Summary
Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur zelluläre Verhaltensweisen in Echtzeit zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Time-Lapse Video-Mikroskopie des primären Hirnrinde Zellen, die eine detaillierte Untersuchung der Phasen verordnet während der Linie Weiterentwicklung von primäre neurale Stammzellen zu differenzierten Neuronen und Glia ermöglichen.
Abstract
Während der Großhirnrinde Entwicklung durchlaufen Vorläuferzellen mehrere Runden von symmetrischen und asymmetrischen Zellteilungen, neue Vorfahren oder postmitotischen Neuronen zu generieren. Später wechseln Sie einige Stammväter in ein Gliogenic Schicksal, Hinzufügen der Astrozyten und Oligodendrozyt Bevölkerung. Mit Time-Lapse Video-Mikroskopie von primären Hirnrinde Zellkulturen, ist es möglich, die zellulären und molekularen Mechanismen, die Kontrolle der Zellteilung und Zellzyklus-Parameter der Vorläuferzellen zu studieren. In ähnlicher Weise kann das Schicksal der postmitotischen Zellen mit fluoreszierenden Reporter zellspezifische Proteine oder Post-imaging Immunocytochemistry untersucht werden. Noch wichtiger ist, können alle diese Funktionen Ebene der einzelligen, ermöglicht die Identifizierung von Vorfahren verpflichtet die Generation von bestimmten Zelltypen analysiert werden. Manipulation der gen-Expression kann auch mit viral-vermittelte Transfektion, ermöglicht die Untersuchung der Zelle-autonome und Zelle-nichtautonomen Phänomene durchgeführt werden. Schließlich ermöglicht die Verwendung von fluoreszierenden Fusionsproteine die Studie von symmetrischen und asymmetrischen Verteilung der ausgewählten Proteine während der Teilung und die Korrelation mit dem Schicksal der Tochterzellen. Hier beschreiben wir die Time-Lapse Video-Mikroskopie-Methode, um Bild primären Hirnrinde murinen Zellen für bis zu mehreren Tagen und die Art der Zellteilung, Zellzyklus Länge und Schicksal der neu erzeugten Zellen zu analysieren. Wir beschreiben auch eine einfache Methode um transfizieren Vorläuferzellen, die Gene von Interesse zu manipulieren oder einfach beschriften Zellen mit Reporter Proteine angewendet werden können.
Introduction
Neurale Stammzellen (NSC) generieren Neuronen und Macroglial Zellen während der Entwicklung der Großhirnrinde. Am Anfang-Kortikogenese NSCs durchlaufen mehrere Runden der symmetrischen Zellteilung, und erweitern Sie den Stammvater Pool. Teilen Sie dann die NSCs asymmetrisch um Neuronen direkt oder indirekt über Zwischenprodukte1zu generieren. Nur bei wechseln Mitte - zu spät-Kortikogenese, Stammväter um Astrozyten und Oligodendrozyten2,3,4zu generieren. Die komplette Mechanismen, die Zell-Proliferation und Differenzierung sowie der Beitrag der Schicksal eingeschränkt Stammväter zur Generation der einzigartige Arten von Neuronen oder Macroglial Zellen steuern bleiben jedoch eine Angelegenheit der intensiven Debatte4,5,6. Das Potenzial der einzelnen kortikalen NSCs, Neuronen und Astrozyten, Oligodendrozyten generieren wurde ausgiebig studiert in Vitro und in Vivo mit einer Vielzahl von Techniken wie: live-imaging in einzellige Kulturen7,8,9,10,11,12,13; Live-imaging in hoher Dichte Kulturen Kulturen3,14,15; Live-imaging Slice Kulturen16,17,18; klonale Analyse mit viralen Vektor-vermittelte genetische Kennzeichnung in hoher Dichte Kulturen14,15,19,20,21; klonale Analyse in Vivo mit Retroviren22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; und klonale Analyse in Vivo mit transgenen Tieren34.
