Summary
Live imaging er et kraftfuldt værktøj til at studere cellulær adfærd i realtid. Her, beskriver vi en protokol for time-lapse video-mikroskopi af primære hjernebarken celler, der giver mulighed for en detaljeret gennemgang af de faser, der er vedtaget under lineage progression fra primære neurale stamceller til differentieret neuroner og glia.
Abstract
Under hjernebarken udvikling gennemgå stamceller flere runder af symmetriske og asymmetriske celledelinger til at generere nye ophav eller postmitotic neuroner. Senere, skifte nogle stamfaderen til en gliogenic skæbne, tilføje til astrocyte og oligodendrocyte befolkningerne. Bruge time-lapse video-mikroskopi af primære hjernebarken cellekulturer, er det muligt at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer at kontrollere tilstanden af celledeling og cellecyklus parametre af stamceller. Ligeledes, skæbnen af postmitotic celler kan undersøges ved hjælp af celle-specifikke fluorescerende reporter proteiner eller post imaging immuncytokemi. Endnu vigtigere, kan alle disse funktioner analyseres på én celle-niveau, identifikation af stamfaderen forpligtet til generation af specifikke celletyper. Manipulation af genekspression kan også udføres ved hjælp af viral-medieret Transfektion, giver mulighed for undersøgelse af celle-selvstændig og ikke-celle-selvstændige fænomener. Endelig giver brugen af fusion fluorescerende proteiner studiet af symmetriske og asymmetriske fordeling af udvalgte proteiner under division og korrelation med datterceller skæbne. Her, beskrive vi metoden time-lapse video-mikroskopi billede primære hjernebarken murine celler for op til flere dage og analysere tilstanden af celledeling, celle cyklus længde og skæbne af nyligt genererede celler. Vi beskriver også en enkel metode til at transfect stamceller, der kan anvendes til at manipulere gener af interesse eller simpelthen mærke celler med reporter proteiner.
Introduction
Neurale stamceller (NSC) generere neuroner og macroglial celler under hjernebarken udvikling. På tidlige-corticogenesis, NSCs gennemgå flere runder af symmetrisk celledeling, og udvide stamfader pool. Derefter, NSCs kløft asymmetrisk til at generere neuroner direkte eller indirekte gennem mellemprodukter1. Kun ved skifte midt - til slutningen-corticogenesis, stamfaderen for at generere astrocytes og oligodendrocytes2,3,4. Dog stadig de komplette mekanismer, der styrer celle spredning og differentiering samt bidrag af skæbne-begrænset stamfaderen til generation af unikke typer for neuroner eller macroglial celler af intens debat4,5,6. Enkelte kortikale NSCs potentiale til at generere neuroner, astrocytes og oligodendrocytes er blevet grundigt undersøgt in vitro- og vivo ved hjælp af et utal af teknikker såsom: live imaging i single-cellekulturer7,8,9,10,11,12,13; Live billedbehandling i high-density kulturer kulturer3,14,15. Live billedbehandling i Skive kulturer16,17,18; klonede analyse ved hjælp af viral vektor-medieret genetiske mærkning i high-density kulturer14,15,19,20,21; klonede analyse i vivo ved hjælp af retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; og klonede analyse i vivo ved hjælp af transgene dyr34.
Hver af disse teknikker præsenterer fordele og ulemper. For eksempel, er i vivo afstamning sporingen modtagelige til overbegreb og opsplitning fejl3, fører til modstridende konklusioner om potentielle af individuelle kortikale stamfaderen. Desuden både in vitro og i vivo undersøgelser baseret på mærkning af stamceller i tidlig tid-punkter og posterior analyse af celle lineages kan være påvirket af uopdaget forekomsten af celledød i løbet af afstamning-progression35. Derfor skal et passende system til at analysere potentialet i enkelt NSCs giver mulighed for identifikation af alle celler genereret, samt passende karakterisering af celle skæbner i slægt. Kombinationen af primære cellekultur- og levende billedbehandling giver denne indstilling. Ved hjælp af enkelt celle kultur og time-lapse video mikroskopi, har tempel et al. vist parameteren i lineage af individuelle hjernebarken ophav fra neurogenese gliogenesis11. Senere, brugte de det samme system til at vise, at forskellige typer for neuroner er genereret fra en enkelt kortikale stamfader12. Men dette system præsenterer en vigtig advarsel: kun 1% af kortikale stamfaderen isoleret på tidlig corticogenesis generere kloner af 4 eller flere afkom9. Efter tilsætning af FGF2, hyppigheden af celler skabe 4 eller flere celler øger til 8-10%9. Dette tal er dog alt for lille, i betragtning af at stort set alle kortikale ophav er proliferativ på dette stadium. Desuden, de potentielle virkninger af FGF2 på skæbne-specifikation kan ikke udelukkes,36. For at omgå disse begrænsninger, vi brugte high-density cellekulturer, der understøtter spredning af både ventrikulære (Pax6-udtryk) og subventricular (Tbr2-udtrykker) kortikale stamfaderen15. Desuden har real-time observation af disse kulturer vist, at flere funktioner i NSC lineage progression er gengivet under disse betingelser, såsom tilstand af celledeling, forlængelse af cellecyklus, potentiale af enkelt celler til at generere neuroner og glia, blandt andet3,15. For nylig, har vi også brugt dette system til at vise, at CREB-signalering påvirker celle overlevelse af umodne hjernebarken neuroner i mus37. Vi mener således, at time-lapse video-mikroskopi af primære murine hjernebarken celler dyrkes i høj tæthed er en kraftfuld og tilgængeligt værktøj til at studere cellulære og molekylære mekanismer af cellecyklus progression, celledeling, celle overlevelse og celle skæbne specifikation. Sidstnævnte kan opnås ved hjælp af transgene dyr, muliggør identificering af specifikke celle skæbner på realtid38,39,40 eller brugen af post imaging immuncytokemi3,38,41,42.
