Summary
تصوير الحية أداة قوية لدراسة السلوكيات الخلوية في الوقت الحقيقي. هنا، نحن وصف بروتوكول للوقت الفاصل بين الفيديو-مجهرية من خلايا قشرة الدماغ الأولية التي تتيح دراسة تفصيلية لمراحل سنت خلال تطور النسب من الخلايا الجذعية العصبية الأولية للخلايا العصبية متمايزة وإطلاق.
Abstract
أثناء تطوير قشرة الدماغ، تخضع الخلايا السلف عدة جولات من انقسامات الخلية المتماثلة وغير المتماثلة لتوليد جديدة موروث أو الخلايا العصبية بوستميتوتيك. في وقت لاحق، تبديل بعض فروعه لمصير جليوجينيك، إضافة إلى السكان أستروسيتي وأوليجوديندروسيتي. باستخدام الفيديو الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الثقافات الخلية الأولية قشرة الدماغ، من الممكن لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية السيطرة على طريقة تقسيم الخلية ومعلمات دورة الخلية من الخلايا السلف. وبالمثل، يمكن دراسة مصير الخلايا بوستميتوتيك استخدام البروتينات مراسل الفلورسنت الخاصة بخلية أو ما بعد التصوير إيمونوسيتوتشيميستري. الأهم من ذلك، يمكن أن تحلل كل هذه الميزات على مستوى خلية واحدة، يسمح بتحديد المتكفل ملتزمة بتوليد أنواع معينة من الخلايا. يمكن أيضا إجراء التلاعب بالجينات باستخدام تعداء الفيروسية بوساطة، السماح بدراسة الظواهر خلية مستقلة وذاتية الحكم في الخلية. وأخيراً، يسمح استخدام البروتينات الفلورية الانصهار دراسة توزيع المتماثلة وغير المتماثلة للبروتينات المحددة خلال شعبة والترابط مع مصير الخلايا الوليدة. وهنا يصف لنا طريقة الفيديو-الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الصورة موريني خلايا قشرة الدماغ الأولية لما يصل إلى عدة أيام وتحليل طريقة انقسام الخلية، وطول دورة الخلية ومصير الخلايا التي تم إنشاؤها حديثا. ونحن أيضا وصف أسلوب بسيط ترانسفيكت الخلايا السلف، والتي يمكن تطبيقها على التلاعب بالجينات للفائدة أو ببساطة قم بتسمية الخلايا التي تحتوي على بروتينات مراسل.
Introduction
توليد الخلايا الجذعية العصبية (مجلس الأمن القومي) من الخلايا العصبية والخلايا ماكروجليال أثناء تنمية قشرة الدماغ. في وقت مبكر-كورتيكوجينيسيس، الود الخضوع لعدة جولات من انقسام الخلايا المتماثلة، وتوسيع قاعدة السلف. ثم، تقسم الود دون تناسق لتوليد الخلايا العصبية مباشرة أو غير مباشرة من خلال وسيطة1. فقط في منتصف-للتأخر-كورتيكوجينيسيس، المتكفل التبديل إلى توليد astrocytes و oligodendrocytes2،،من34. ومع ذلك، تظل آليات كاملة التي تتحكم في تكاثر الخلايا والتمايز، فضلا عن مساهمة مقيدة بمصير المتكفل بتوليد أنواع فريدة من الخلايا العصبية أو خلايا ماكروجليال مثار نقاش مكثف4،،من56. إمكانات فردية الود القشرية لتوليد الخلايا العصبية وأستروسيتيس وأوليجوديندروسيتيس وقد درس على نطاق واسع في المختبر و في فيفو باستخدام مجموعة متنوعة تقنيات مثل: يعيش التصوير في الثقافات خلية واحدة7،8،9،10،11،،من1213؛ يعيش التصوير في ثقافات عالية الكثافة الثقافات3،،من1415؛ يعيش التصوير في شريحة الثقافات16،،من1718؛ تحليل الاستنساخ باستخدام الفيروسية بوساطة ناقلات الأمراض الوراثية وسم في ثقافات عالية الكثافة14،15،19،،من2021؛ تحليل الاستنساخ في فيفو استخدام لفي22،23،24،25،26،27،،من2829،30،31،،من3233؛ وتحليل الاستنساخ في فيفو استخدام الحيوانات المحورة وراثيا34.
