Summary
ライブ画像は、リアルタイムで携帯電話の行動を研究するための強力なツールです。ここでは、タイムラプス ビデオ-顕微鏡検査のため主要な大脳皮質細胞の主な神経幹細胞から分化したニューロンとグリア系統進行中に成立段階の詳細な検査を可能にするプロトコルについて述べる。
Abstract
大脳皮質の開発中には、前駆細胞は新しい前駆細胞または後の神経細胞を生成する対称および非対称細胞分裂のいくつかのラウンドを受けます。その後、いくつかの前駆細胞は、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトの人口への追加幹運命に切り替えます。主要な大脳皮質細胞培養のタイムラプス ビデオ顕微鏡を使用すると、細胞分裂のモードと前駆細胞の細胞周期のパラメーターを制御する細胞・分子メカニズムを研究することが可能です。同様に、セル固有蛍光レポーター蛋白質を使用してまたは後免疫細胞化学をイメージング、後細胞の運命は調べることができます。もっと重要なは、これらすべての機能は、特定のセル型を生成することを約束の前駆細胞の同定を許可する単一細胞レベルで分析できます。また細胞自律的・細胞自律的現象の研究を許可するウイルスを介する遺伝子導入を用いた遺伝子発現の操作を実行できます。最後に、蛍光の融合蛋白質を使用区分と娘細胞運命との対比の中に選択した蛋白質の対称および非対称分布に関する研究。ここでは、数日に及ぶ主要な大脳皮質マウス細胞を画像、細胞分裂、細胞周期の長さと新しく生成された細胞の運命のモードを分析してタイムラプス ビデオ顕微鏡法について述べる.興味のある遺伝子を操作する、または単にレポーター蛋白質と細胞をラベルに適用できる前駆細胞を使って簡単な方法について述べる。
Introduction
神経幹細胞 (NSC) は、大脳皮質の開発中にニューロンと macroglial 細胞を生成します。初期-内因、NSCs 対称の細胞分裂のいくつかのラウンドを受けるし、前駆プールを展開します。その後、NSCs は中間1を介して直接または間接的にニューロンを生成する非対称的に分割します。だけで半ば-に後半-内因、前駆細胞のアストロ サイト、オリゴデンドロ サイトの2,3、4を生成するスイッチします。しかし、ユニークな種類のニューロンや macroglial 細胞の世代に運命制限前駆細胞の寄与と同様、細胞の増殖と分化を制御する完全なメカニズムは、激しい議論4,5,6の問題を続けます。神経細胞、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトを生成する個々 の皮質 NSCs の可能性は広範囲に研究生体外および生体内で無数の技術を使用して、されている: 単一細胞培養7,8,9,10、11,12,13; イメージング ライブライブ イメージングの高密度文化文化3,14,15;ライブ イメージング スライス文化16,17,18;ウイルス媒介性遺伝的ラベリング処理による高密度培養14,15,19,20,21; のクローン解析クローン解析体内レトロ ウイルス22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; を使用してそして体内のクローン解析トランスジェニック動物の34を使用しています。
これらのテクニックは、長所と短所がそれぞれ。たとえば、トレースする血統体内一括と分割エラー3、個々 の大脳皮質前駆細胞の潜在性について矛盾する結論に至る。また、両方in vitroとin vivoの研究が早い時点で前駆細胞の分類に基づいて、35系統進行中に細胞死の検出されない発生による細胞系譜の事後分析を受けます。したがって、単一 NSCs の可能性の分析に適したシステムは生成されると、すべての細胞の同定だけでなく、系統内での細胞運命の適切な特性を考慮しなければなりません。一次電池文化とライブ イメージングの組み合わせでは、この設定を提供します。単一細胞培養とタイムラプス ビデオ顕微鏡を用いた、寺らは gliogenesis11神経新生から個々 の大脳皮質前駆細胞の血統のスイッチを示しています。後で、彼らはニューロンの異なったタイプが12の単一の大脳皮質前駆細胞から生成されることを示す同じシステムを使用しました。しかし、このシステムには重要な注意事項: 初期内因で分離された大脳皮質前駆細胞の 1% は 4 つ以上の子孫9のクローンを生成するだけです。FGF2 の付加の後で 4 つ以上のセルを生成する細胞の頻度は 8-109に増加します。それにもかかわらず、この数はこの段階で、ほとんどすべての大脳皮質前駆細胞が増殖を考慮した小さすぎます。また、36運命仕様に FGF2 の潜在的な影響は否定できません。(Pax6 を発現) 心室の両方の増殖をサポートする高密度細胞培養を用いてこれらの制限を回避するために、脳室下帯 (Tbr2 表現) 大脳皮質前駆細胞15。また、これらの文化のリアルタイム観察は NSC 系統進行のいくつかの機能、3、15細胞分裂、細胞周期の延長、ニューロンとグリアなどを生成する単一細胞の潜在性のモードなど、これらの条件下で再現を示しています。最近では、我々 も CREB シグナルがマウス37で未熟な大脳皮質ニューロンの細胞の生存に影響を与えることをこのシステムを使用しています。したがって、プライマリ マウス大脳皮質のタイムラプス ビデオ顕微鏡を考えて高密度成長のセルは細胞周期の進行のメカニズムを解明、細胞分裂、細胞生存率、細胞運命の指定のモードを研究する強力かつアクセス可能なツール。後者ができますリアルタイム38,39,40の特定細胞運命の識別またはポスト各種3,38,41,42をイメージングの使用許可、トランスジェニック動物を使用しています。
