Summary
L’imagerie Live est un outil puissant pour étudier les comportements cellulaires en temps réel. Nous décrivons ici un protocole pour le Time-lapse vidéo-microscopie des cellules du cortex cérébral primaire qui permet un examen détaillé des phases adoptées au cours de la progression de la lignée du primaire des cellules souches neurales au différenciée des neurones et cellules gliales.
Abstract
Au cours du développement du cortex cérébral, cellules progénitrices subissent plusieurs séries de symétriques et asymétriques des divisions cellulaires pour générer de nouveaux géniteurs ou neurones mitotiques. Plus tard, quelques progéniteurs basculer vers un sort gliogenic, ajoutant à la population astrocyte et oligodendrocyte. À l’aide de Time-lapse vidéo-microscopie des cultures de cellules primaires de cortex cérébral, il est possible d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent le mode de division cellulaire et les paramètres de cycle cellulaire des cellules progénitrices. De même, le sort des cellules postmitotiques peut être examiné à l’aide de protéines spécifiques des cellules fluorescentes journaliste ou études d’imagerie immunocytochimie. Plus important encore, toutes ces caractéristiques peuvent être analysées au niveau unicellulaire, permettant l’identification de cellules souches s’est engagé à la génération de types spécifiques de cellules. Manipulation de l’expression génique peut également être effectuée utilisant virale véhiculée par transfection, permettant l’étude des phénomènes autonome-cellule et cellule-non-autonomes. Enfin, l’utilisation de protéines fluorescentes fusion permet l’étude de la distribution symétrique et asymétrique des protéines sélectionnées au cours de la division et la corrélation avec le destin des cellules-filles. Nous décrivons ici la méthode vidéo-microscopie Time-lapse pour cellules murines primaire cortex cérébral pour plusieurs jours d’images et d’analyser le mode de division cellulaire, longueur du cycle cellulaire et le destin des cellules nouvellement créées. Nous décrivons également une méthode simple pour transfecter de cellules progénitrices, qui peuvent être appliqués pour manipuler les gènes d’intérêt ou simplement étiqueter des cellules avec des protéines de journaliste.
Introduction
Des cellules souches neurales (NSC) générer des neurones et des cellules de macroglial au cours du développement du cortex cérébral. Au début-exocytosis, CNS subissent plusieurs séries de la division cellulaire symétrique et élargir le bassin de l’ancêtre. Ensuite, les CNS divisent asymétriquement pour générer des neurones directement ou indirectement par le biais d’intermédiaires1. Seulement à mi - à fin-exocytosis, progéniteurs commutateur pour générer les astrocytes et oligodendrocytes2,3,4. Cependant, les mécanismes complets qui contrôlent la prolifération cellulaire et la différenciation, ainsi que la contribution des progéniteurs sort restreints à la génération de types uniques de neurones ou cellules macroglial restent un sujet de débat intense4,5,6. Le potentiel des CNS corticales individuels pour générer des neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes a été étudiée in vitro et in vivo à l’aide d’une multitude de techniques telles que : vivre l’imagerie en single-cell cultures7,8,9,10,11,12,13; vivre d’imagerie à haute densité de cultures cultures3,14,15; vivre d’imagerie en tranche cultures16,17,18; clonale analyse virale véhiculée par vector étiquetage génétique dans les cultures à haute densité14,15,19,20,21; analyse clonale in vivo à l’aide de rétrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; et analyse clonale in vivo à l’aide des animaux transgéniques,34.
Chacune de ces techniques présente des avantages et des inconvénients. Par exemple, in vivo le traçage de lignée est sensible à la mettre et fendage erreurs3, aboutissant à des conclusions contradictoires quant au potentiel des progéniteurs corticales individuels. En outre, les études in vitro et in vivo sur l’étiquetage des cellules progénitrices au début-points dans le temps et analyse postérieure des lignages cellulaires peut être influencée par la présence non détectée de mort cellulaire au cours de la lignée-progression35. Par conséquent, un système approprié d’analyser le potentiel des CNS unique doit permettre l’identification de toutes les cellules générées, ainsi que la caractérisation appropriée de destins de cellules au sein de la lignée. Combinaison de culture de cellules primaires et imagerie live fournit ce paramètre. À l’aide de la culture de cellule unique et microscopie vidéo Time-lapse, Temple et coll. ont montré l’interrupteur dans la lignée des progéniteurs individuels cortex cérébral de neurogenèse à gliogenesis11. Plus tard, ils ont utilisé le même système pour montrer que différents types de neurones sont générés à partir un seul ancêtre corticale12. Cependant, ce système présente une mise en garde importante : seulement 1 % des progéniteurs corticales isolées au début exocytosis générer des clones de 4 ou plus de descendance9. Après l’ajout de FGF2, la fréquence des cellules générant 4 ou plusieurs cellules augmente de 8 à 10 %9. Néanmoins, ce nombre est trop petit, étant donné que pratiquement tous les progéniteurs corticales sont prolifératives à ce stade. En outre, les effets potentiels de FGF2 sur sort-cahier des charges n’est pas exclus de36. Pour contourner ces limitations, nous avons utilisé des cultures de cellules haute densité favorisant la prolifération des deux ventriculaire (exprimant le Pax6) et de progéniteurs corticale sous-ventriculaire (exprimant le Tbr2)15. De plus, l’observation en temps réel de ces cultures a montré que plusieurs caractéristiques de la progression de lignée NSC sont reproduits dans ces conditions, tels que le mode de division cellulaire, allongement du cycle cellulaire, des cellules simples susceptibles de générer des neurones et des cellules gliales, entre autres,3,15. Plus récemment, nous avons également utilisé ce système pour montrer que CREB-signalisation affecte la survie cellulaire des neurones immatures cortex cérébral en souris37. Ainsi, nous croyons que Time-lapse vidéo-microscopie de murin du cortex cérébrale primaire les cellules cultivées à haute densité est un outil puissant et accessible afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la progression du cycle cellulaire, le mode de division cellulaire, la survie des cellules et la spécification des cellules sort. Ce dernier peut être réalisé à l’aide d’animaux transgéniques, ce qui permet l’identification des destins cellulaires spécifiques en temps réel38,39,40 ou l’utilisation d’études d’imagerie immunocytochimie3,38,41,42.
