Summary
라이브 영상 실시간에 세포 행동을 공부 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 시간 경과 비디오-현미경 기본 대뇌 피 질 세포의 차별화 된 뉴런을 명과 기본 신경 줄기 세포에서 혈통 진행 동안 제정 단계의 상세한 검사를 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
대뇌 피 질 개발, 조상 세포 새로운 창시자 또는 postmitotic 신경 생성 하 대칭 및 비대칭 세포 분열의 여러 라운드를 받 다. 나중에, 일부 창시자 gliogenic 운명에 사이토와 oligodendrocyte 인구에 추가 전환 합니다. 기본 대뇌 피 질 세포 배양의 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여, 세포 분열의 모드와 조상 세포의 세포 주기 매개 변수 제어 세포 및 분자 메커니즘 연구 가능 하다. 마찬가지로, postmitotic 세포의 운명은 셀 전용 형광 기자 단백질을 사용 하 여 또는 포스트 immunocytochemistry 이미징 시험 될 수 있다. 더 중요 한 것은, 이러한 기능을 모든 종류의 특정 세포 생성 하기 위해 노력 하는 창시자의 식별 수 있도록 단일 세포 수준에서 분석할 수 있습니다. 유전자 발현의 조작 또한 바이러스 중재 transfection, 세포 자치 및 셀을 자치 현상의 연구를 수를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 퓨전 형광 단백질의 사용 부문 및 딸 세포 운명과 상관 하는 동안 선택 된 단백질의 대칭 및 비대칭 분포의 연구를 수 있습니다. 여기, 우리는 며칠에 대 한 기본 대뇌 피 질 murine 셀을 이미지 하 여 세포 분열, 세포 주기 길이 및 새로 생성 된 셀의 운명의 모드 분석 시간 경과 비디오 현미경 방법 설명. 우리는 또한 transfect 조상 세포의 유전자를 조작 하거나 단순히 기자 단백질 셀 라벨에 적용할 수 있는 간단한 방법을 설명 합니다.
Introduction
신경 줄기 세포 (NSC)는 대뇌 피 질 개발 중 신경 및 macroglial 셀을 생성합니다. 초기-corticogenesis, NSCs 대칭 세포 분열의 여러 라운드를 받 다 고 뿌리 풀 확장. 다음, NSCs 나누기 비대칭 중간체1를 통해 직접 또는 간접적으로 뉴런을 생성 합니다. 에 중반-에 늦은-corticogenesis, 창시자 이다 및 oligodendrocytes2,,34생성 하 전환 합니다. 그러나, 운명 제한 창시자 독특한 종류의 신경 또는 macroglial 세포의 생성에 기여 뿐만 아니라 세포 증식 및 분화, 제어 하는 완전 한 메커니즘 강렬한 토론4,,56의 문제가 남아 있습니다. 광범위 하 게 공부 생체 외에서 그리고 vivo에서 와 같은 수많은 기법을 사용 하 여 신경, 이다 oligodendrocytes를 생성 하기 위해 개별 외피 NSCs의 잠재력 되었습니다: 단일 셀 문화7,8,9,10,11,,1213; 이미징 라이브 고밀도 문화 문화3,,1415; 이미징 라이브 라이브 이미징 슬라이스 문화16,,1718; 바이러스 성 벡터 중재 유전 라벨 고밀도 문화14,15,19,,2021;를 사용 하 여 클론 분석 클론 분석에 비보에 레트로 바이러스22,23,,2425,26,27,28,29,30,31,32,33;를 사용 하 여 그리고 클론 분석에 vivo에서 유전자 변형 동물34를 사용 하 여.