ここでは、NSCs の増殖とニューロンと macroglial 細胞の次の世代を支える主要な大脳皮質細胞培養を準備する手順を追ってプロトコルを提供します。識別およびコマ撮りビデオ顕微鏡を用いた単一細胞レベルで追跡することができます個々 の細胞の遺伝子を操作する遺伝子をレトロ ウイルス媒介の使用についても述べる。齧歯類、内因の端に最初から主要な大脳皮質細胞の研究にこのプロトコルを使用することができますが、ステージ14によるといくつかの調整が必要があります。二次元文化のタイムラプス ビデオ顕微鏡を用いた、NSCs 他のソースから分離を検討ことができますが、適切な培養システムは細胞挙動の in vitroとin vivo38,43を比較することによって決定する必要があります。
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Discussion
主要な大脳皮質細胞のリアルタイム観察では、細胞増殖の解析、細胞分裂、細胞周期、細胞分化、細胞生存3,14,15,37のモードをことができます。もっと重大に、それは NSCs からニューロン3への進行の間に制定された中間相の同定につながる単一細胞系統の研究を許可します。最後に、この文化システムと遺伝子発現を操作するバイオ エンジニア リング ツールの組み合わせは、選択したターゲット5の細胞の自律的効果を研究する強力な手法です。ここで説明する方法は、他ソース38,42から分離された NSCs と同様に大脳皮質前駆細胞で発達段階別14, 分離の血統を勉強する変更できます。同様のメソッドは、発展途上の網膜41セル血統を勉強する使用されています。
レポーター蛍光タンパク質をラベル前駆細胞にレトロ ウイルスを介する遺伝子導入を用いた簡単な実験を紹介します。しかし、似たような目標は、他のウイルスのベクトル、化学/電気のトランスフェクションや神経細胞型特定プロモーター38,39の制御の下で蛍光蛋白質を発現するトランスジェニック動物を使用して実現できます。遺伝子発現を制御するこれらのすべてのメソッドは、誘導や神経幹細胞系譜進行15,18,39に関与する分子機構の研究をできるように興味のある遺伝子の発現を抑制するのにも適用できます。我々 も予見するこのシステムをどのように異なる式を評価する使用ことができます、特定の蛋白質のレベルを調節する NSC 行動と神経/macroglial 分化、造血系40で何をされてきたかのよう。また、別の神経系統を生成する単一の前駆細胞の可能性に光を当てることがあります。
ここで説明したメソッド哺乳類 NSCs ライブ動物またはスライス培養をイメージングを目的としたその他の手法と比較して、いくつかの重要な利点があります。まず、メソッドの低コストは、大きな利点です。単純な倒立顕微鏡搭載送信および蛍光性ライトとコンピューター ベースのソフトウェアによって制御されるカメラの数週までの文化 2 D の画像を取得する使用できます。第二に、これらの実験に使用される動物の数は他の方法よりも大幅に小さいです。第三に、システムには、異なる操作の細胞自律性と細胞の自律的効果の分析が可能な環境条件の正確な制御ができます。最後に、個々 の細胞が明確に大脳皮質の両方は現在不可能な血統で、大きな木の正確な再構成を許可する最大 15 日間の観察できる文化やin vivoをスライスします。その一方で、システムは、組織の損失に関連付けられている欠点を表示可能性があります。したがって、これらの 2次元培養では観察細胞行動を理想的に他の実験in vivoで確認すべきことをお勧めします。
細胞サイクル48 体内皮質前駆の延長このシステムを使用して前のデータは再現体外15です。神経因性と個々 の大脳皮質前駆細胞が 2次元培養システムで模倣されるもの幹を潜在的な説明ここで3。最後に、細胞増殖と細胞周期出口比は生体内でまねることがもできますこの細胞培養システム15,18を使用して観察。したがって、そのライブ イメージング主要な大脳皮質細胞と考えてこのプロトコルに記述されている条件で培養前駆細胞増殖, 神経細胞およびグリア細胞の分化と細胞運命仕様を制御する細胞・分子メカニズムを研究する強力かつユーザーフレンドリーな方法です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作業は、研究集会 (Conselho ナシオナル ・ デ ・ Desenvolvimento Científico e Tecnológico)、岬 (中・ デ ・ Aperfeiçoamento ・ デ ・ Pessoal ・ デ ・ Nível スーペリアー) によって支えられたおよび FAPERN (カルースト ・ デ ・ アンパロ Pesquisa はリオ ・ グランデは、ノルテを行う)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
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