ويقدم كل من هذه التقنيات الإيجابيات والسلبيات. على سبيل المثال، في فيفو تتبع النسب عرضه لفاعلين وتقسيم الأخطاء3، مما يؤدي إلى استنتاجات متضاربة حول إمكانية المتكفل القشرية الفردية. علاوة على ذلك، سواء الدراسات في المختبر و في فيفو تستند إلى العلامات من خلايا السلف في وقت مبكر-النقاط والتحليل اللاحق للأنساب الخلية قد تتأثر بحدوث موت الخلية أثناء تطور النسب35التي لم يتم كشفها. ولذلك، يجب أن تسمح نظام مناسب لتحليل إمكانات الود واحد تحديد كافة الخلايا التي تم إنشاؤها، وكذلك وصف مصائر خلية داخل النسب المناسبة. مزيج من الثقافة الخلية الأولية وتصوير مباشر يوفر هذا الإعداد. استخدام الثقافة وحيدة الخلية ومجهرية الفيديو الوقت الفاصل، أظهرت معبد et al. التبديل في نسب موروث الفردية قشرة الدماغ من الخلايا جليوجينيسيس11. في وقت لاحق، أنها تستخدم نفس النظام لإظهار أن يتم إنشاء أنواع مختلفة من الخلايا العصبية من السلف القشرية واحد12. ومع ذلك، يعرض هذا النظام تحذير هام: فقط 1% فروعه القشرية معزولة في وقت مبكر كورتيكوجينيسيس تولد الحيوانات المستنسخة من ذرية 4 أو أكثر9. بعد إضافة FGF2، زيادة تواتر خلايا توليد خلايا 4 أو أكثر إلى 8-10%9. ومع ذلك فإن هذا الرقم صغير جداً بالنظر إلى أن تقريبا جميع فروعه القشرية التكاثري في هذه المرحلة. وعلاوة على ذلك، لا يمكن استبعاد الآثار المحتملة ل FGF2 على مواصفات مصير36. للالتفاف على هذه القيود، استخدمنا الثقافات الخلية عالية الكثافة التي تدعم انتشار كل البطين (التعبير عن Pax6) وسوبفينتريكولار (التعبير عن Tbr2) المتكفل القشرية15. وعلاوة على ذلك، أظهرت المراقبة في الوقت الحقيقي من هذه الثقافات أن ترد العديد من الميزات لمجلس الأمن القومي نسب التقدم في ظل هذه الظروف، مثل وضع انقسام الخلية، وإطالة دورة الخلية، وإمكانات الخلايا المفردة لتوليد الخلايا العصبية وإطلاق، بين أمور أخرى3،15. في الآونة الأخيرة، استخدمنا أيضا هذا النظام لإظهار أن إشارات كريب يؤثر على بقاء الخلية من الخلايا العصبية في قشرة الدماغ غير ناضجة في الفئران37. وهكذا، ونحن نعتقد أن الوقت الفاصل بين الفيديو-الفحص المجهري لقشرة الدماغ موريني الابتدائي الخلايا التي تزرع بكثافة عالية أداة قوية ويمكن الوصول إليها لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية لتقدم دورة الخلية، ووضع شعبة الخلية وبقاء الخلية وتحديد مصير الخلية. هذا الأخير يمكن إنجاز باستخدام الحيوانات المحورة وراثيا، مما يتيح تحديد مصائر خلية معينة في الوقت الحقيقي38،،من3940 أو استخدام ما بعد التصوير إيمونوسيتوتشيميستري3،38،،من4142.
هنا، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد ثقافة الخلية قشرة الدماغ الأساسي دعم انتشار الود والجيل اللاحق من الخلايا العصبية والخلايا ماكروجليال. نناقش أيضا استخدام تعداء للفيروس بوساطة للتلاعب بالجينات للخلايا الفردية، التي يمكن تحديدها وتعقب على مستوى خلية واحدة باستخدام مجهر الفيديو الوقت الفاصل بين. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة خلايا قشرة الدماغ الأولية المعزولة من البداية إلى نهاية كورتيكوجينيسيس في القوارض، ولكن قد يلزم إدخال تعديلات قليلة وفقا للمرحلة14. الود المعزولة من مصادر أخرى يمكن أن تدرس أيضا استخدام الفحص المجهري الفيديو الوقت الفاصل بين الثقافات في 2D، ولكن ينبغي أن يحدده النظام تثقيف مناسب مقارنة الخلية السلوكيات في المختبر و في فيفو38،43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مراقبة الوقت الحقيقي من خلايا قشرة الدماغ الأولية يسمح تحليل انتشار الخلايا، ووضع تقسيم الخلية وطول دورة الخلية، وتمايز خلية وخلية بقاء3،،من1415،37. الأهم من ذلك، أنها تسمح دراسة الأنساب خلية واحدة، مما يؤدي إلى تحديد المراحل المتوسطة التي سنت خلال التقدم من الود للخلايا العصبية3. وأخيراً، المزيج من هذا النظام الثقافة مع أدوات الهندسة الحيوية للتلاعب بالجينات تقنية قوية لدراسة أثر خلية مستقلة للأهداف المختارة5. يمكن تعديل الطريقة الموضحة هنا لدراسة نسب موروث قشرة الدماغ معزولة في مختلف مراحل النمو14، فضلا عن الود معزولة عن غيرها من مصادر4238،. كما استخدمت أيضا أساليب مماثلة لدراسة الأنساب الخلية في الشبكية النامية41.