Her, leverer vi en trinvis protokol for at forberede primære hjernebarken cellekultur støtte udbredelsen af NSCs og den efterfølgende generation af neuroner og macroglial celler. Vi diskuterer også brugen af retrovirale-medieret Transfektion at manipulere genekspression af individuelle celler, som kan identificeres og spores på én celle niveau ved hjælp af time-lapse video mikroskopi. Denne protokol kan bruges til at studere primære hjernebarken celler isoleret fra begyndelsen til slutningen af corticogenesis i gnavere, men et par justeringer kan kraeves efter fase14. NSCs isoleret fra andre kilder kan også studeres ved hjælp af time-lapse video mikroskopi af 2D kulturer, men den passende dyrkningsbaserede system bør bestemmes ved at sammenligne celle adfærd i in vitro og i vivo38,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Realtid observation af primære hjernebarken celler giver mulighed for analyse af celleproliferation, celledeling, celle cyklus længde, Celledifferentiering og celle overlevelse3,14,15,37. Endnu vigtigere, giver det studiet af encellede lineages, føre til identifikation af de mellemliggende faser vedtaget under progression fra NSCs til neuroner3. Endelig, kombinationen af denne kultur system med bioteknologiske værktøjer til at manipulere genekspression er en kraftfuld teknik til at studere den celle-selvstændige effekt af udvalgte mål5. Metoden beskrevet her kan ændres for at studere lineage af hjernebarken stamfaderen isoleret på forskellige udviklingsstadier14, samt NSCs isoleret fra andre kilder38,42. Lignende metoder har også været brugt til at studere cellen lineages i udviklingslandene nethinden41.
Her viser vi et simpelt eksperiment ved hjælp af retrovirale-medieret Transfektion til etiketten stamceller med en reporter fluorescerende proteiner. Dog kan lignende mål opnås ved hjælp af andre virale vektorer, kemiske/elektrisk Transfektion eller transgene dyr udtrykke fluorescerende proteiner under kontrol af neurale celletype specifikke initiativtagere38,39. Alle disse metoder til at styre genekspression kan også anvendes til at fremkalde eller undertrykke udtryk af gener af interesse, så studiet af molekylære mekanismer involveret i neurale stamceller lineage progression15,18,39. Vi forudser også, at dette system kan anvendes til at evaluere hvordan forskellige udtryk niveauer af specifikke proteiner regulere NSC adfærd og neuronal/macroglial differentiering, svarende til hvad der er sket i hæmatopoietisk systemet40. Også, kan det hjælpe for at kaste lys over enkelt stamfaderen potentiale til at generere separat neuronal lineages.
Sammenlignet med andre teknikker med henblik på imaging pattedyr NSCs i live-dyr eller i Skive kulturer, har metoden beskrevet her nogle vigtige fordele. For det første er lavpris af metoden en betydelig fordel. Simpel inverterede mikroskoper udstyret med overføres og fluorescens lys og et kamera, der er kontrolleret af computer-baseret software kan bruges til at få billeder af 2D kulturer for op til flere uger. For det andet, antallet af dyr, der anvendes til disse eksperimenter er betydeligt mindre end i andre metoder. For det tredje, systemet tillader en præcis styring af miljøforhold, hvilket gør det muligt analysen af celle-selvstændig og ikke-celle-selvstændige effekter af forskellige manipulationer. Endelig, individuelle celler utvetydigt kan observeres i op til 15 dage, så nøjagtige genopbygningen af stor slægt træer, der ikke er i øjeblikket muligt både i hjernebarken skær kulturer eller in vivo. På den anden side kan systemet præsentere ulemper forbundet med tab af væv organisation. Vi anbefaler derfor, at de cellulære adfærd observeret i disse 2D kulturer ideelt bør bekræftes ved andre forsøg in vivo.
Tidligere data ved hjælp af dette system viser, at cellen cyklus forlængelse af kortikale stamfader i vivo48 er gengivet i vitro15. Den neurogen og gliogenic potentiale af individuelle hjernebarken ophav er også efterlignede i 2D kultur-systemet beskrevet her3. Endelig observeret celleproliferation og cellecyklus exit nøgletal i vivo kan også efterlignes ved hjælp af denne celle kultur system15,18. Vi mener således, at live-imaging af primære hjernebarken celler dyrkes i de i denne protokol beskrevne betingelser er en kraftfuld og brugervenlig metode til at studere cellulære og molekylære mekanismer at kontrollere stamfader celleproliferation, neuronal og glial Celledifferentiering og celle skæbne specifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), KAPPER (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) og FAPERN (Fundação de Amparo en Pesquisa Rio Grande do Norte).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
- Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449 (2015).
- Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76 (2015).
- Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
- Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
- Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
- Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
- Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
- Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
- Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
- Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
- Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
- Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
- Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
- Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
- Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
- Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
- Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
- Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
- Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).
