysere sekvens justering ved hjelp av Jalview 52,53 programvare direkte i Clustal Omega og Kalign online programvare ved å velge kategorien "resultatsammendrag" over justering og deretter klikke ikonet "Jalview".
      Merk: Hvis foretrukket, eller for analyse av sekvens justeringer generert av alternative programmer, laste ned 54 programvaren separat og kopier og lim justeringen i vinduet analyse, som åpnes ved å klikke på "File", "Input justering", og " fra lærebok". Dette gir et middel til å lett finne ut om det finnes en konsensus sekvens i inndatasekvensen justeringen.
  3. Sammenligne forpliktende tilhørighet og spesifisitet bruker FACS
    1. Vaksinere 5 mL LB Cm25 supplert med 0,2% w/v D-glukose med hver individuelle isolere rundt (fra trinn 3.1.4 og/eller kolonier av interesse fra videre sekvens analyse i del 3.2, etc.) og en passende negativ kontroll (display stillaset bare eller et peptid som ikke kan bindes målet, som beskrevet i notatet for trinn 2.13). Vokse over natten ved 37 ° C, rister på 225 RPM.
    2. Bruke overnatting kulturer for å vaksinere 3 mL LB Cm25 med 60 µl celler (1:50 fortynning). Ruge på 37° C med skjelvende på 225 RPM til kultur når en OD600 på 0,5 - 0.55. Indusere peptid uttrykk med 0,04% w/v-L-arabinose pluss 2 mM EDTA (for tilrettelegging av peptid skjerm 42), rister på 225 RPM for 45 min på 37 ° C.
    3. Sted indusert kulturer på is. For hver isolere, legge til 5 µL celler 25 µL PBS alene eller PBS inneholder: 150 nM YPet 12,13 (positiv kontroll for uttrykket), hvis tilgjengelig. 250 nM mål-488; 250 nM Cross-Reactive Protein(s)-488; og 250 nM SAPE (se 2.1 for flere detaljer). Ruge på is 45 min.
    4. Sentrifuger cellene på 6000 x g for 5 min på RT eller 4° C. Fjern forsiktig nedbryting av tegning væske fra motsatt side av pellet. Lagre celle pellets på is inntil alle prøvene og er klar for analyse.
    5. Resuspend hver celle pellet i 500 µL isen kalde FACS kjører buffer, blande godt av pipettering og flicking røret, like før lese ved hjelp av en flyt cytometer (se tabell av materialer).
      Merk: Se trinn 2.13 notater for nærmere forklaring av gating og beregning av nMFI sammenligne forpliktende tilhørighet og spesifisitet. Non-permer eller uspesifisert bindemidler kan nå fjernes fra videre analyse og de høyeste affinitet bindemidler bør revurderes av sekvens justering etter kapittel 3.2 å lete etter ytterligere trender som kan ha vært savnet i første sekvensert befolkningen. Deler 3.2 og 3.3 kan gjentas etter behov som nye trender og konsensus sekvenser er notert. Denne analysen kan inkludere mer tilfeldige sekvenser hvis trender ikke er sett.

Representative Results

Med bruk av automatiserte magnetisk-aktivert celle sortering (autoMCS) i stedet for manuell magnetiske celle sortering, er falske negative kandidater betydelig redusert under biopanning bakteriell skjerm biblioteker 9,14. Negativ sortering trinnene kan være legges for å redusere ikke-spesifikk dokumentordnere til mål av interesse, og det anbefales et minimum for å legge til en negativ slag mot den magnetiske perler seg foran. Dette negative valget mot de magnetiske perlene selv ble fullført før fire budrunder biopanning valgt bakteriell vise biblioteket for beskyttende antigen (PA) bindemidler, som vist i figur 2, og før flere negative utvalg mot rivax og fire budrunder positiv valg for abrax, som vist i Figur 3. Perlene her er konjugert til streptavidin for opptak av biotinylated proteiner, så utilsiktede isolering av peptider binding til streptavidin seg selv er en bekymring og overvåkes ved hjelp av FACS med streptavidin-konjugerte til Phycoerythrin (Figur 3 , SAPE). Minst bør binding til streptavidin testes for noen lovende personlige kandidater ved fastsetting binding til målet protein. Både prosent bindingen og nMFI for SAPE skal lave verdier i alle sortering runder. Nivået av binding til streptavidin kan øke noe med hvert sortering runde, som oppstod i Figur 3, fordi befolkningen gjentatte ganger utsettes for streptavidin-belagt magnetiske perler etter hver sortering runde. Hvis nivået på bakgrunn streptavidin bindingen blir problematisk å nedstrøms, kan ytterligere negative sortering mot de magnetiske perlene utføres etter positive sortering rundt der streptavidin binding folketallet i for å redusere nedstrøms screening av falske positiver. Når proteiner eller materialer er tilgjengelige som spesielt kan forstyrre nedstrøms bruk av peptid for et bestemt program, eller som skal cross-react med affinitet reagensene mål på grunn av strukturelle og/eller sekvens likheten, Videre negative sortering mot protein eller materiale anbefales. Et eksempel er negativ sortering mot rivax før isolering av abrax binding peptider, strukturelle likhet og sekvens homologi disse to proteinene 1,15. Igjen, cross-reactive bindende proteiner brukes for negative sortering trinnene kan overvåkes under analysen av sortering runder med FACS (Figur 3Rivax-488). I beste fall er prosent bindende og nMFI lav, som i dette eksemplet.

