Neuroscience

חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

Published: August 9, 2017 doi: 10.3791/56063

Bruna Soares Landeira¹, Jéssica Alves de Medeiros Araújo¹, Timm Schroeder², Ulrich Müller³, Marcos R. Costa¹

¹Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, ²Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, ³The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

Summary

הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור התנהגויות הסלולר בזמן אמת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה של קליפת המוח ראשי תאים המאפשרת בדיקה מקיפה של השלבים שחוקקו במהלך ההתקדמות שושלת היוחסין מתאי גזע עצביים העיקרי נוירונים הבדיל, עכשיו, דונלד.

Abstract

במהלך התפתחות קליפת המוח, ובתאים עוברים כמה סבבים של חלוקות תאים סימטרי, אסימטרית כדי ליצור אבות חדש או נוירונים postmitotic. מאוחר יותר, כמה אבות לעבור גורל gliogenic, הוספת אסטרוציט ו אוליגודנדרוציטים האוכלוסיות. באמצעות זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה של תרביות תאים קליפת המוח הראשי, זה אפשרי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית שליטה המצב של חלוקת התא ועל מחזור התא בפרמטרים של ובתאים. באופן דומה, אפשר לבחון את גורלו של תאים postmitotic באמצעות חלבונים כתב פלואורסצנט תאים ספציפיים או פוסט-הדמיה immunocytochemistry. חשוב מכך, ניתן לנתח כל התכונות הללו ברמה תא בודד, המאפשר זיהוי אבות מחויבת הדור של סוגי תאים ספציפיים. ניתן לבצע מניפולציה של ביטוי גנים גם באמצעות תקנים ויראלי בתיווך, המאפשר חקר תופעות תא-אוטונומי, ללא-תא-אוטונומי. לבסוף, השימוש של חלבונים פלורסנט פיוז'ן מאפשר חקר סימטרי אסימטרי והפצה של חלבונים הנבחר במהלך החטיבה, המתאם עם גורל תאי הבת. כאן, אנו מתארים את שיטת מיקרוסקופיה-וידאו זמן לשגות תמונה תאים מאתר קליפת המוח הראשי עבור ועד מספר ימים ולנתח את המצב של חלוקת התא, אורך מחזור התא, גורלו של תאים החדש שנוצר. אנו גם מתארים שיטה פשוטה כדי transfect ובתאים, אשר יכול להיות מיושם כדי לתפעל את הגנים של עניין או פשוט לשים תווית תאים עם הכתב חלבונים.

Introduction

תאי גזע עצביים (המל ל) ליצור נוירונים ותאי macroglial במהלך התפתחות קליפת המוח. בשעה מוקדמת-corticogenesis, NSCs עוברים כמה סבבים של חלוקת התא סימטרי, להרחיב את המאגר קדמון. לאחר מכן, NSCs לחלק בצורה א-סימטרית כדי ליצור נוירונים במישרין או בעקיפין דרך ביניים¹. רק באמצע - עד מאוחר-corticogenesis, אבות מעבר להפקת האסטרוציטים ו אוליגודנדרוציטים²^,³^,⁴. עם זאת, המנגנון מלאה לשלוט התפשטות תאים, בידול, כמו גם את התרומה של אבות מוגבלת גורל לדור של סוגים ייחודיים של נוירונים או תאים macroglial נשארים עניין של ויכוח אינטנסיבי-⁴^,-⁵^,-⁶. הפוטנציאל של הפרט NSCs בקליפת המוח לייצר נוירונים, האסטרוציטים ו אוליגודנדרוציטים כבר למדה בהרחבה במבחנה וב ויוו באמצעות מספר עצום של טכניקות כגון: לחיות הדמיה תא בודד תרבויות⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³; חיים הדמיה תרבויות בצפיפות גבוהה תרבויות³^,¹⁴^,¹⁵; חיים הדמיה פרוסה תרבויות¹⁶^,¹⁷^,¹⁸; ניתוח המשובטים באמצעות ויראלי בתיווך וקטור גנטי תיוג תרבויות בצפיפות גבוהה¹⁴^,¹⁵^,¹⁹^,²⁰^,²¹; ניתוח המשובטים ויוו באמצעות הרטרווירוס²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³; ניתוח המשובטים ויוו באמצעות בעלי חיים הטרנסגניים³⁴.

