Summary
Levende imaging is een krachtig hulpmiddel om te studeren van cellulaire gedrag in real-time. Hier beschrijven we een protocol voor time-lapse video-microscopie van primaire hersenschors cellen waarmee een gedetailleerd onderzoek van de fasen die onder de progressie van de bloedlijn van primaire neurale stamcellen gedifferentieerde neuronen en glia werden.
Abstract
Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ondergaan voorlopercellen verschillende rondes van symmetrische en asymmetrische celdelingen voor het genereren van nieuwe progenitoren of postmitotic neuronen. Later, overschakelen enkele progenitoren naar het lot van een gliogenic, toe te voegen aan de Astrocyt en Oligodendrocyt populaties. Met behulp van time-lapse video-microscopie van hersenschors primaire celculturen, is het mogelijk om te bestuderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen beheersen de modus van de celdeling en celcyclus parameters van voorlopercellen. Het lot van postmitotic cellen kan ook worden onderzocht met behulp van fluorescerende verslaggever van de cel-specifieke eiwitten of post imaging immunocytochemie. Wat nog belangrijker is, kunnen al deze functies op het niveau van eencellige, zodat de identificatie van de progenitoren ertoe verbonden de generatie van specifieke celtypes worden geanalyseerd. Manipulatie van genexpressie kan ook worden uitgevoerd met behulp van virale-gemedieerde transfectie, waardoor de studie van cel-zelfstandige en niet-cel-autonome verschijnselen. Ten slotte, staat het gebruik van fusie fluorescerende eiwitten de studie van symmetrische en asymmetrische verdeling van geselecteerde eiwitten tijdens divisie en de correlatie met het lot van de dochtercellen. Hier beschrijven we de time-lapse video-microscopie methode beeld van primaire hersenschors lymfkliertest cellen voor maximaal enkele dagen en analyseren van de modus van de celdeling, lengte van de celcyclus en lot van nieuw gegenereerde cellen. Ook beschrijven we een eenvoudige methode om transfect van voorlopercellen, die kunnen worden toegepast op het manipuleren van genen van belang of gewoon label cellen met verslaggever eiwitten.
Introduction
Neurale stamcellen (NSC) genereren van neuronen en macroglial cellen tijdens de ontwikkeling van de hersenschors. Bij vroege-corticogenesis, NSCs ondergaan verschillende rondes van symmetrische celdeling en vouw het voorlopercellen zwembad. Vervolgens NSCs kloof asymmetrisch voor het genereren van neuronen, direct of indirect via intermediairen1. Alleen op schakelen midden - tot laat-corticogenesis, progenitoren voor het genereren van astrocyten en oligodendrocyten2,3,4 De volledige mechanismen waarmee de celproliferatie en differentiatie, alsmede de bijdrage van de progenitoren lot-beperkt tot de generatie van unieke soorten neuronen of macroglial cellen blijven echter een kwestie van intens debat4,5,6. Het potentieel van individuele corticale NSCs voor het genereren van neuronen, astrocyten en oligodendrocyten geweest uitgebreid bestudeerde in vitro en in vivo met behulp van een groot aantal technieken, zoals: live beeldvorming in eencellige culturen7,8,9,10,11,12,13; Live imaging in high-density culturen culturen3,14,15; Live imaging in segment culturen16,17,18; klonen analyse met behulp van virale vector-gemedieerde genetische labeling van high-density culturen14,15,19,20,21; klonen analyse in vivo met behulp van retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; en het klonen analyse in vivo gebruik van transgene dieren34.
