Summary
La formazione immagine dal vivo è un potente strumento per studiare i comportamenti cellulari in tempo reale. Qui, descriviamo un protocollo per time-lapse video-microscopia delle cellule della corteccia cerebrale primario che consente un esame dettagliato delle fasi promulgata durante la progressione di lignaggio da cellule staminali neurali primarie a differenziato neuroni e cellule gliali.
Abstract
Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, cellule progenitrici sottoporsi a diversi cicli di divisioni cellulari simmetriche e asimmetriche per generare nuovi progenitori o neuroni postmitotic. Più tardi, alcuni progenitori passare ad un destino di gliogenic, aggiungendo alle popolazioni astrociti e oligodendrociti. Utilizzo di time-lapse video-microscopia di colture di cellule della corteccia cerebrale primario, è possibile studiare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la modalità di divisione cellulare e i parametri del ciclo cellulare delle cellule progenitrici. Allo stesso modo, il destino delle cellule postmitotic può essere esaminato utilizzando proteine reporter fluorescenti cellula-specifico o post-imaging immunocitochimica. Ancora più importante, tutte queste caratteristiche possono essere analizzate a livello di singola cellula, permettendo l'identificazione di progenitori impegnati per la generazione di tipi cellulari specifici. Manipolazione dell'espressione genica può essere eseguita anche mediante transfezione mediata virale, permettendo lo studio dei fenomeni di cella-autonomi e non autonomi delle cellule. Infine, l'utilizzo di proteine fluorescenti di fusione permette lo studio della distribuzione simmetrica e asimmetrica delle proteine selezionate durante la divisione e la correlazione con il destino di cellule figlie. Qui, descriviamo il metodo time-lapse video-microscopia per immagine cellule murine di corteccia cerebrale primaria per diversi giorni e analizzare la modalità di divisione cellulare, durata del ciclo cellulare e destino delle cellule appena generate. Inoltre descriviamo un metodo semplice per transfect cellule progenitrici, che possono essere applicate a manipolare i geni di interesse o semplicemente marcare le cellule con proteine reporter.
Introduction
Cellule staminali neurali (NSC) generare neuroni e cellule macroglial durante lo sviluppo della corteccia cerebrale. Al primi-corticogenesis, NSC sottoporsi a diversi cicli di divisione cellulare simmetrica ed espandere il pool di cellule progenitrici. Quindi, NSC dividono asimmetricamente per generare neuroni direttamente o indirettamente attraverso mediatori1. Solo a metà - alla fine-corticogenesis, progenitori passare per generare gli astrociti e oligodendrociti2,3,4. Tuttavia, i completare i meccanismi che controllano la proliferazione delle cellule e differenziazione, come pure il contributo dei progenitori destino-limitato alla generazione di tipi unici di neuroni o cellule macroglial rimangono una questione di intenso dibattito4,5,6. Il potenziale delle singole CSN corticale per generare neuroni, astrociti e oligodendrociti è stato estesamente studiato in vitro e in vivo utilizzando una miriade di tecniche come: live imaging in cella singola culture7,8,9,10,11,12,13; live imaging ad alta densità culture culture3,14,15; live imaging fetta culture16,17,18; analisi clonale utilizzando virale mediata da vettore genetico etichettatura ad alta densità culture14,15,19,20,21; analisi clonale in vivo utilizzando retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; e analisi clonale in vivo usando animali transgenici34.
Ognuna di queste tecniche presenta vantaggi e svantaggi. Per esempio, in vivo lignaggio traccia è suscettibile al lumping e scissione errori3, che porti a conclusioni contrastanti circa il potenziale dei singoli progenitori corticali. Inoltre, sia gli studi in vitro ed in vivo basano sull'etichettatura delle cellule progenitrici a intervalli di tempo iniziale e posteriore analisi delle stirpi delle cellule possono essere influenzata dall'avvenimento inosservato di morte delle cellule durante il lignaggio-progressione35. Di conseguenza, un sistema adatto per analizzare le potenzialità del singolo NSCs dovrà consentire l'identificazione di tutte le cellule generate, così come la caratterizzazione appropriata dei destini di cella all'interno della stirpe. Combinazione di colture cellulari primarie e live imaging fornisce questa impostazione. Utilizzando cella singola cultura e time-lapse video microscopia, Tempio et al hanno dimostrato l'interruttore del lignaggio della corteccia cerebrale individuale progenitori da neurogenesi al gliogenesis11. Più tardi, hanno usato lo stesso sistema per mostrare che i diversi tipi di neuroni sono generati da un unico progenitore corticale12. Tuttavia, questo sistema presenta un importante avvertimento: solo 1% dei progenitori corticali isolati alle prime corticogenesis generare cloni di 4 o più progenie9. Dopo l'aggiunta di FGF2, la frequenza delle cellule generando 4 o più celle aumenta a 8-10%9. Tuttavia, questo numero è troppo piccolo considerando che praticamente tutti i progenitori corticali sono proliferativi in questa fase. Inoltre, i potenziali effetti di FGF2 il destino-specifica non possono essere esclusa36. Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo usato colture ad alta densità cellulari che supportano la proliferazione di entrambi ventricolare (Pax6-esprimendo) e subventricolare (Tbr2-esprimendo) corticale progenitori15. L'osservazione in tempo reale di queste culture ha inoltre dimostrato che diverse caratteristiche della progressione del lignaggio di NSC sono riprodotte in queste condizioni, come la modalità di divisione cellulare, allungamento del ciclo cellulare, il potenziale delle singole cellule per generare neuroni e cellule gliali, tra gli altri3,15. Più recentemente, abbiamo utilizzato questo sistema anche a dimostrare che CREB-segnalazione colpisce la sopravvivenza delle cellule dei neuroni immaturi corteccia cerebrale in topi37. Così, crediamo che Time-lapse video-microscopia della corteccia cerebrale murino primario le cellule coltivate in ad alta densità è uno strumento potente e accessibile per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della progressione del ciclo cellulare, la modalità di divisione cellulare, la sopravvivenza delle cellule e cellula destino specifica. Quest'ultima può essere eseguita utilizzando animali transgenici, permettendo l'identificazione di destini cellulari specifiche tempo reale38,39,40 o l'uso di post-imaging immunocytochemistry3,38,41,42.