כל אחת מהטכניקות הללו מציג יתרונות וחסרונות. למשל, אין ויוו שושלת היוחסין עקיבה חשופה מכלילה, פיצול שגיאות³, המוביל למסקנות סותרות לגבי הפוטנציאל של אבות קורטיקלית בודדים. יתר על כן, שני חוץ גופית בתוך ויוו מחקרים בהתבסס על תיוג של ובתאים בנקודות זמן מוקדמת, ניתוח האחורי של תא שושלות עלול להיות מושפע המופע להתגלות של מוות של תאים במהלך שושלת היוחסין-התקדמות³⁵. לכן, מערכת מתאימה כדי לנתח את הפוטנציאל של NSCs יחיד לאפשר הזיהוי של כל התאים שנוצר, כמו גם אפיון תא הגורלות בתוך שושלת היוחסין המתאים. שילוב של תרבות התא העיקרי הדמיה חיה מספק הגדרה זו. באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות והתרבות של תא בודד, מקדש. et al. הראו את המתג בשושלת של קליפת המוח בודדים אבות מ נוירוג'נסיס gliogenesis¹¹. מאוחר יותר, הם השתמשו באותה המערכת כדי להראות כי סוגים שונים של נוירונים נוצרות יחיד קדמון קורטיקלית¹². עם זאת, מערכת זו מציג של הקונה חשוב: רק 1% של אבות בקליפת המוח מבודדים-corticogenesis מוקדם ליצור שיבוטים של רומא של 4 או יותר-⁹. לאחר התוספת של FGF2, מגדילה את התדירות של תאים ליצירת תאים 4 או יותר ל- 8-10%⁹. למרות זאת, מספר זה הוא קטן מדי בהתחשב כי כמעט כל אבות קורטיקלית proliferative בשלב זה. יתר על כן, השפעת פוטנציאל FGF2 על גורל-מפרט שלא ניתן לשלול³⁶. כדי לעקוף את המגבלות האלה, השתמשנו תרביות תאים בצפיפות גבוהה התומכים ההתפשטות של שניהם חדרית (לבטא Pax6) ו subventricular (ביטוי Tbr2) אבות קורטיקלית¹⁵. יתר על כן, התצפית בזמן אמת של תרבויות אלה הראו כי מספר תכונות של המועצה לבטחון לאומי שושלת היוחסין התקדמות משוחזרות בתנאים אלה, כגון מצב של חלוקת התא, הארכה של מחזור התא, הפוטנציאל של תאים בודדים ליצירת נוירונים, עכשיו, דונלד, בין היתר³^,¹⁵. לאחרונה, גם השתמשנו מערכת זו כדי להראות כי איתות CREB משפיע על ההישרדות תא של קליפת המוח ילדותי נוירונים בעכברים³⁷. כך, אנו מאמינים כי מיקרוסקופיה-וידאו בצילום מואץ של קליפת מאתר ראשי תאים גדל בצפיפות גבוהה הוא כלי רב עוצמה ונגיש לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית של מחזור התא התקדמות, מצב של חלוקת התא, התא הישרדות מפרט הגורל התא. האחרון יכול להתבצע באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר זיהוי תאים מסוים הגורלות בזמן אמת-³⁸^,-³⁹^,-⁴⁰ או השימוש של פוסט-הדמיה immunocytochemistry³^,³⁸^,⁴¹^,⁴².

כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד להכנת ראשי קליפת תרבית תאים תומכים התפשטות NSCs הדור הבא של נוירונים ותאי macroglial. נדון גם את השימוש של retroviral בתיווך תרביות תאים לתמרן ביטוי גנים של תאים בודדים, אשר ניתן לזהות מעקב ברמה תא בודד באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד קליפת המוח ראשי תאים מבודדים מההתחלה לסוף corticogenesis של מכרסמים, אך כמה התאמות העשויים להידרש, בהתאם שלב¹⁴. NSCs מבודד ממקורות אחרים שניתן גם ללמוד באמצעות מיקרוסקופ וידאו בצילום מואץ של תרבויות 2D, אבל במערכת culturing המתאימה צריך להיקבע על-ידי השוואת תא התנהגויות במבחנה , ויוו³⁸^,⁴³.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תצפית בזמן אמת של קליפת המוח ראשי תאים מאפשרת הניתוח של התפשטות תאים, מצב של חלוקת התא, אורך מחזור התא, תאית התמיינות תאים הישרדות³^,¹⁴^,¹⁵^,³⁷. חשוב מכך, הוא מאפשר חקר שושלות מתא בודד, שמוביל הזיהוי של שלבי ביניים שחוקקו במהלך ההתקדמות של NSCs נוירונים³. לבסוף, השילוב של מערכת זו תרבות עם כלים בביו-הנדסה לתמרן ביטוי גנים היא טכניקה חזקה כדי לחקור את השפעת יעדים נבחרים⁵תא-אוטונומי. השיטה המתוארת כאן יכול להיות שונה כדי ללמוד את שושלת היוחסין של אבות קליפת המוח מבודדים שלבים התפתחותיים שונים¹⁴, וכן NSCs מבודדים מתוך מקורות אחרים,³⁸^,⁴². שיטות דומות שימשו גם ללמוד תא שושלות הרשתית המתפתח⁴¹.

