Summary
Live bildebehandling er et kraftig verktøy for å studere mobilnettet atferd i sanntid. Her beskriver vi en protokoll for time-lapse video-mikroskopi primære hjernebarken celler som gir en detaljert undersøkelse av fasene vedtatt under avstamning progresjon fra primære nevrale stamceller differensiert nevroner og glia.
Abstract
Under hjernebarken utvikling gjennomgå stamfar celler flere runder med symmetriske og asymmetriske celledelinger generere nye progenitors eller postmitotic neurons. Senere, bytte noen progenitors til en gliogenic skjebne, legge til astrocytter og oligodendrocyte bestander. Bruke time-lapse video-mikroskopi av primære hjernebarken cellekulturer, er det mulig å studere de cellulære og molekylære mekanismene som styrer modus celledeling og celle syklus parametere for stamfar celler. Tilsvarende kan skjebnen til postmitotic celler undersøkes med celle-spesifikke fluorescerende reporter proteiner eller stolpe-tenkelig immunocytochemistry. Enda viktigere, kan alle disse funksjonene analyseres på encellede nivå, slik at identifikasjon av progenitors forpliktet til generering av spesifikke celletyper. Manipulering av genuttrykk kan også utføres med viral-mediert transfection, slik at studiet av cellen autonome og ikke-celle-autonome fenomener. Endelig, bruk av fusion fluorescerende proteiner lar studiet av symmetriske og asymmetriske distribusjon av valgte proteiner under divisjon og sammenhengen med datter celler skjebne. Her beskriver vi time-lapse video-mikroskopi metoden å image primære hjernebarken murine celler for opp til flere dager og analysere celledeling, celle syklus lengde og skjebnen til nyopprettede celler. Vi har også beskriver en enkel metode for å transfect stamfar celler, som kan brukes å manipulere gener rundt eller bare merke celler med reporter proteiner.
Introduction
Nevrale stamceller (NSC) genererer neurons og macroglial celler under hjernebarken utvikling. Ved tidlig-corticogenesis, NSCs gjennomgå flere runder med symmetrisk celledeling og utvide stamfar bassenget. Deretter dele NSCs asymmetrisk for å generere neurons direkte eller indirekte gjennom mellomprodukter1. Bare på bytte midt - å sen-corticogenesis, progenitors for å generere astrocyttene og oligodendrocytes2,3,4. Komplett mekanismer som kontrollerer celle spredning og differensiering, i tillegg til bidrag av skjebnen-begrenset progenitors til generering av unike typer nerveceller eller macroglial celler beholdes imidlertid løpet av intens debatt4,5,6. Potensialet i individuelle kortikale NSCs å generere neurons, astrocyttene og oligodendrocytes har vært grundig studert i vitro og i vivo bruker en rekke teknikker som: live bildebehandling i én celle kulturer7,8,9,10,11,12,13; Live bildebehandling i høy tetthet kulturer kulturer3,14,15; Live bildebehandling skive kulturer16,17,18; klonal analyse ved hjelp av viral vektor-mediert genetisk merking i høy tetthet kulturer14,15,19,20,21; klonal analyse i vivo med retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; og klonal analyse i vivo bruker transgene dyr34.
Hver av disse teknikkene presenterer fordeler og ulemper. For eksempel er i vivo avstamning sporing utsatt til lumping og splitting feil3, fører til motstridende konklusjoner om potensialet som individuelle kortikale progenitors. Dessuten, både i vitro og i vivo studier basert på merkingen av progenitor celler på tidlig tidspunkt og bakre analyse av cellen linjene kan påvirkes av uoppdaget forekomsten av celledød under avstamning-progresjon35. Derfor må et egnet system å analysere potensial til enkelt NSCs tillate identifikasjon av alle celler generert og riktig karakterisering av cellen skjebne i linjen. Kombinasjonen av primære cellekultur og live bildebehandling gir denne innstillingen. Bruke én celle kultur og time-lapse video mikroskopi, har Temple et al. vist bryteren i linjen av personlige hjernebarken progenitors fra neurogenesis gliogenesis11. Senere, brukte de samme system for å vise at ulike typer nerveceller er generert fra en enkelt kortikale stamfar12. Men dette systemet presenterer en viktig påminnelse: bare 1% av kortikale progenitors isolert på tidlig corticogenesis generere kloner av 4 eller flere avkom9. Etter at FGF2 øker frekvensen av celler genererer 4 eller flere celler til 8-10%9. Likevel, dette tallet er for liten tanke at nesten alle kortikale progenitors proliferativ på dette stadiet. Videre kan ikke potensielle effekten av FGF2 på skjebne-spesifikasjonen bli utelukkes36. For å omgå disse begrensningene, vi brukte høy tetthet cellekulturer som støtter spredning av begge ventrikkel (Pax6-uttrykke) og subventricular (Tbr2-uttrykke) kortikale progenitors15. Dessuten har sanntid observasjon av disse kulturene vist at flere funksjoner i NSC avstamning progresjon gjengis under disse forholdene, for eksempel modus for celledeling, lengthening av cellen syklus, potensialet i enkeltceller generere neurons og glia, blant annet3,15. Flere nylig, har vi også brukt dette systemet vise at CREB-signalisering påvirker celle overlevelse av umodne hjernebarken nerveceller i mus37. Derfor vi tror at time-lapse video-mikroskopi av primære murine hjernebarken celler dyrket i høy tetthet er et kraftig og lett tilgjengelig verktøy å studere cellulære og molekylære mekanismer av cellen syklus progresjon, celledeling, celle overlevelse og celle skjebne spesifikasjonen. Sistnevnte kan oppnås ved hjelp av transgene dyr, slik at identifikasjon av bestemt celle skjebne på sanntid38,39,40 eller bruk av stolpe-tenkelig immunocytochemistry3,38,41,42.