Når et fast positiv kontroll peptid, som P2X peptid på C-terminus av skjermen stillaset produsert av bakteriell vise biblioteket i representant resultatene her kan hjelpe avgjøre om manglende binding affinitet i FACS analysen er på grunn av manglende uttrykk for visningen stillas, mangel på affinitet av peptide(s) for målet. I figur 2 og Figur 3, YPet Mona binding til denne P2X peptid overvåkes og viser at de tidlige rundene av sortering uttrykke stillaset dårlig. Dette er sannsynligvis hovedsakelig på grunn av den høye frekvensen av stopp kodon i N-terminal peptider i tilfeldig biblioteket, som betyr at stillaset selv ikke ble opprettet. Andre effekter kan i tillegg bidra, slik som tilstedeværelsen av peptider med uventede toksiske effekter til E. coli, eller redusert vekst eller peptid vise priser andre årsaker (for eksempel mutasjoner i bakteriell genomet). Tillegg av EDTA under Innledning kan forbedre uttrykk under disse tidlige rundene av sortering 42, men har ikke blitt testet. Binding til YPet Mona i hver biopanning er befolkningen betydelig forbedret runde 3. Sammenligne figur 2 til Figur 3, er det også klart at uttrykket nivå kan forbedres ved å øke induksjon tid til 90 min (som i figur 2YPet Mona) enn 45 min (som i Figur 3YPet Mona), Selv om 45 min er vanligvis tilstrekkelig. Merk at nMFI for YPet Mona normaliseres til YPet Mona bindende nivå av negativ kontroll celler, så verdier nær 1.0 er typisk hvis uttrykk er akseptabelt. Normalisere YPet Mona MFI til PBS alene MFI fra samme eksempel er også en gyldig måte å sammenligne relative uttrykk nivåer, men gir mye høyere verdier (sammenligne figur 2 og Figur 3 med resultater fra Sarkes et al. 2015 15).

Berikelse av bibliotek for peptider binding til spesifikke mål av interesse er vanligvis oppnås innen tre positiv sortering runder, men fortsetter å en fjerde runde av sortering kan være nyttig, som vist i figur 2 og Figur 3 . Her prosent bundet celler og nMFI fortsetter å øke runde 3 runde 4 for både eksempel mål, PA og abrax, som er innrammet i rødt i figur 2 og Figur 3, henholdsvis. Den høyeste affinity peptid sekvenser kan allerede finnes i runde 3 men vil berike i 4.omg, som hjelpemidler i ned-utvalget av potensielle kandidater 14. Analyse av sekvenser fra 4.omg tendens til å avsløre gjentatte sekvenser, og disse gjentatte sekvenser er et utmerket utgangspunkt for tilhørighet og spesifisitet analyse og konsensus sekvens vilje. ECPX_Sequencing makroen som et supplement til dette manuskriptet bidrar til å effektivisere denne første analysen, som vist i Figur 4. Begynner med en mappe med .seq eller tekstfiler, DNA sekvensen som ligger mellom valgte 5' og 3 sekvenser er oversatt, organisert av aminosyresekvens og analysert for antall individuelle aminosyre rester i hver peptid. Den sorterte listen over isolert peptid sekvenser, kan som vist i tabell ark skjermbilde i Figur 4brukes til enkelt å se hvilke sekvenser gjenta og hvilken frekvens. Cellene i regnearket som inneholder gjentatte sekvenser markeres i forskjellige farger for lettere analyse. Det anbefales å sjekke disse gjentatte sekvenser for konsensus sekvenser og andre trender. Dette er hjulpet av sekvens justering programvare som Kalign og Clustal Omega og analyse kan utføres på hele sekvensen resultatet (inkludert både gjentatte og ikke-gjentatte sekvenser på frekvensen de dukket opp) og de ned valgte listen over gjentatte sekvenser (med eller uten deres relative hyppigheten). Representant resultater for PA og abrax gjentatte sekvenser, uten å ta frekvens hensyn, er vist i figur 5A og 5B, henholdsvis. Merk at i figur 5A for PA målet, flere av personlige gjentatte sekvenser selv inneholde konsensus rekkefølgen WFCFTC (eller en lignende sekvens), understreket i rødt, som ble fastsatt bruker Jalview software analyse på en Kalign sekvensen justering av gjentatte sekvenser. Denne konsensus, ble som WXCFTC, tidligere identifisert som PA bindende enighet, som gir tillit i sortering metode 9. I figur 5B, der gjentatte sekvenser for abrax målet ble analysert på samme måte, var resultatet ganske annerledes. Først var det bare fem sekvenser som gjentas i runde 4 av biopanning for abrax bindemidler, i motsetning til femten gjentatte sekvenser isolert fra runde 4 av biopanning for PA bindemidler (selv om 44% mer kolonier ble også sekvensert for PA). Andre, ingen av fem gjentatte sekvenser inneholdt mest lovende "konsensus" sekvensen (FWAWF, understreket i lilla), selv om kandidaten AX-A15 inneholdt sekvensen som best passer (FWDTWF). Videre analyse, inkludert forpliktende tilhørighet og spesifisitet besluttsomhet, hjalp gi konsensus av FWDTWF bestemmes av topp fem kandidater til abrax binding i figur 5C, som beskrevet nedenfor.