Qui, forniamo un protocollo passo dopo passo per preparare la corteccia cerebrale primaria coltura cellulare supporto proliferazione delle CSN e la successiva generazione dei neuroni e delle cellule macroglial. Inoltre discutiamo l'uso di transfezione mediata retrovirale per manipolare l'espressione genica delle cellule individuali, che possono essere identificati e monitorata a livello di singola cellula usando la microscopia video time-lapse. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare la corteccia cerebrale primario cellule isolate dall'inizio alla fine del corticogenesis nei roditori, ma qualche aggiustamento può essere richiesto secondo la fase14. NSC isolate da altre fonti può essere studiata anche usando la microscopia video time-lapse di culture 2D, ma il sistema di coltura appropriato dovrebbe essere determinato comparando i comportamenti delle cellule in vitro e in vivo38,43.
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Discussion
Osservazione in tempo reale delle cellule della corteccia cerebrale primaria permette l'analisi di proliferazione delle cellule, la modalità di divisione cellulare, durata del ciclo cellulare, differenziazione cellulare e cella sopravvivenza3,14,15,37. Ancora più importante, consente lo studio dei lignaggi unicellulare, consentendo l'identificazione delle fasi intermedie promulgata durante la progressione da NSC a neuroni3. Infine, la combinazione di questo sistema di coltura con strumenti di bioingegneria per manipolare l'espressione genica è una tecnica potente per studiare l'effetto delle cellule-autonoma di target selezionati5. Il metodo qui descritto può essere modificato per studiare la stirpe dei progenitori di corteccia cerebrale isolati a diversi stadi di sviluppo14, così come NSC isolate da altre fonti38,42. Metodi simili sono stati utilizzati anche per studiare stirpi delle cellule della retina in via di sviluppo41.
Qui, vi mostriamo un semplice esperimento mediante transfezione mediata retrovirale alle cellule progenitrici etichetta con una proteina fluorescente del reporter. Tuttavia, simili obiettivi possono essere raggiunti utilizzando altri vettori virali, chimico/elettrico transfezione o animali transgenici che esprimono le proteine fluorescenti sotto il controllo del tipo di cellula neurale specifici promotori38,39. Tutti questi metodi per controllare l'espressione genica possono essere applicati anche per indurre o sopprimere l'espressione di geni di interesse, permettendo lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nella stirpe delle cellule staminali neurali progressione15,18,39. Prevediamo inoltre che questo sistema può essere utilizzato per valutare come le diverse espressioni dei livelli di proteine specifiche regolano NSC comportamento e un neurone/macroglial differenziamento, simile a quello che è stato fatto nel sistema ematopoietico40. Inoltre, può aiutare a fare luce sulle potenzialità del singoli progenitori per generare distinti lignaggi neuronale.
Rispetto ad altre tecniche di imaging NSC di mammiferi in vivo-animali o nelle culture della fetta, il metodo qui descritto ha alcuni importanti vantaggi. In primo luogo, il basso costo del metodo è un beneficio significativo. Microscopi rovesciati semplice dotati di trasmessa e fluorescenza luci e una macchina fotografica controllata dal software basati su computer può essere utilizzati per acquisire immagini di culture 2D per fino a parecchie settimane. In secondo luogo, il numero di animali utilizzati per questi esperimenti è significativamente minore in altri metodi. In terzo luogo, il sistema permette un controllo preciso delle condizioni ambientali, permettendo così l'analisi degli effetti delle cellule-autonomi e non autonomi delle cellule di manipolazioni diverse. Infine, le singole celle possono essere osservate senza ambiguità per fino a 15 giorni, consentendo la ricostruzione precisa di alberi di grande lignaggio, che attualmente non è possibile sia nella corteccia cerebrale affettare culture o in vivo. D'altra parte, il sistema può presentare gli svantaggi connessi con la perdita di organizzazione del tessuto. Si consiglia, pertanto, che i cellulari comportamenti osservati in queste culture 2D dovrebbero essere idealmente confermati da altri esperimenti in vivo.
Dati precedenti utilizzando questo spettacolo di sistema che la cella ciclo allungamento del progenitore corticale in vivo48 sono riprodotta in vitro15. Il neurogena e gliogenic potenziale della corteccia cerebrale individuale progenitori sono anche imitati nel sistema 2D cultura descritto qui3. Infine, la proliferazione delle cellule e ciclo cellulare uscita rapporti osservati in vivo può anche essere imitato utilizzando questa cella cultura sistema15,18. Così, crediamo che vivere-imaging delle cellule della corteccia cerebrale primario coltivato nelle condizioni descritte in questo protocollo è un metodo potente e user-friendly per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la proliferazione delle cellule progenitrici, differenziazione delle cellule neuronali e gliali e specifica di destino delle cellule.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento e Científico Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FAPERN (Fundação de Amparo un Pesquisa do Rio Grande do Norte).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
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