هنا، نعرض تجربة بسيطة باستخدام تعداء للفيروس بوساطة لتسمية الخلايا السلف مع بروتين فلوري مراسل. ومع ذلك، يمكن تحقيق أهداف مماثلة لاستخدام النواقل الفيروسية، تعداء الكيميائية/الكهربائية أو الحيوانات المحورة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية تحت سيطرة نوع من الخلايا العصبية المروجين محددة38،39أخرى. يمكن أيضا تطبيق جميع هذه الأساليب للتحكم في التعبير الجيني حمل أو قمع التعبير عن الجينات للفائدة، مما يتيح دراسة الآليات الجزيئية المعنية في الخلايا الجذعية العصبية نسب التقدم15،،من1839. ونتوقع أيضا أن هذا النظام يمكن استخدامها لتقييم مدى اختلاف التعبير مستويات البروتينات محددة تنظم الأمن القومي السلوك والعصبية/ماكروجليال التمايز، مماثلة لما تم إنجازه في نظام المكونة للدم40. أيضا، فإنه قد يساعد على إلقاء الضوء على إمكانات موروث واحد لتوليد الأنساب العصبية منفصلة.
مقارنة بغيرها من التقنيات التي تهدف إلى تصوير الود الثدييات في الحيوانات تعيش أو في شريحة الثقافات، قد الأسلوب الموصوفة هنا بعض المزايا الهامة. أولاً، المنخفضة التكلفة للأسلوب فائدة كبيرة. المجهر المقلوب بسيطة مزودة بإرسالها، ويمكن استخدام المصابيح الفلورية وكاميرا التي تسيطر عليها البرامج المستندة إلى الكمبيوتر الحصول على الصور في 2D الثقافات لتصل إلى عدة أسابيع. ثانيا، أن عدد الحيوانات المستخدمة لهذه التجارب أصغر بكثير من طرق أخرى. ثالثا، النظام يسمح مراقبة دقيقة للظروف البيئية، مما يسمح بتحليل الآثار خلية مستقلة وذاتية الحكم في الخلية غير التلاعب المختلفة. وأخيراً، يمكن ملاحظة خلايا فردية لا لبس فيه لمدة تصل إلى 15 يوما، مما يتيح إعادة دقيقة في أشجار النسب الكبيرة، والتي ليس من الممكن حاليا سواء في قشرة الدماغ شريحة الثقافات أو في الجسم الحي. من ناحية أخرى، قد يقدم النظام العيوب المرتبطة بفقدان الأنسجة المنظمة. ولذلك، نوصي بأن السلوكيات الخلوية الملاحظة في هذه الثقافات 2D ينبغي التأكد من الناحية المثالية بتجارب أخرى في فيفو.
من البيانات السابقة باستخدام هذا النظام وتبين أن دورة الخلية إطالة السلف القشرية في فيفو48 المستنسخة في المختبر15. العصبية وإمكانات جليوجينيك من قشرة الدماغ الفردية هي أيضا تحاكي موروث في نظام الثقافة 2D الموصوفة هنا3. وأخيراً، لاحظ تكاثر الخلايا ونسب إنهاء دورة الخلية في فيفو يمكن أيضا أن تحاكي باستخدام هذه الخلية ثقافة النظام15،18. وبالتالي، نحن نعتقد أن يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية المستزرعة في الشروط الموصوفة في هذا البروتوكول وسيلة قوية وسهلة الاستخدام لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية السيطرة على انتشار الخلايا السلف وتمايز الخلايا الدبقية والخلايا العصبية، ومواصفات مصير الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها المجلس (المجلس الوطني للتنمية Científico ه تكنولوجيا البحار)، الرؤوس (وكالة دي Coordenação دي فترة دي المستوى الأعلى) وفابيرن (Fundação de Amparo تفعل البحوث ريو غراندي دو نورتي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
- Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449 (2015).
- Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76 (2015).
- Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
- Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
- Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
- Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
- Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
- Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
- Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
- Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
- Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
- Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
- Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
- Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
- Schroeder, T.
- Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
- Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
- Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
- Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
- Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
- Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).