Her gir vi en trinnvis protokoll for å forberede primære hjernebarken cellekultur støtter spredning av NSCs og den etterfølgende generasjonen av nevroner og macroglial celler. Vi diskuterer også bruk av retroviral-mediert transfection å manipulere genuttrykk individuelle celler, som kan identifiseres og spores på encellede nivået med time-lapse video mikroskopi. Denne protokollen kan brukes til å studere primære hjernebarken celler isolert fra begynnelsen til slutten av corticogenesis i gnagere, men noen justeringer kan være nødvendig i henhold til det stadiet14. NSCs isolert fra andre kilder kan også studeres med time-lapse video mikroskopi 2D kulturer, men det aktuelle culturing systemet skal bestemmes ved å sammenligne celle atferd i vitro og vivo38,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sanntid observasjon av primære hjernebarken celler kan analyse av celle spredning, celledeling, celle syklus lengde, celledifferensiering og celle, overlevelse,3,,14,,15,,37. Enda viktigere, tillater det studiet av encellede linjene, fører til identifisering av de mellomliggende fasene vedtatt under progresjon fra NSCs til neurons3. Endelig, kombinasjonen av denne kultur-systemet med bioteknologi verktøy å manipulere genuttrykk er en kraftfull teknikk for å studere celle autonome effekten av valgte målene5. Metoden beskrevet her kan endres for å studere slektslinje hjernebarken progenitors isolert forskjellige utviklingsstadier14, samt NSCs isolert fra andre kilder38,42. Lignende metoder har også blitt brukt å studere celle linjene i den utvikle Netthinne41.
Her viser vi et enkelt eksperiment som bruker retroviral-mediert hva etiketten stamfar celler med en reporter fluorescerende protein. Men kan lignende mål oppnås med andre viral vektorer, kjemisk/elektrisk transfection eller transgene dyr uttrykke fluorescerende proteiner kontrollert av nevrale celle-type bestemte arrangørene38,39. Alle disse metodene til å kontrollere genuttrykk kan også brukes for å indusere eller undertrykke uttrykket av gener av interesse, slik at studiet av molekylære mekanismer involvert i nevrale stamceller avstamning progresjon15,18,39. Vi også forutse at dette systemet kan brukes til å vurdere hvordan ulike uttrykk nivåer av spesifikke proteiner regulere NSC atferd og neuronal/macroglial differensiering, ligner allerede gjort i blodkreft systemet40. Det kan også hjelpe for å belyse potensialet i enkelt progenitors generere separat neuronal overleveringslinjer.
Sammenlignet med andre teknikker rettet imaging pattedyr NSCs i live-dyr eller skive kulturer, har metoden beskrevet her noen viktige fordeler. For det første er lavprisalternativ metoden en betydelig fordel. Enkel invertert mikroskop utstyrt med sendt og fluorescens lys og et kamera kontrollert av datamaskin programvare kan brukes til å hente bilder i 2D kulturer for opptil flere uker. Dernest er antall dyr som brukes til disse eksperimentene betydelig mindre enn andre metoder. For det tredje, systemet tillater en presis kontroll over miljømessige forhold, og tillater analyse for celle autonome og ikke-celle-autonome virkningene av ulike manipulasjoner. Endelig enkeltceller kan observeres entydig for opptil 15 dager, slik at presis gjenoppbyggingen av store avstamning trær, som ikke er foreløpig mulig både i hjernebarken skjær kulturer eller i vivo. På den annen side, kan systemet presentere ulemper av vev organisasjon. Vi anbefaler derfor at mobilnettet atferd i disse 2D kulturer ideelt skal bekreftes av andre eksperimenter i vivo.
Tidligere data ved hjelp av dette systemet viser at cellen syklus forlengelse av kortikale stamfar i vivo48 er gjengitt i vitro15. Den neurogenic og gliogenic potensialet i individuelle hjernebarken progenitors er også etterlignet i 2D kultur systemet beskrevet her3. Til slutt, celle spredning og celle syklus Avslutt prosenter observert i vivo kan også bli etterlignet bruker denne cellen kultur systemet15,18. Derfor tror vi det live-imaging primære hjernebarken celler dyrket i forholdene beskrevet i denne protokollen er en kraftig og brukervennlig metode å studere cellulære og molekylære mekanismer som styrer stamfar celle spredning, neuronal og glial celledifferensiering og celle skjebne spesifikasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), KAPPER (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) og FAPERN (Fundação de Amparo en Pesquisa do Rio Grande do Norte).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
- Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449 (2015).
- Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76 (2015).
- Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
- Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
- Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
- Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
- Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
- Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
- Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
- Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
- Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
- Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
- Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
- Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
- Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
- Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
- Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
- Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
- Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).