Elk van deze technieken presenteert voors en tegens. Bijvoorbeeld, is in vivo lineage tracering gevoelig voor het samenvoegen en splitsen fouten3, leiden tot tegenstrijdige conclusies over de mogelijkheden van individuele corticale voorlopercellen. Bovendien, zowel in vitro en in vivo studies gebaseerd zijn op de etikettering van voorlopercellen op vroege tijd-punten en posterieure analyse van cel lineages kan worden beïnvloed door het onopgemerkt vóórkomen van celdood tijdens lineage-progressie35. Een geschikt systeem voor het analyseren van de mogelijkheden van één NSCs moet dan ook toe dat de identificatie van alle cellen gegenereerd, alsmede de passende karakterisatie van het lot van de cel binnen de bloedlijn. Combinatie van primaire celculturen en levende imaging biedt deze instelling. Met behulp van eencellige cultuur en tijd-tijdspanne videomicroscopie, tempel et al. is gebleken de schakelaar in de bloedlijn van individuele hersenschors voorlopercellen van neurogenese naar gliogenesis11. Later gebruikte ze hetzelfde systeem om te laten zien dat er verschillende soorten neuronen worden gegenereerd uit een enkele corticale voorlopercellen12. Dit systeem kampt echter met een belangrijk voorbehoud: slechts 1% van de corticale progenitoren geïsoleerd op vroege corticogenesis klonen van 4 of meer nakomelingen9 genereren. Na de toevoeging van FGF2, de frequentie van cellen genereren van 4 of meer cellen loopt tot en met 8-10%9. Dit aantal is echter te klein gezien het feit dat vrijwel alle corticale progenitoren proliferatieve in dit stadium. Worden bovendien, de mogelijke effecten van FGF2 op lot-specificatie kunnen niet uitgesloten36. Om te omzeilen deze beperkingen, gebruikten we high-density celculturen die ondersteuning bieden voor de verspreiding van beide ventriculaire (Pax6-uitdrukken) en subventriculaire (Tbr2-uitdrukken) corticale progenitoren15. Het real-time opvolgen van deze culturen heeft bovendien aangetoond dat verschillende functies van NSC lineage progressie worden gereproduceerd in deze omstandigheden, zoals de wijze van celdeling, verlenging van de celcyclus, potentieel van afzonderlijke cellen voor het genereren van neuronen en glia, o.a.3,15. Meer recentelijk hebben we dit systeem ook gebruikt om te tonen dat CREB signalering gevolgen heeft voor de overleving van de cel van onrijpe hersenschors neuronen in muizen37. Dus, wij zijn van mening dat time-lapse video-microscopie van primaire lymfkliertest hersenschors cellen gekweekt in hoge dichtheid is een krachtige en toegankelijke hulpmiddel om te studeren van cellulaire en moleculaire mechanismen van de celcyclus, de wijze van de celdeling, de overleving van de cel en de cel lot specificatie. De laatste kan worden bereikt met behulp van transgene dieren, zodat de identificatie van specifieke cel lot op real-time38,39,40 of het gebruik van post imaging immunocytochemie3,38,41,42.
Hier bieden we een stapsgewijze protocol ter voorbereiding van de primaire hersenschors celkweek ter ondersteuning van de verspreiding van NSCs en de latere generaties van neuronen en macroglial cellen. Ook bespreken we het gebruik van retrovirale-gemedieerde Transfectie te manipuleren van de genexpressie van afzonderlijke cellen, die kunnen worden geïdentificeerd en getraceerd op het niveau van de eencellige met behulp van de tijd-tijdspanne videomicroscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor het bestuderen van primaire hersenschors cellen geïsoleerd van het begin tot het einde van de corticogenesis in knaagdieren, maar een paar aanpassingen kunnen worden verlangd overeenkomstig de etappe14. NSCs geïsoleerd uit andere bronnen kunnen ook worden bestudeerd met behulp van de tijd-tijdspanne videomicroscopie van 2D culturen, maar de juiste kweken systeem moet worden bepaald door het vergelijken van cel gedrag in vitro en in vivo38,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Real-time observatie van primaire hersenschors cellen kan de analyse van celproliferatie, modus voor celdeling, celdifferentiatie en lengte van de celcyclus cel survival3,14,15,37. Wat nog belangrijker is, maakt het de studie van eencellige lineages, wat leidt tot de identificatie van de tussenliggende fasen vastgesteld tijdens de overgang van NSCs naar neuronen3. Ten slotte, de combinatie van deze cultuur systeem bioengineering hulpprogramma's voor het manipuleren van genexpressie is een krachtige techniek om te bestuderen van de cel-autonome effect van de geselecteerde doelen5. De hier beschreven methode kan worden aangepast voor het bestuderen van de bloedlijn van de hersenschors progenitoren geïsoleerd op verschillende ontwikkelingsstadia14, evenals NSCs geïsoleerd van andere bronnen38,42. Soortgelijke methoden worden ook gebruikt om te studeren cel geslachten in de ontwikkelingslanden netvlies41.