כאן, אנו מראים בניסוי פשוט לשימוש retroviral בתיווך תרביות תאים ובתאים תווית עם חלבון פלואורסצנטי הכתב. עם זאת, מטרות דומות יכולה להיות מושגת באמצעות וקטורים ויראלי, תרביות תאים כימית/חשמל או חיות הטרנסגניים המבטאים חלבונים פלורסנט תחת השליטה של תאים עצביים-סוג ספציפי היזמים³⁸^,³⁹אחרים. כל השיטות האלה כדי לשלוט ביטוי גנים ניתן גם ליישם זירוז או לדכא את הביטוי של גנים של עניין, המאפשר חקר המנגנונים המולקולריים המעורבים תאי גזע עצביים שושלת היוחסין התקדמות¹⁵^,¹⁸^,³⁹. אנחנו גם צופה כי מערכת זו ניתן להשתמש כדי להעריך ביטוי שונה איך לווסת רמות של חלבונים ספציפיים לבטחון לאומי ההתנהגות ואת עצביים/macroglial בידול, הדומה מה שנעשה את מערכת hematopoietic⁴⁰. כמו כן, היא עשויה לסייע לשפוך אור על הפוטנציאל של אבות יחיד ליצור נפרדות שושלות עצביים.

לעומת טכניקות אחרות שמטרתן הדמיה יונקים NSCs חיים-בעלי-חיים או בתרבויות פרוסה, השיטה המתוארת כאן יש כמה יתרונות חשובים. ראשית, העלות הנמוכה של השיטה הוא יתרון משמעותי. פשוט מיקרוסקופים הפוכה מצויד ששודרו, נורות פלורסצנטיות ומצלמה נשלט על ידי תוכנה מבוססת מחשב יכול לשמש כדי לרכוש תמונות של תרבויות 2D עבור עד מספר שבועות. שנית, המספר של בעלי חיים המשמשים ניסויים אלה הוא קטן יותר באופן משמעותי מאשר בשיטות אחרות. שלישית, המערכת מאפשרת שליטה מדויקת של תנאים סביבתיים, וכך מאפשר הניתוח של תופעות תא-אוטונומית ללא-תא-אוטונומי של מניפולציות שונות. לבסוף, תאים בודדים יכול להיות חד משמעית שנצפו עד 15 ימים, המאפשר שחזור מדויק של שושלות היוחסין גדולים, אשר כיום אינו אפשרי הן קליפת המוח פורסים תרבויות או בתוך vivo. מצד שני, המערכת עשויה להציג חסרונות הקשורים עם האובדן של רקמת הארגון. לכן, אנו ממליצים כי ההתנהגויות הסלולר נצפתה בתרבויות אלו 2D צריך להיות אידיאלי מאושרות על ידי ניסויים אחרים בתוך vivo.

הנתונים הקודמים באמצעות מערכת בהצגה הזאת התא מחזור התארכות קדמון קורטיקלית ויוו⁴⁸ הוא שועתק במבחנה¹⁵. Neurogenic הפוטנציאל gliogenic של קליפת בודדים אבות גם ממש מחקה במערכת התרבות 2D שתוארו כאן³. לבסוף, התפשטות תאים, מחזור התא יציאה יחסי נצפתה ויוו יכול גם להיות חיקה באמצעות הזה תא תרבות מערכת¹⁵^,¹⁸. כך, אנו מאמינים זה לחיות-הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים בתרבית בתנאים המתוארים פרוטוקול זה היא שיטה חזקה וידידותית לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית שליטה התפשטות תאים קדמון, תאים עצביים, גליה הבידול, מפרט הגורל התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי CNPq (Conselho נאסיונאל דה Desenvolvimento אזור e Tecnológico), שכמיות (Coordenação דה Aperfeiçoamento דה Pessoal דה Nível מעולה), FAPERN (Fundação de אמפרו עושה Pesquisa ריו גרנדה דו נורטה).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen Life Technologies	14175129
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140122
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	12400-024
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10437028
Glucose	Gibco	A2494001
B27	Gibco	17504044
trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054
Paraformaldehyde	Sigma	16005
Goat serum	Sigma-Aldrich	69023
Triton X-100	VWR International Ltd.	306324N
Isoflurane	Sigma	792632
anti-MAP2, mouse	Sigma	M4403
anti-GFP chicken	Aves	0511FP12
DAPI	Sigma	D9542
Goat anti-mouse alexa 594	Invitrogen	A11005
Goat anti-chicken alexa 488	Invitrogen	A11039
ImageJ	NIH
tTt	ETH Zurich
Cell observer microscope	Zeiss
Pasteur pipette
PBS
The Tracking Tool (tTt) software		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html	download link