이러한 기술을 각각 장점과 단점을 제공합니다. 예를 들어, 혈통 추적 vivo에서 총괄 한 그리고 분할 오류3, 개별 외피 창시자의 잠재력에 대 한 상반 된 결론을 이끌어을 받기 쉽습니다. 또한, 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문 초기 시간 포인트에서 조상 세포의 라벨에 따라 그리고 후부 분석 세포 계보의 혈통-진행35동안 세포 죽음의 들 키 지 않고 발생에 의해 영향을 수 있습니다. 따라서, 단일 NSCs의 잠재력 분석 하기 적합 한 시스템 생성 하는 모든 셀의 식별 뿐만 아니라 혈통 내에서 세포 운명의 적절 한 묘사를 허용 해야 합니다. 1 차 세포 배양 및 라이브 이미징의 조합에는이 설정을 제공합니다. 단일 세포 배양 및 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여, 사원 외. 스위치에에서 나타났습니다 gliogenesis11성체에서 개별 대뇌 피 질 창시자의 계보. 나중에, 그들은 뉴런의 종류는 단일 외피 조상12에서 생성 됩니다 보여 동일한 시스템을 사용. 그러나,이 시스템 중요 한 경고 표시: 4 이상의 자손9의 클론을 생성 하는 이른 corticogenesis에서 절연 외피 창시자의 1%만. FGF2 추가 후 4 명 이상 세포 생성 세포의 주파수 8-109증가 합니다. 그럼에도 불구 하 고,이 숫자는 너무 작은이 단계에서 거의 모든 대뇌 피 질의 창시자는 증식을 고려. 또한, 운명 사양에 FGF2의 잠재적인 효과36배제할 수 없다. 고밀도 세포 배양 (Pax6 표현) 심 실 둘 다의 확산을 지 원하는 사용이 한계를 우회 하 고 subventricular (Tbr2 표현) 대뇌 피 질의 창시자15. 또한, 이러한 문화의 실시간 관찰 NSC 혈통 진행의 여러 가지 기능 세포 분열, 세포 주기 길어, 잠재력 단일 셀의 신경 및 명과, 다른 사람의 사이에서 생성 하는 모드 등이 조건 하에서3,15재현은 보이고 있다. 최근에, 우리는 또한 사용이 시스템 그 쥐37에서 미 성숙한 대뇌 피 질 뉴런의 세포 생존에 영향을 미치는 CREB 신호 보여. 따라서, 우리가 믿는 그 시간 경과 비디오 현미경 기본 murine 대뇌 피 질의 고밀도에 성장 하는 세포는 세포 주기 진행의 세포 및 분자 메커니즘, 세포 분열, 세포 생존 및 세포 운명 명세 모드를 공부 하는 강력 하 고 액세스할 수 도구. 후자는 수행할 수 있습니다 실시간38,,3940 에 특정 세포 운명의 식별 또는 immunocytochemistry3,38,,4142후 이미징의 사용을 허용 하는 유전자 변형 동물을 사용 하 여.
여기, 우리는 기본 대뇌 피 질 세포 배양 지원 NSCs의 확산 및 신경 및 macroglial 세포의 다음 세대를 준비 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 우리는 또한 식별 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여 단일 셀 수준에서 추적 될 수 있는 개별 세포의 유전자 발현 조작 transfection retroviral 중재의 사용 설명. 설치류에 corticogenesis의 끝에 처음부터 격리 기본 대뇌 피 질 세포를 공부 하이 프로토콜을 사용할 수 있지만 몇 가지 조정 단계14에 따라 필요할 수 있습니다. 다른 소스에서 분리 하는 NSCs 또한 공부 될 수 있다 2D 문화의 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여 하지만 적절 한 자란 시스템 셀 동작 생체 외에서 그리고 vivo에서38,43를 비교 하 여 결정 되어야 한다.
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Discussion
실시간으로 관찰 기본 대뇌 피 질 세포의 세포 증식의 분석, 세포 분열, 세포 주기 길이, 세포 분화 및 세포 생존3,14,,1537의 모드 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 신경3NSCs에서 진행 하는 동안 제정 중간 단계의 식별으로 이어지는 단일 세포 계보의 연구 허용. 마지막으로, 공학 도구를 조작 유전자 발현이 문화 시스템의 조합 선택된 대상5셀 자치 효과 연구에 강력한 기술입니다. 여기 설명 하는 방법은 공부 NSCs 다른 소스38,42에서 고립 뿐 아니라 다른 발달 단계14, 고립 대뇌 피 질 창시자의 계보를 수정할 수 있습니다. 비슷한 방법 또한 개발 망막41에서 세포 계보 연구에 사용 되었습니다.