Hier, laten we een eenvoudig experiment retrovirale-gemedieerde transfectie met label voorlopercellen met een verslaggever fluorescent proteïne. Echter kunnen gelijkaardige doelen worden bereikt met behulp van andere virale vectoren, chemische/elektrische transfectie of transgene dieren uiting van fluorescente proteïnen onder de controle van neurale celtype-specifieke initiatiefnemers38,39. Al deze methoden om te controleren van genexpressie kunnen ook worden toegepast om te veroorzaken of het onderdrukken van de expressie van genen van belang, zodat de studie van moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de cel van de stam van de neurale lineage progressie15,18,39. Wij verwachten ook dat dit systeem kan worden gebruikt om te evalueren hoe verschillende expressie niveaus van specifieke eiwitten reguleren NSC gedrag en neuronale/macroglial differentiatie, vergelijkbaar met wat er is gedaan in de hematopoietische systeem40. Het kan ook helpen om licht werpen op het potentieel van één progenitoren voor het genereren van afzonderlijke neuronale lineages.
Vergeleken met andere technieken gericht op imaging zoogdieren NSCs in live-dieren of segment culturen, heeft de hier beschreven methode een aantal belangrijke voordelen. Ten eerste, de lage kosten van de methode is een aanzienlijk voordeel. Eenvoudige omgekeerde microscopen uitgerust met verzonden en fluorescentie lampen en een camera gecontroleerd door computer gebaseerde software kunnen worden gebruikt voor het verwerven van beelden van 2D culturen voor tot enkele weken. Ten tweede, het aantal dieren die worden gebruikt voor deze experimenten is aanzienlijk kleiner dan in andere methoden. Ten derde, het systeem maakt een nauwkeurige controle van milieu-omstandigheden, aldus het toelaat van de analyse van cel-zelfstandige en niet-cel-zelfstandige gevolgen van verschillende manipulaties. Ten slotte, afzonderlijke cellen voor maximaal 15 dagen, waardoor de precieze reconstructie van grote lineage bomen, die op dit moment niet mogelijk zowel in de hersenschors ondubbelzinnig kunnen worden waargenomen slice culturen of in vivo. Aan de andere kant, kan het systeem nadelen verbonden aan het verlies van weefsel organisatie presenteren. Daarom is het raadzaam dat de cellulaire gedrag waargenomen in deze 2D culturen idealiter moeten worden bevestigd door andere experimenten in vivo.
Vorige gegevens met behulp van dit systeem tonen aan dat de cel cyclus verlenging van de corticale voorlopercellen in vivo48 is gereproduceerd in vitro15. De neurogene en gliogenic potentieel van individuele hersenschors progenitoren zijn ook deed in de 2D cultuur systeem hier3beschreven. Ten slotte waargenomen celproliferatie en celcyclus afrit ratio's in vivo kan ook worden geïmiteerd met behulp van deze cel cultuur systeem15,18. Dus, wij zijn van mening dat live-imaging van primaire hersenschors cellen gekweekt in de omstandigheden beschreven in dit protocol is een krachtige en gebruikersvriendelijke methode om te studeren van cellulaire en moleculaire mechanismen beheersen progenitor celproliferatie, neuronale en gliale celdifferentiatie en cel lot specificatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e autonoom), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de interactieve Superior) en FAPERN (Fundação de Amparo een Pesquisa Rio Grande do Norte).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
- Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449 (2015).
- Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76 (2015).
- Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
- Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
- Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
- Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
- Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
- Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
- Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
- Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
- Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
- Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
- Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
- Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
- Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
- Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
- Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
- Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
- Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).