En representant koloni fra hver gjentatt rekkefølge kan analyseres videre på celle affinitet og spesifisitet bruker FACS, som i figur 6A for de gjentatte sekvensene fra biopanning for abrax innbindingen peptider. Her er det klart at alle fem gjentatte sekvenser har høyere affinitet for abrax, det tiltenkte målet, enn rivax, samme protein brukes for negative sortering eller streptavidin, som finnes under Sorter på grunn av de magnetiske perlene brukt for biopanning. Dette stemmer overens med de allerede lovende resultatene for tilhørighet og spesifisitet av sortering runder vises i Figur 3, hvor det er klart at berikelse for å binde det tiltenkte målet, abrax, øker med hver runde biopanning mens affinitet for lignende protein, rivax, er ikke. Men en tilfredsstillende konsensus sekvens ikke ble fastsatt for abrax Sorter bruke gjentatte sekvenser fra 4.omg alene (figur 5B og over diskusjon). Tilbake til 100 sekvensert koloniene fra 4.omg, men ble det bemerket av øye når forskende for sekvenser som ligner det beste treffet for den anslåtte konsensus som en ekstra kandidat, AX-A12, inneholdt FWDTWF sekvensen som ble nevnt i isolere AX-A15 , og at en annen kandidat, AX-A14, inneholdt en lignende sekvensen med DWNTWF. Disse og andre sekvenser som enten finnes likhetstrekk til gjentatte sekvenser, demonstrerte likheter med andre ikke-gjentatte sekvenser eller ble valgt tilfeldig, ble analysert av FACS for innbinding tilhørighet og spesifisitet. De testet rangeres i Sarkes et al. 2016 1 og de øverste 5 permer fra denne analysen er vist i figur 6B, med konsensus sekvensen bestemt på å være FWDTWF, vist i figur 5C.