여기, 우리는 간단한 실험 기자 형광 단백질으로 라벨 조상 세포 transfection retroviral 중재를 사용 하 여 보여줍니다. 그러나, 다른 바이러스 성 벡터, 화학/전기 transfection 또는 신경 세포 유형 특정 발기인38,39의 제어에서 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 동물을 사용 하 여 비슷한 목표를 얻을 수 있습니다. 이러한 모든 메서드 유전자 발현 제어를 유도 하거나 관심, 신경 줄기 세포 계보 진행15,,1839에 관련 된 분자 메커니즘의 연구를 수의 유전자의 표현에 적용할 수 있습니다. 우리는 또한이 시스템 어떻게 다른 식을 평가 하는 데 사용 될 수 예견 특정 단백질의 수준을 규제 NSC 행동과 신경/macroglial 차별화, 무슨 조 혈 시스템40썼는 비슷합니다. 또한, 그것은 별도 신경 계보를 생성 하기 위해 단일 창시자의 잠재력에 빛을 발산 하는 데 도움이 있습니다.
포유류 NSCs 라이브 동물 또는 슬라이스 문화 이미징 겨냥 하는 다른 기술에 비해, 여기 설명 하는 방법을 몇 가지 중요 한 이점이 있다. 첫째로, 저가 방법의 상당한 혜택입니다. 간단한 거꾸로 현미경을 갖춘 전송 하 고 형광 조명 및 컴퓨터 소프트웨어에 의해 제어 하는 카메라까지 몇 주에 대 한 2D 문화의 이미지를 사용할 수 있습니다. 둘째, 이러한 실험을 위해 사용 하는 동물의 수는 다른 방법 보다 훨씬 작습니다. 셋째, 시스템에는 환경 조건, 따라서 다른 조작의 셀 자치 및 셀을 자치 효과의 분석을 허용 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 마지막으로, 개별 셀 관찰 될 수 있다 명확 하 게 대뇌 피 질에서 둘 다 불가능 현재 큰 계보 나무의 정확한 개조를 허용 최대 15 일 동안 문화에서 비보를 슬라이스. 다른 한편으로, 시스템 조직 조직의 손실과 관련 된 단점을 발생할 수 있습니다. 따라서, 이러한 2D 문화에서 관찰 셀룰러 동작 이상적으로 다른 실험 비보에 의해 확인 되어야 한다 하는 것이 좋습니다.
셀 순환48 vivo에서대뇌 피 질의 뿌리의 길이이 시스템 보기를 사용 하 여 이전 데이터는 복제 생체 외에서15입니다. neurogenic 및의 창시자는 또한 2D 문화 시스템에 유사는 개별 대뇌 피 질 gliogenic 잠재력 설명3. 마지막으로, 세포 증식과 세포 주기 출구 비율 비보에 있습니다 또한 수 유사이 셀 문화 시스템15,18를 사용 하 여 관찰. 따라서, 우리는 라이브 이미징 기본 대뇌 피 질 세포의 믿는이 프로토콜에서 설명 하는 조건에서 배양 세포 및 분자 메커니즘 조상 세포 증식, 신경 그리고 glial 세포 분화 및 세포 운명 명세를 공부 하 강력 하 고 사용 하기 쉬운 방법입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 CNPq (게 나시오날 드 Desenvolvimento Científico e Tecnológico), 망 (Coordenação de Aperfeiçoamento 데 피해 드 높이 등)에 의해 지원 되었다, FAPERN (Fundação de Amparo 검색 할 리오 그란데 노르 테 할).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
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