Jede dieser Techniken stellt vor- und Nachteile. Zum Beispiel ist in Vivo Linie Ablaufverfolgung anfällig für die ZUSAMMENGEFASSUNG und splitting Fehler3, führt zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen über das Potenzial der einzelnen kortikalen Vorfahren. Darüber hinaus sowohl in Vitro und in Vivo Studien anhand der Kennzeichnung von Vorläuferzellen zu frühen Zeitpunkten und posterior Analyse der Zelle Linien kann durch das unerkannt Auftreten von Zelltod während Abstammung-Progression35beeinflusst werden. Daher darf ein geeignetes System, das Potenzial der einzelnen NSCs zu analysieren die Identifikation aller Zellen generiert sowie die entsprechenden Charakterisierung der Zelle Schicksale innerhalb der Linie. Kombination von primären Zellkulturen und live Imaging ermöglicht diese Einstellung. Mit einzelligen Kultur und Time-Lapse video-Mikroskopie, zeigten Tempel Et Al. den Schalter in der Abstammung der einzelnen Großhirnrinde Stammväter von Neurogenese, Gliogenesis11. Später benutzt sie das gleiche System um zu zeigen, dass verschiedene Arten von Neuronen aus einer einzigen kortikalen Stammvater12generiert werden. Dieses System stellt jedoch eine wichtige Einschränkung: nur 1 % der kortikalen Vorfahren isoliert am frühen Kortikogenese Klone von 4 oder mehr Nachkommen9generieren. Nach der Zugabe von FGF2 erhöht die Frequenz der Zellen, die Erzeugung von 4 oder mehr Zellen auf ca. 8-10 %9. Dennoch ist diese Zahl zu klein, man bedenkt, dass praktisch alle kortikalen Stammväter proliferative in diesem Stadium. Darüber hinaus können nicht die möglichen Auswirkungen der FGF2 auf Schicksal-Spezifikation36auszuschließen. Um diese Einschränkungen zu umgehen, verwendet wir High-Density-Zellkulturen, die unterstützen die Verbreitung beider ventrikuläre (Pax6-Ausdruck) und subventricular (Tbr2-Ausdruck) kortikale Stammväter15. Darüber hinaus hat die Echtzeit-Beobachtung dieser Kulturen gezeigt, dass einige Funktionen der NSC Abstammung Progression unter diesen Bedingungen, wie z. B. Art der Zellteilung, Verlängerung des Zellzyklus, Potenzial einzelner Zellen, Neuronen und Glia, unter anderem zu generieren3,15reproduziert werden. Vor kurzem haben wir auch dieses System verwendet, um zu zeigen, dass das Überleben der Zellen von unreifen Großhirnrinde Neuronen in Mäusen37CREB-Signalisierung beeinflusst werden. So glauben wir, dass Time-Lapse Video-Mikroskopie des primären murinen Großhirnrinde Zellen in hoher Dichte angebaut ist ein leistungsstarkes und zugänglichen Tool, zellulären und molekularen Mechanismen der Zellzyklus Progression, Zellteilung, Überleben der Zellen und Zellen Schicksal Spezifikation zu studieren. Letzteres kann erreicht werden mit transgenen Tieren, so dass die Identifizierung von spezifischen Zelle Schicksale auf Echtzeit38,39,40 oder die Verwendung von Post-imaging Immunocytochemistry3,38,41,42.
Hier bieten wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur primären Hirnrinde Zellkultur Unterstützung der Verbreitung von NSCs und die nachfolgende Generation von Neuronen und Macroglial Zellen vorbereiten. Wir diskutieren auch die Verwendung von Retroviren vermittelte Transfektion, Genexpression einzelner Zellen zu manipulieren, die identifiziert und Ebene der Einzeller mit Time-Lapse video Mikroskopie nachverfolgt werden können. Dieses Protokoll kann zur primären Hirnrinde Zellen isoliert vom Anfang bis zum Ende des Kortikogenese bei Nagetieren zu studieren können, ein paar Anpassungen jedoch nach der Stufe14. NSCs, die isoliert von anderen Quellen können auch mit Time-Lapse video Mikroskopie 2D Kulturen studiert werden, aber das geeignete Kultivierung System festgelegt werden, durch den Vergleich der Zelle Verhalten in Vitro und in Vivo38,43.