En tilsvarende analyse av bindende affinitet for gjenta peptid sekvenser i runde 4 av biopanning for peptider som gjenkjenner PA målet avslørt at de beste bindemidler, som forholdet mellom PA-488 nMFI:SAPE nMFI, inneholdt WXCFTC konsensus eller lignende sekvens (tabell 1). Bruker dette forholdet, sekvenser selv organisert i de som inneholdt konsensus og de som ikke. Øverste kandidatene, alle inneholder sekvenser knyttet til konsensus, ble analysert tilsvarende til metodene beskrevet ovenfor for abrax i figur 6, som presenteres i Sarkes et al. 2015 14. Disse resultatene viser at for noen mål, analyse av peptider med gjentatte sekvenser kan være tilstrekkelig å få dokumentordnere med betydelig affinitet og spesifisitet for et valgt mål, og å finne en konsensus sekvens som kan være, i seg selv tilstrekkelig for bindingen. Vær oppmerksom på at antall gjentakelser ikke gjenspeiler nødvendigvis den relative forpliktende tilhørighet for mål av interesse (tabell 1). Når analyse av gjentatte sekvenser alene ikke er tilstrekkelig til å fastslå et mønster, er det nyttig å veksle mellom sekvens analyse og bindende analyse å innskrenke utvalget av kandidater og reexamine trender blant de kandidatene med høyere affinitet . Selv når en trend er observert fra analysere gjentatte sekvenser alene, kan flere gjentatt sekvenser vise samme trender eller andre trender, ved nærmere undersøkelse.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av biopanning protokollen for bakteriell skjerm biblioteker. Som illustrert her, biopanning bakteriell skjerm biblioteker er en syklisk prosess. Hver celle i bakteriell vise biblioteket inneholder (se tabell av materialer) plasmider DNA som beholdes som cellene dyrkes i nærvær av antibiotika som plasmider inneholder en motstand genet (choloramphenicol i dette tilfellet). Hver plasmider koder også vise stillaset protein som eksponerer et tilfeldig peptid på utsiden av cellen. Siden hver celle bare inneholde en enkelt plasmider DNA sekvens, bør hver celle bare vise et enkelt peptid, flere steder i cellemembranen. Avhengig av biblioteket mangfold i starten av biopanning og etter hver sortering runde, DNA sekvensen kan eller kan være ikke unike fra celle til celle. Biopanning begynner med vekst og induksjon av cellen biblioteket vise individuelle peptider ytre membran. Disse peptider kan samhandle med et mål protein (som er biotinylated eller annet merket for opptak). For magnetisk-aktivert celle sortering (MCS), ubundet protein fjernes og cellene er ruges med magnetiske perler som er belagt med en fange protein (streptavidin i dette eksemplet, som har en sterk interaksjon med biotin). Hele kultur er så utsatt for en magnet skille bundet celler fra ubundet celler. Bruker en automatisert magnetiske sortering enhet er foretrukket for cellen separasjon å redusere falske positiver. Illustrert her er en positiv form, der cellene som er bundet til og co elute med magnetiske perler beholdes. For en negativ sort, som vi utfører vanligvis foran, er prosessen det samme bortsett fra at cellene som blir vasket av de magnetiske perlene beholdes i stedet. Biblioteket brøkdel av interesse, bundet (positiv type) eller ubundet (negativ sort), er vokst over natten og brukes i neste runde av sortering. Hver påfølgende runde av positiv biopanning krever en nedgang i konsentrasjon og perle målvolumet å forbedre stringens. Etter hver runde i biopanning, er tilhørighet og spesifisitet av peptider for mål-protein vurdert bruke fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS) til å avgjøre når du skal stoppe biopanning og start gransker enkelte kandidatene. Nødvendig DNA sekvensering og peptid sekvens analyse er utført. Følgende analyse kan være i seg selv en syklisk prosess, spesielt for å avsløre trender i individuelle isolert etter siste runde av biopanning. Foreløpig er peptid sekvens trender og/eller konsensus korrelert med bindende tilhørighet og spesifisitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eksempeldata for FACS analyse av sortering runder: PA målet. Bindende affinitet som bestemmes av FACS vises etter 4 runder med biopanning (positiv type) den valgte bakteriell vise biblioteket for peptider binding til målet, beskyttende antigen (PA). Dette ble utført etter først å ha utført en negativ slag mot streptavidin-belagt magnetiske perler. For binding vurdering, celler ble indusert med 0,4% L-arabinose i 90 minutter før inkubasjon med målet og kontroll løsninger og analysere av FACS. Bindende affinitet analyse for det tiltenkte målet er innrammet i rødt. Vist her er scatter tomter av FITC-A vs FSC-A og verdiene for prosent celler bundet (sammenlignet med gated negative kontrollen inkubert med PBS alene) og normalisert median fluorescens intensitet (nMFI, sammenlignet med peptid uten negativ kontroll inkubert med samme fluorophore-merket protein) indusert celler som var ruges i 45 min med: PBS buffer alene, 150 nM YPet Mona (positiv kontroll peptid uttrykk) eller 250 nM PA-488 (merket mål). Merk den økende berikelse i bindingen affinitet for målet rundt etter hver runde i biopanning. I motsetning til Figur 3fullført alle autoMCS celle separasjoner bruker programmet Posselds. En del av disse dataene kan også visualiseres scatter tomter FITC-H vs FSC-H i Sarkes et al. 2015 14 for sammenligning til den FITC-A vs FSC-A tomter vises her. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksempeldata for FACS analyse av sortering runder: abrax målet. På samme måte som figur 2, vist her er komparativ forpliktende tilhørighet til en komplett biopanning eksperimentet, som bestemmes av FACS. Bakteriell vise biblioteket ble utsatt for negative sortering mot streptavidin-belagt magnetiske perler, som i figur 2, men ble deretter utsatt for en ekstra runde av negative sortering mot et homologe protein med liknende struktur og funksjonen, rivax, før du utfører 4 omg med positiv biopanning for peptider binding til det tiltenkte målet, abrax. For binding vurdering, celler ble indusert med 0,4% L-arabinose for 45 min før binde til målet, positiv kontroll og negative kontroller og lese på FACS. Bindende affinitet for det tiltenkte målet er innrammet i rødt. Vist her er scatter tomter av FITC-A vs FSC-en (eller PE-A vs FSC-A ved SAPE) verdier for prosent celler bundet (sammenlignet med gated negative kontrollen inkubert med PBS alene) og nMFI av indusert celler som var ruges i 45 min med : PBS buffer alene, 150 nM YPet Mona (positiv kontroll peptid uttrykk), 250 nM Abrax-488 (merket protein mål), 250 nM Rivax-488 (merket potensielle cross-reactive protein mål) eller 250 nM SAPE (negativ kontroll for direkte tilknytning til streptavidin-belagt magnetiske perler). Merk den økende berikelse i forpliktende tilhørighet for mål av interesse, abrax, etter hver runde i biopanning, og minimal forpliktende tilhørighet for samme protein, rivax. I motsetning til figur 2, positiv biopanning runde 1 ble utført autoMCS Posselds programmet mens påfølgende sortering runder fullført bruke programmet Posseld, som foreslått for biopanning i dette manuskriptet. Denne informasjonen kan også bli visualisert scatter tomter FITC-H vs FSC-H i Sarkes et al. 2016 15 for sammenligning til den FITC-A vs FSC-A tomter vises her. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempel sekvens analyse tilkobling med "eCPX_Sequencing" makro. Vist er et skjermbilde av 48 sekvensert kolonier runde 4 av biopanning valgte bakteriell Vis biblioteket for PA dokumentordnere med metoden Posselds. "Tabell" arket er vist her. Merk at koloniene ble regnet i alfabetisk rekkefølge til angitt filnavn under sekvensering prosessen og at boksene rundt sekvenser som gjentar minst en gang markeres i forskjellige farger for lettere dataanalyse. Makroen eCPX_Sequencing tilbys som en Utdypende kodefil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: sekvens justering og konsensus besluttsomhet for to forskjellige protein mål. Alle bilder vises her ble generert ved hjelp av Jalview programvare med Clustal_X fargelegging etter justere sekvenser ved hjelp av Kalign online analyse programvare 51. A) justering gjentatte sekvenser fra PA biopanning runde 4 (tilsvarer tabell 1). B) justering gjentatte sekvenser fra abrax biopanning runde 4 (tilsvarer figur 6A). C) justeringen av topp 5 kandidater fra abrax biopanning 4.omg, som bestemmes av FACS analyse av enkelte kandidatene (tilsvarer figur 6B). Den røde linjen understreker konsensus sekvensen i A og C, mens den lilla linjen i B understreker forløperen til konsensus sekvensen bestemt for abrax binding når undersøke gjentatte sekvenser, fremhever potensialet trenger å teste forpliktende tilhørighet bruke FACS før en konsensus kan bestemmes i noen tilfeller. Lignende justeringer generert med analyseprogramvare kan sees i Sarkes et al. 2015 14 og Sarkes et al. 2016 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: eksempel forpliktende tilhørighet og spesifisitet for enkelte kandidatene analysert ved hjelp av FACS. Vist her er normalisert median fluorescens intensiteten (nMFI) bestemmes ved hjelp av FACS for A) gjentatte sekvenser og B) i topp 5 kandidater, som bestemmes av komparative forpliktende tilhørighet for målet, abrax, fra runde 4 av biopanning. Dataene representerer gjennomsnittet (barer) og standardavviket (feilfelt) tre uavhengige Repliker eksperimenter. Merk at alle kandidater vist er ganske spesifikk for abrax (abrax-488, grønne barer) over en samme protein, rivax (Rivax-488, røde barer), og streptavidin negative kontrollen (SAPE, svarte). Selv om to av gjentatte sekvenser (AX-07 og AX-15) var også blant de topp 5 kandidatene i B kan sammenligning av resultatene i A og B viser at analyse av gjentatte sekvenser alene ikke være nok til å isolere de høyeste affinitet peptidene. Dataene som vises her ble Sarkes et al. 2016 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: forholdet mellom bestemte binding til uspesifisert bindingen for enkelte gjenta kandidatene. I dette eksemplet vises antall gjentatte sekvenser og forholdet mellom PA (mål) nMFI til SAPE (negativ kontroll) nMFI for gjentatt kandidat sekvenser fra PA biopanning runde 4. Dataene ble sortert etter relativ PA nMFI:SAPE nMFI forhold og analysert for kjente WXCFTC konsensus, eller en lignende rekkefølge, som er vist i fet skrift og understreket. Legg merke til at sekvensene selv organisere slik at de kandidatene med konsensus har den høyeste PA nMFI:SAPE nMFI forholdet, og derfor samhandle mer spesifikt med målet. Resultatene som vises er fra ett enkelt FACS eksperiment. Peptider med lavest affinitet til målet ble ekskludert fra den ekstra gjentak og analyse som ble publisert i Sarkes et al. 2015 14.