Ici, nous fournissons un protocole étape par étape pour préparer la culture cellulaire primaire cortex cérébral soutenant la prolifération des CNS et la génération suivante des neurones et des cellules macroglial. Nous discutons également l’utilisation de la transfection rétrovirale médiation pour manipuler l’expression des gènes des cellules individuelles, qui peuvent être identifiés et suivis au niveau de la cellule unique à l’aide de la microscopie vidéo Time-lapse. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les cellules du cortex cérébral primaire isolés du début à la fin de l’exocytosis chez les rongeurs, mais quelques ajustements peuvent être nécessaires selon l' étape14. CNS isolés provenant d’autres sources peuvent également être étudiés à l’aide de la microscopie vidéo Time-lapse de cultures 2D, mais le système de culture approprié doit être déterminé en comparant les comportements de cellulaire in vitro et in vivode38,43.
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Discussion
Observation en temps réel des cellules du cortex cérébral primaire permet l’analyse de la prolifération cellulaire, le mode de division cellulaire, la longueur du cycle cellulaire, la différenciation cellulaire et cell survival3,14,15,37. Plus important encore, elle permet l’étude des lignées unicellulaires, conduisant à l’identification des phases intermédiaires adoptées au cours de la progression de la CNS à neurones3. Enfin, la combinaison de ce système de culture avec des outils de bio-ingénierie pour manipuler l’expression des gènes est une technique puissante pour étudier l’effet cellulaire autonome des cibles choisies,5. La méthode décrite ici peut être modifiée afin d’étudier la lignée des progéniteurs de cortex cérébral isolés à différents stades de développement14, mais aussi des CNS isolés des autres sources38,42. Des méthodes similaires ont également servis à étudier des lignages cellulaires dans le développement de la rétine41.
Ici, nous montrons une expérience simple à l’aide de transfection rétrovirale médiation pour marquer les cellules progénitrices avec une protéine fluorescente de journaliste. Toutefois, des objectifs similaires peuvent être obtenus, utiliser des vecteurs viraux, transfection chimique/électrique ou autres animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes sous le contrôle du type de cellules neurales spécifiques promoteurs38,39. Toutes ces méthodes pour contrôler l’expression des gènes peuvent également être appliqués afin d’induire ou de supprimer l’expression des gènes d’intérêt, ce qui permet l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la lignée de cellules souches neurales progression15,18,39. Nous prévoyons également que ce système peut être utilisé pour évaluer une expression comment les différents niveaux de protéines spécifiques réglementent la différenciation neuronale/macroglial et de comportement NSC, semblable à ce qui a été fait dans le système hématopoïétique40. En outre, il peut aider à faire la lumière sur le potentiel des progéniteurs unique pour générer des lignées neuronales distinctes.
Par rapport à d’autres techniques visant à imagerie mammifères CNS dans les animaux vivants ou dans les cultures de la tranche, la méthode décrite ici a quelques avantages importants. Tout d’abord, le faible coût de la méthode est un avantage considérable. Des microscopes inversés simples équipés transmis et lumières de fluorescence et d’une caméra contrôlée par logiciel informatique permet d’acquérir des images des cultures 2D pour jusqu'à plusieurs semaines. Deuxièmement, le nombre d’animaux utilisés pour ces expériences est significativement plus petit que dans d’autres méthodes. Troisièmement, le système permet un contrôle précis des conditions environnementales, ce qui permet l’analyse des effets autonome-cellule et cellule-non-autonomes de manipulations différentes. Enfin, les cellules individuelles peuvent être observés sans ambiguïté pendant 15 jours, permettant la reconstruction précise d’arbres de grande lignée, qui n’est actuellement pas possible aussi bien dans le cortex cérébral trancher cultures ou in vivo. En revanche, le système peut présenter des inconvénients liés à la perte de l’organisation tissulaire. Par conséquent, nous recommandons que les comportements cellulaires observées dans ces cultures 2D soient idéalement confirmés par d’autres expériences in vivo.
Les données antérieures à l’aide de ce spectacle de système que la cellule cycle allongement des progéniteurs corticale en vivo48 sont reproduit in vitro15. Le neurogène et gliogenic potentiel de différents cortex cérébral progéniteurs sont également imités dans le système de culture 2D décrite ici3. Enfin, la prolifération des cellules et des ratios de sortie cycle cellulaire observée in vivo peuvent également être imités à l’aide de cette cellule culture système15,18. Ainsi, nous pensons que vivre-imagerie des cellules du cortex cérébral primaire mis en culture dans les conditions décrites dans le présent protocole est une méthode puissante et conviviale pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la prolifération des cellules progénitrices, différenciation des cellules neuronales et gliales et la spécification des cellules sort.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) et FAPERN (Fundação de Amparo Pesquisa do Rio Grande do Norte).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
- Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449 (2015).
- Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76 (2015).
- Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
- Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
- Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
- Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
- Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
- Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
- Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
- Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
- Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
- Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
- Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
- Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
- Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
- Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
- Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
- Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
- Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).