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Discussion
Echtzeit-Beobachtung der primären Hirnrinde Zellen ermöglicht die Analyse der Zellproliferation, Zellteilung, Zellzyklus Länge, Zelldifferenzierung und Zelle überleben3,14,15,37. Noch wichtiger ist, ermöglicht es das Studium der einzelligen Abstammungen, führt zur Identifizierung von den Zwischenphasen während der Progression von NSCs auf Neuronen3erlassen. Schließlich ist die Kombination aus diesem Kultursystem Bioengineering Tools zur Genexpression manipulieren eine leistungsstarke Technik, die Zelle-autonome Wirkung der ausgewählten Ziele5zu studieren. Die hier beschriebene Methode kann geändert werden, um die Linie der Großhirnrinde Vorfahren isoliert bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien14sowie NSCs isoliert von anderen Quellen38,42zu studieren. Ähnliche Methoden wurden auch zur Zelle Linien in die Entwicklung der Netzhaut41zu studieren.
Hier zeigen wir ein einfaches Experiment mit retroviralen vermittelte Transfektion Label Vorläuferzellen mit einem Reporter fluoreszierende Protein. Jedoch können ähnliche Ziele mit anderen viralen Vektoren, chemische/elektrische Transfektion oder transgene Tiere mit dem Ausdruck fluoreszierende Proteine unter der Kontrolle von neuronaler Zelltyp-spezifische Promotoren38,39erreicht werden. Alle diese Methoden zur Genexpression kontrollieren können auch angewendet werden, um zu induzieren oder unterdrücken die Expression von Genen von Interesse, so dass die Untersuchung der molekularen Mechanismen beteiligt neurale Stammzellen Linie Fortschreiten15,18,39. Wir sehen auch, dass dieses System verwendet werden kann, wie die verschiedenen Ausdruck auswerten Ebenen spezifischer Proteine regulieren NSC Verhalten und neuronalen/Macroglial Differenzierung, ähnlich wie in den blutbildenden System40geschehen. Außerdem kann es helfen, die Aufschluss über das Potenzial der einzelnen Vorfahren, separate neuronale Linien zu generieren.
Im Vergleich zu anderen Techniken, die darauf abzielen, imaging Säugetiere NSCs in lebende Tiere oder Slice Kulturen, hat die hier beschriebene Methode einige wichtige Vorteile. Erstens ist die Low-Cost der Methode einen signifikanten Vorteil. Einfachen umgekehrte Mikroskopen ausgestattet mit übertragen und Fluoreszenz-Lampen und eine Kamera gesteuert durch Computer-basierte Software können verwendet werden, um Bilder von 2D Kulturen für bis zu mehreren Wochen erwerben. Zweitens ist die Zahl der Versuchstiere für diese Experimente deutlich kleiner als bei anderen Methoden. Drittens, das System ermöglicht eine präzise Kontrolle der Umweltbedingungen, so dass die Analyse der Zelle-autonome und Zelle-nichtautonomen Auswirkungen der verschiedenen Manipulationen. Zu guter Letzt Einzelzellen eindeutig beobachtet werden für bis zu 15 Tage, so dass der präzise Rekonstruktion der großen Linie Bäume, die derzeit nicht möglich ist, beide in der Großhirnrinde Kulturen oder in Vivoin Scheiben schneiden. Auf der anderen Seite kann das System Nachteile verbunden mit dem Verlust von Gewebe Organisation darstellen. Wir empfehlen daher, die zellulären Verhaltensweisen in diesen 2D Kulturen beobachtet sollte im Idealfall durch andere Experimente in Vivobestätigt werden.
Frühere Daten, die mit diesem System-Show, die die Zelle Zyklus Verlängerung der kortikalen Vorläuferzellen in Vivo48 ist wiedergegeben in-vitro-15. Die neurogene und Gliogenic Potenzial der einzelnen Großhirnrinde Stammväter sind auch in der 2D Kultursystem nachgeahmt hier3beschrieben. Zu guter Letzt beobachtete Zellproliferation und Zellzyklus Ausfahrt Verhältnisse in Vivo auch nachgeahmt werden können mit Hilfe dieser Zelle Kultur System15,18. So glauben wir, dass Leben-Bildgebung der primären Hirnrinde Zellen kultiviert in den in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen ist eine leistungsfähige und benutzerfreundliche Methode, zelluläre und molekulare Mechanismen, die Kontrolle der Stammvater Zellproliferation, neuronalen und Glia-Zell-Differenzierung und Zelle Schicksal Spezifikation zu studieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) und FAPERN (Fundação de Amparo eine Pesquisa Do Rio Grande do Norte).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
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