Suppplemental fil 1: Klikk her for å laste ned denne filen.

Suppplemental filen 2: Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Biopanning bakteriell skjerm biblioteker har vært en vellykket tilnærming til isolering av affinitet reagenser, og peptider tilbyr et nyttig alternativ til antistoffer for anerkjennelse når bestemte kriterier, for eksempel stabilitet i ekstreme miljøer. Biopanning av disse bibliotekene har blitt strømlinjeformet med autoMCS-metodene som er beskrevet her, og en kommersielt tilgjengelig autoMCS plattform utvider denne teknologien til et mye større publikum. I forhold til tradisjonelle vekslende MCS/FACS Sorteringsmetodene for bakteriell viser biblioteker, autoMCS metoder er billigere fordi de ikke krever investeringer i en dyrere FACS instrument sortering og isolere bundet cellene, i stedet for typen flyt cytometer som brukes her som er bare i stand til analyse 14. Kritisk trinnene for vellykket biopanning ved autoMCS inkluderer separasjon favorittprogram, negative sortering mot potensielle kors-reaktantene å redusere falske positiver, overvåking biblioteket berikelse bruker FACS for å avgjøre når du skal stoppe biopanning, og Smart analyse av kandidaten å unngå tungvint screening av hundrevis av kandidater.

Eksemplene beskrevet her viser vellykkede biopanning av valgte bakteriell skjerm bibliotek for to separate mål, PA og abrax, men med litt annerledes analysen strategier skyldes forskjeller i peptid sekvenser for hvert utvalg av kandidater etter fire runder av biopanning. PA var enkel tilfelle, sekvens analyse demonstrere klare trender fra peptid sekvensene som gjentatt minst en gang i 144 kolonier. Dette var alene nok til å bestemme en konsensus sekvens for PA mål, og de koloniene som inneholdt konsensus eller en lignende sekvens var de beste kandidatene i forholdet mellom binding til PA versus bindingen til kontrollen streptavidin negativ. Men vil dette ikke alltid være tilfelle. For abrax målet, sekvensering 100 kolonier førte til fem gjentatte sekvenser, men trenden i disse sekvensene var mindre klar enn en tendens til å inneholde aromatiske aminosyre rester og aspartic syre eller asparagine. Den anslåtte "konsensus" fra gjentatte sekvenser bare kunne er produsert og testet for affinitet til abrax, men siden ingen overordnet sekvenser inneholdt eksakte konsensus sekvensen, vi tilbake til listen over sekvensert kolonier og observert at andre kandidater som hadde mer trender til felles. Faktisk inneholdt to koloniene en lignende sekvens til "konsensus" fra gjentakelser alene, (FWDTWF stedet for FWAWF), som hadde den samme trenden av tryptofan, fenylalanin, aspartic syre og rester, men med ulik avstand. En av disse peptider var en rekkefølge for repetisjon, var ikke. Disse to sekvenser, sammen med en tredje sekvensen som inneholder en lignende variant, var blant de topp 5 bindemidler testet i affinitet for abrax. Topp dokumentordneren samlet AX-A05, vises også lignende trender. Resultatene for abrax viser at tilnærming som veksler flere ganger mellom sekvens analyse og tilhørighet og spesifisitet analyse vil noen ganger være nødvendig avhengig av det valgte målet. Resultatene for abrax målet også viser graden av spesifisitet som kan oppnås over et ligner protein (rivax 1,15).

AutoMCS programmene valgt for våre studier var Posselds og Posseld, som begge for positiv utvalg av merket målcellene med lav frekvens, mindre enn 5% av befolkningen første. I begge tilfeller passere celler gjennom to magnetiske kolonner. Ved Posselds programmet, men passere celler sakte den første kolonnen til å øke eksponeringen tiden 41. I tillegg til programmet beskrivelsen gitt av produsenten av kommersielle autoMCS enheten (se Materialer tabell) 41, disse programmene ble valgt etter en innledende sammenligning av flere potensielle programmer. Hver programmets evne til å unngå trekke ut falske positiver fra en homogen kultur negativ kontroll celler, og med hell isolere kjent dokumentordneren til et mål av interesse fra en blandet kultur som inneholder negativ kontroll cellene spiked med en synkende prosentandel av kjente dokumentordneren ble sammenlignet. Hvis betydelig avvik fra programmene beskrevet her, kan en lignende sammenligning være nyttig i programmet utvalg for det nye programmet. Men tidligere publisert resultatene sammenligne disse to programmene (Posseld og Posselds) for isolering av peptid affinitet reagenser for PA viste at bruker en av disse programmene for alle fire budrunder biopanning førte til isolering av peptider med lignende tilhørighet og spesifisitet for PA og fastsetting av WXCFTC konsensus. De viktigste forskjellene var at Posseld, med sin raskere strømningsrate, sortert raskere og bindende affinitet for målet var derfor høyere etter to runder med biopanning, mens ved hjelp av Posselds førte til flere unike sekvenser etter fire runder med biopanning 14. lære fra dette, strategien ble endret litt når biopanning for abrax innbindingen peptider å innlemme både fordeler: Posselds ble brukt til runde 1 for å gi mer eksponeringstid under denne viktige skritt der mangfold er høyest, men da det programmet ble byttet til Posseld for raskere isolering av de høyeste affinitet bindemidler under runder 2-4 1,15. Dette viste seg å være ideell for abrax, spesielt siden den nMFI og prosent bindende var både høyere for abrax sortering 4.omg sammenlignet med PA sortering 4.omg med enten program (figur 2 og Figur 3 og Sarkes et al. 2015 14), men en direkte sammenligning med en strategi versus den andre med samme mål ville være nødvendig for en mer avgjørende sammenligning. Hvilket program er best for en bestemt applikasjon kan avhenge personlige mål og sortering biblioteket brukes nivået av peptid uttrykk som oppnås med endringer i betingelsene beskrevet her.

Ikke diskutert her er potensielle resultater fra biopanning abiotiske materiale, men vi har også brukt samme bakteriell Vis biblioteket for biopanning mot bulk aluminium 2. Denne studien ble ikke utført med autoMCS, men lignende studier kan oppnås med autoMCS hvis materialet er tilgjengelig på, eller kan være belagt på eller konjugert til en magnetisk perle. I bulk aluminium studien var personlige aminosyre analyse og sekundær modellering nyttig i å forstå hva kjørte den forpliktende tilhørighet av isolerte peptider, siden ingen konsensus sekvensen var bestemt 2. Selv med biologiske mål, kan dette være nødvendig å forstå hva som driver den forpliktende tilhørighet for noen mål, som er grunnen til regnearket generert fra makroen "eCPX_Sequencing" inneholder en kategori med personlige rester frekvensanalyse. Hvis ingen gjentatte sekvenser er sett i tillegg til manglende konsensus, og rester frekvens viser ingen mønster, men kan andre typer analyse være nødvendig. I tillegg kan videre sortering runder være nødvendig å unngå screening et mye større antall kandidater for ned-utvalg av de med tilstrekkelig affinitet til ønsket mål.

Med den økende tilgjengeligheten av neste generasjons sekvensering, kunne en grundigere studie utføres til å bestemme den mest lovende kandidat før testing affinitet og bestemme omfanget av berikelse etter hver runde i biopanning. Men må sekvenser flytte til bindende analyse trinn opprettes på nytt ved kloning, hvis de ikke er av høy nok frekvens lett isolere med rutinemessig kolonien sekvensering av titalls eller hundrevis av kolonier. Som denne teknologiutviklingen, blir rimeligere og mer rutinemessig, og spesielt med mulighet for kolonien isolasjon, vil det trolig være den beste måten å analysere biopanning data. Det kan føre til utviklingen av den måten enkelte sekvenser, og hele biblioteket, utvikle seg. I tillegg kan bakterier i sortering biblioteket mutere over tid, som kunne lede sortering mot celler med raskere vekst eller bakterier som overexpress genomisk proteiner kunne binde et materiale selv uten skjerm stillaset og peptid uttrykk for forekomst. Derfor når lovende kandidater dukker opp, er det verdt å isolere plasmider DNA, retransforming fersk E. coli, og bekrefter peptid binding via FACS. Hvis du skal bruke peptid i celle-fri format, bør affinitet også vurderes for den gratis peptid. For eksempel ble peptid affinitet reagenser oppdaget gjennom bakteriell skjerm for målet SEB syntetisk produsert av cellen og analysert av mer tradisjonelle metoder som enzym knyttet immunosorbant analysen (ELISA), og på-cellen (via FACS) og av-celle (via ELISA) affinitet ble sammenlignet med Kds bestemmes av begge metoder 7.

Selv om styrken av biotin-streptavidin interaksjon gjør det en perfekt strategi for fange av protein mål og bundet peptider, kan denne prosedyren endres for andre fange strategier. Direkte kobling protein magnetiske perler, som epoxy og karboksylsyre perler, har vært vellykket og fjerner en bindende trinn. Direkte vedlegg kan imidlertid hindre potensielle bindende områder i en bestemt eller ikke-spesifikk måte, avhengig av vedlegg strategi. En ekstra fordel å bruke streptavidin perler er at mindre stabil protein mål kan være fersk biotinylated på 30 min eller lagret frosset, hvis nødvendig, mens perlene seg gjerne krever lengre inkubasjon med protein for cross-linking og vanligvis lagret på 2-8° C. Den foreslåtte starte konsentrasjonen av biotinylated protein mål her, 600 nM, har vært vellykket for flere mål, men det kan være mulig å isolere peptid fange reagenser med økt affinitet Hvis denne konsentrasjonen er redusert. I tillegg kan denne metoden være utvidet til og endret til andre bakterielle skjerm og andre organismer. Denne fremgangsmåten kan for eksempel utføres i fravær av oksygen for bruk med anaerobes eller i andre miljøer for bruk med extremophiles å isolere peptider med unike egenskaper. Peptider og/eller konsensus bestemt for et bestemt mål av interesse kan være potensielt brukt på celler som en levende materiale eller produsert syntetisk av celler. Syntetisk peptider kan være mer modnet for utvikling av enda høyere affinitet og mer robust Protein katalysert fange (PCC) agenter for bruk i sensorer eller andre programmer der ville antistoffer som vanligvis brukes for binding eller anerkjennelse 38,55. Molekylær modellering kan også brukes til å avgjøre binding av peptid med målet, som nylig ble utført for abrax innbindingen peptider og konsensus oppført i figur 5C 1. Samlet biopanning bakteriell skjerm biblioteker for peptid affinitet reagenser er en rask, enkel og kraftig alternativ til produksjon av antistoffer for anerkjennelse og påvisning av protein mål, og denne semi-automatisert biopanning tilnærming har produsert pålitelige resultater med vidtrekkende applikasjoner.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra US Army Research Laboratory (ARL) Postdoctoral Fellowship Program, administrert av Oak Ridge tilknyttet universitetene gjennom en kontrakt med ARL, gjennom utnevnelsen av Dr. Justin P. Jahnke. Gjenværende midler ble gitt av sensorer og elektron enheter Direktoratet på ARL. Forfatterne vil også gjerne takke Daugherty laboratoriet UCSB for deling bakteriell vise biblioteket og informasjon for kloning YPet Mona reagens, Dr. Bryn Adams for støtte i kloning YPet Mona reagensen ARL, Dr. Joshua Kogot for sitt innledende arbeid på og opplæring i biopanning av bakteriell vise biblioteker, Alena rolige av Edgewood kjemiske og biologiske Center for deling plasmider brukes til å uttrykke og rense abrax og rivax proteiner, Brandi Dorsey kundestøtte for isolering av PA bindende peptider, Qin Guo kundestøtte foreløpige eksperimenter for isolering av abrax binding peptider og Dr. Jessica Terrell for nyttig diskusjoner om dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545 Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB) Fisher Scientific BP1426-500 Growth medium
Chloramphenicol Fisher BioReagents BP904-100 Antibiotic
Agar Fisher Scientific BP2641-500 Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library Cytomx Therapeutics N/A; http://cytomx.com/contact/ On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose Sigma A3256-500G Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) Amresco 0780-10L Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh Thermo Scientific PI21327 Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific PI28005 Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads Invitrogen 65601 Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9647-100G Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose Sigma G8270-1KG Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona UCSB and ARL N/A Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester Thermo Scientific 46403 For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) Thermo Scientific S866 Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow Becton, Dickinson, and Company 342003 Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns Miltenyi Biotech 130-021-101 For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer Miltenyi Biotech 130-091-221 For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution Miltenyi Biotech 130-092-987 For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol VWR E505-4L Decontamination of autoMACS
Glycerol Sigma G6279-1L For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack Miltenyi Biotec 130-092-952 For MACS Separation
BD FACSCanto II Becton, Dickinson, and Company 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software Becton, Dickinson, and Company 659523 For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator Thermo Scientific A13346 Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing Genewiz N/A; https://www.genewiz.com/ DNA and Colony Sequencing Services
Excel Microsoft 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA) List Biological Laboratories, Inc. 171 Target protein used as example for representative results.
Abrax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sarkes, D. A., Hurley, M. M., Stratis-Cullum, D. N. Unraveling the Roots of Selectivity of Peptide Affinity Reagents for Structurally Similar Ribosomal Inactivating Protein Derivatives. Molecules. 21 (11), 1504 (2016).
  2. Adams, B. L., Finch, A. S., Hurley, M. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N. Genetically Engineered Peptides for Inorganics: Study of an Unconstrained Bacterial Display Technology and Bulk Aluminum Alloy. Adv. Mater. 25 (33), 4585-4591 (2013).
  3. Bessette, P. H., Rice, J. J., Daugherty, P. S. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Des. Sel. 17 (10), 731-739 (2004).
  4. Daugherty, P. S. Protein engineering with bacterial display. Curr. Opin. Struct. Biol. 17 (4), 474-480 (2007).
  5. Getz, J. A., Schoep, T. D., Daugherty, P. S. Peptide Discovery Using Bacterial Display and Flow Cytometry. Methods Enzymol. 503, 75 (2012).
  6. Kenrick, S. A., Daugherty, P. S. Bacterial display enables efficient and quantitative peptide affinity maturation. Protein Eng. Des. Sel. 23, 9-17 (2010).
  7. Kogot, J. M., et al. Screening and characterization of anti-SEB peptides using a bacterial display library and microfluidic magnetic sorting. J. Mol. Recognit. 27 (12), 739-745 (2014).
  8. Kogot, J. M., Pennington, J. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N., Pellegrino, P. M. Population Enrichment and Isolation with Magnetic Sorting, DTIC Document No. ARL-TN-0452. Report No. ARL-TN-0452. , US Army Research Laboratory, Sensors and Electron Devices Directorate. Adelphi, MD. (2011).
  9. Kogot, J. M. Screening of peptide libraries against protective antigen of Bacillus anthracis in a disposable microfluidic cartridge. PLOS ONE. 6 (11), e26925 (2011).
  10. Little, L. E., Dane, K. Y., Daugherty, P. S., Healy, K. E., Schaffer, D. V. Exploiting bacterial peptide display technology to engineer biomaterials for neural stem cell culture. Biomaterials. 32 (6), 1484-1494 (2011).
  11. Pennington, J. M., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Pellegrino, P. M., Stratis-Cullum, D. N. Isolation and characterization of anti-SEB peptides using magnetic sorting and bacterial peptide display library technology. SPIE Defense, Security, and Sensing. 83581Z-1-83581Z-6 International Society for Optics and Photonics. , (2012).
  12. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Eng. Des. Sel. 21 (7), 435-442 (2008).
  13. Rice, J. J., Schohn, A., Bessette, P. H., Boulware, K. T., Daugherty, P. S. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Sci. 15 (4), 825-836 (2006).
  14. Sarkes, D. A., Dorsey, B. L., Finch, A. S., Stratis-Cullum, D. N. Method for Discovery of Peptide Reagents Using a Commercial Magnetic Separation Platform and Bacterial Cell Surface Display Technology. J. Anal. Bioanal. Tech. 6 (4), 1 (2015).
  15. Sarkes, D. A. Rapid discovery of peptide capture candidates with demonstrated specificity for structurally similar toxins. SPIE Commercial+ Scientific Sensing and Imaging. 986305-1-986305-10 International Society for Optics and Photonics. , (2016).
  16. Stratis-Cullum, D., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Val-Addo, I., Pellegrino, P. M. Chapter 30, Bacterial display peptides for use in biosensing applications. On Biomimetics. Pramatarova, L. , InTech. 629-642 (2011).
  17. Stratis-Cullum, D. N., Finch, A. S. Current Trends in Ubiquitous Biosensing. J. Anal. Bioanal. Tech. S7 (009), (2013).
  18. Rockberg, J., Löfblom, J., Hjelm, B., Uhlén, M., Ståhl, S. Epitope mapping of antibodies using bacterial surface display. Nature Methods. 5 (12), 1039-1045 (2008).
  19. Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L., Georgiou, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10444-10448 (1993).
  20. Georgiou, G. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15 (1), 29-34 (1997).
  21. Löfblom, J., Wernérus, H., Ståhl, S. Fine affinity discrimination by normalized fluorescence activated cell sorting in staphylococcal surface display. FEMS Microbiol. Lett. 248 (2), 189-198 (2005).
  22. Kjærgaard, K., Sørensen, J. K., Schembri, M. A., Klemm, P. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl. Environ. Microbiol. 66 (1), 10-14 (2000).
  23. Kishimoto, J., Fukuma, Y., Mizuno, A., Nemoto, T. K. Identification of the pentapeptide constituting a dominant epitope common to all eukaryotic heat shock protein 90 molecular chaperones. Cell stress & chaperones. 10 (4), 296-311 (2005).
  24. Westerlund-Wikström, B. Peptide display on bacterial flagella: principles and applications. International journal of medical microbiology. 290 (3), 223-230 (2000).
  25. Gaskin, D. J., Starck, K., Turner, N. A., Vulfson, E. N. Phage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification. Enzyme Microb. Technol. 28 (9), 766-772 (2001).
  26. Goldman, E. R. Phage-displayed peptides as biosensor reagents. J. Mol. Recognit. 13 (6), 382-387 (2000).
  27. Boder, E. T., Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15 (6), 553-557 (1997).
  28. Cherf, G. M., Cochran, J. R. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications. , 155-175 (2015).
  29. London, N., Movshovitz-Attias, D., Schueler-Furman, O. The structural basis of peptide-protein binding strategies. Structure. 18 (2), 188-199 (2010).
  30. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  31. Jahnke, J. P., Terrell, J. L., Smith, A. M., Cheng, X., Stratis-Cullum, D. N. Influences of Adhesion Variability on the "Living" Dynamics of Filamentous Bacteria in Microfluidic Channels. Molecules. 21 (8), 985 (2016).
  32. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature materials. 13 (5), 515-523 (2014).
  33. Löfblom, J., Frejd, F. Y., Ståhl, S. Non-immunoglobulin based protein scaffolds. Current opinion in biotechnology. 22 (6), 843-848 (2011).
  34. Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discov. Today. 9 (12), 525-529 (2004).
  35. Pini, A., Falciani, C., Bracci, L. Branched peptides as therapeutics. Current Protein and Peptide Science. 9 (5), 468-477 (2008).
  36. Gongora-Benitez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. Peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2013).
  37. Coppock, M. B., et al. Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays. SPIE Sensing Technology+ Applications. 910711-1-910711-6 International Society for Optics and Photonics. , (2014).
  38. Coppock, M. B. Protein Catalyzed Capture Agents with Tailored Performance for In Vitro and In Vivo Applications. Peptide Science. , (2016).
  39. Bessette, P. H., Hu, X., Soh, H. T., Daugherty, P. S. Microfluidic library screening for mapping antibody epitopes. Anal. Chem. 79 (5), 2174-2178 (2007).
  40. Chao, G. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1 (2), 755-768 (2006).
  41. Miltenyi Biotec GmbH. autoMACS™ Pro Separator User Manual, Version 1.1. , Miltenyi Biotec GmbH. Bergisch Gladbach, Germany. (2007).
  42. Henriques, S. T., et al. A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry. PLOS ONE. 8 (11), e80474 (2013).
  43. BD FACSCanto II Operator Course Workbook. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  44. BD FACSCanto II Instructions For Use. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  45. Chan, L. Y., Yim, E. K., Choo, A. B. Normalized Median Fluorescence: An Alternative Flow Cytometry Analysis Method for Tracking Human Embryonic Stem Cell States During Differentiation. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (2), 156-165 (2012).
  46. Genewiz. DNA Sequencing Services. , Available from: https://www.genewiz.com/ (2017).
  47. Honegger, A., PluÈckthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. Journal of molecular biology. 309 (3), 657-670 (2001).
  48. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7 (1), 539 (2011).
  49. Lassmann, T., Sonnhammer, E. L. Kalign-an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. BMC bioinformatics. 6 (1), 298 (2005).
  50. EMBL-EBI. Clutal Omega. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (2017).
  51. EMBL-EBI. Kalign. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/ (2017).
  52. Clamp, M., Cuff, J., Searle, S. M., Barton, G. J. The jalview java alignment editor. Bioinformatics. 20 (3), 426-427 (2004).
  53. Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M., Barton, G. J. Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  54. Jalview. , Available from: http://www.jalview.org/Download (2017).
  55. Farrow, B., et al. A chemically synthesized capture agent enables the selective, sensitive, and robust electrochemical detection of anthrax protective antigen. ACS Nano. 7 (10), 9452-9460 (2013).

Tags

Biokjemi problemet 130 bakteriell vise biopanning peptid affinitet reagens autoMACS biosensing
Semi-automatisert Biopanning av bakteriell vise bibliotekene for peptid affinitet reagens oppdagelsen og analyse av resulterende isolerer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sarkes, D. A., Jahnke, J. P.,… More

Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter