Summary
Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa para estudar comportamentos celulares em tempo real. Aqui, descrevemos um protocolo para Time-Lapse vídeo-microscopia das células do córtex cerebral primário que permite uma análise detalhada das fases promulgada durante a progressão da linhagem de células-tronco neurais primárias diferenciada de neurônios e glia.
Abstract
Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, as células progenitoras são submetidos a várias rodadas de simétricas e assimétricas de divisões celulares para gerar novos progenitores ou neurônios postmitotic. Mais tarde, alguns progenitores alternar para um destino gliogenic, adicionando às populações astrocyte e oligodendrocyte. Usando o Time-Lapse vídeo-microscopia de culturas de células do córtex cerebral primário, é possível estudar os mecanismos celulares e moleculares, controlando o modo de divisão celular e parâmetros do ciclo celular de células progenitoras. Da mesma forma, o destino das células postmitotic pode ser examinado usando proteínas fluorescentes repórter célula específica ou pós-imagem imunocitoquímica. Mais importante ainda, todas estas características podem ser analisadas a nível de célula única, permitindo a identificação dos progenitores comprometidos com a geração de tipos de células específicas. Manipulação da expressão genética também pode ser executada usando a transfeccao mediada por viral, permitindo o estudo dos fenômenos não-celular-autónomos e célula autónomos. Finalmente, o uso de proteínas fluorescentes fusão permite o estudo da distribuição simétrica e assimétrica de proteínas selecionadas durante a divisão e a correlação com o destino de células-filhas. Aqui, descrevemos o método vídeo-microscopia de lapso de tempo para células murino córtex cerebral primário por até vários dias de imagem e analisar o modo de divisão celular, comprimento do ciclo celular e destino das células recém-gerado. Também descrevemos um método simples para transfect células progenitoras, que podem ser aplicadas a manipular os genes de interesse ou simplesmente rotular células com proteínas de repórter.
Introduction
Células-tronco neurais (NSC) gerar neurônios e células de macroglial durante o desenvolvimento do córtex cerebral. No início-corticogenesis, NSCs passam por várias rodadas simétrica da divisão de pilha e expandir o pool de progenitor. Em seguida, NSCs dividir assimetricamente para gerar neurônios diretamente ou indiretamente através de de intermediários1. Somente no mid - ao tarde-corticogenesis, progenitores alternar para gerar astrócitos e oligodendrócitos2,3,4. No entanto, os completos mecanismos que controlam a proliferação celular e diferenciação, bem como a contribuição dos progenitores destino restrito à geração de tipos exclusivos de neurônios ou células de macroglial permanecem uma questão de debate intenso4,5,6. O potencial de NSCs corticais individuais para gerar neurônios, astrócitos e oligodendrócitos tem sido extensivamente estudados em vitro e em vivo usando uma miríade de técnicas tais como: viver de imagem em culturas de célula única7,8,9,10,11,12,13; ao vivo de imagens em alta densidade culturas culturas3,14,15; viver de imagem em fatia culturas16,17,18; clonal análise usando viral mediada por vector genético rotulagem em culturas de alta densidade14,15,19,20,21; análise clonal em vivo usando retrovírus22,23,24,25,26,,27,28,29,30,31,32,33; e análise clonal em vivo usando animais transgénicos34.
Cada uma dessas técnicas apresenta prós e contras. Por exemplo, na vivo rastreamento de linhagem é suscetível a divisão e amontoando erros3, levando a conclusões contraditórias sobre o potencial dos progenitores corticais individuais. Além disso, tanto estudos in vitro e em vivo baseiam sobre a rotulagem de células progenitoras nos pontos de tempo iniciais e posterior análise das linhagens de células pode ser influenciada pela ocorrência de morte celular durante a progressão de linhagem35sem ser detectado. Portanto, um sistema adequado para analisar o potencial de NSCs único deve permitir a identificação de todas as células geradas, bem como a caracterização adequada dos destinos de célula dentro da linhagem. Combinação de cultura de células primárias e de imagem ao vivo fornece essa configuração. Usando cultura de célula única e Time-Lapse vídeo microscopia, templo et al . demonstraram o interruptor na linhagem de progenitores individuais córtex cerebral da neurogênese gliogenesis11. Mais tarde, eles usaram o mesmo sistema para mostrar que diferentes tipos de neurônios são gerados a partir de um único progenitor cortical12. No entanto, este sistema apresenta uma ressalva importante: apenas 1% dos progenitores corticais isoladas no início corticogenesis gerar clones de 4 ou mais descendência9. Após a adição de FGF2, a frequência das células gerando 4 ou mais células aumenta para 8-10%9. No entanto, esse número é muito pequeno, Considerando que praticamente todos os progenitores corticais são proliferativas nesta fase. Além disso, os efeitos potenciais de FGF2 na especificação de destino não podem ser descartados36. Para contornar essas limitações, nós usamos a culturas de células de alta densidade que suportam a proliferação de ambos ventricular (Pax6-expressando) e progenitores cortical subventricular (Tbr2-expressando)15. Além disso, a observação em tempo real destas culturas demonstrou que várias características de progressão de linhagem NSC são reproduzidas sob estas condições, tais como modo de divisão celular, alongamento do ciclo celular, potencial de células únicas para gerar neurônios e glia, entre outros,3,15. Mais recentemente, também usamos este sistema para mostrar que a sinalização de CREB afeta a sobrevivência da pilha de neurônios imaturos córtex cerebral em ratos37. Assim, acreditamos que esse lapso de tempo vídeo-microscopia de córtex cerebral murino primário cultivados em alta densidade é uma ferramenta poderosa e acessível para estudar os mecanismos celulares e moleculares da progressão do ciclo celular, o modo de divisão celular, a sobrevivência da célula e a célula destino especificação. Este último pode ser realizado usando animais transgénicos, permitindo a identificação de destinos de célula específica em tempo real38,39,40 ou o uso de pós de imagem imunocitoquímica3,38,41,,42.
Aqui, nós fornecemos um protocolo passo a passo para preparar a cultura de células do córtex cerebral primário apoiando a proliferação de NSCs e a geração subsequente de neurônios e células macroglial. Também discutimos o uso do transfection retroviral mediada para manipular a expressão gênica de células individuais, que podem ser identificadas e controladas a nível de célula única usando microscopia vídeo lapso de tempo. Este protocolo pode ser usado para estudar as células do córtex cerebral primário isoladas desde o início até o fim do corticogenesis em roedores, mas alguns ajustes podem ser necessários de acordo com a etapa14. NSCs isoladas de outras fontes também podem ser estudadas usando microscopia de vídeo Time-Lapse de culturas 2D, mas o sistema de cultivo adequado deve ser determinado comparando célula comportamentos in vitro e in vivo38,43.
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Discussion
Observação em tempo real das células do córtex cerebral primário permite a análise da proliferação celular, modo de divisão celular, comprimento do ciclo celular, diferenciação celular e célula de sobrevivência3,14,15,37. Mais importante, permite o estudo das linhagens de célula única, para a identificação das fases intermédias promulgada durante a progressão de NSCs para neurônios3. Finalmente, a combinação deste sistema de cultura com ferramentas de bioengenharia para manipular a expressão de gene é uma técnica poderosa para estudar o efeito de célula autónomos de alvos selecionados5. O método descrito aqui pode ser modificado para estudar a linhagem dos progenitores de córtex cerebral isoladas em diferentes estádios de desenvolvimento14, bem como NSCs isoladas de outras fontes38,42. Métodos semelhantes também têm sido costumava estudar linhagens de célula no desenvolvimento da retina41.
Aqui, nós mostramos um experimento simples usando retroviral mediada transfecção de células progenitoras de rótulo com uma proteína fluorescente de repórter. No entanto, metas semelhantes podem ser conseguidas usando outros vetores virais, químico/elétrica transfeccao ou animais transgênicos expressando proteínas fluorescentes sob o controle do tipo de células neurais específicos promotores38,39. Todos estes métodos para controlar a expressão do gene também podem ser aplicados para induzir ou suprimir a expressão de genes de interesse, permitindo o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos em células-tronco neurais linhagem progressão15,18,39. Também prevemos que este sistema pode ser usado para avaliar a expressão como diferente níveis de proteínas específicas regulam NSC comportamento e neuronal/macroglial diferenciação, semelhante ao que foi feito no sistema hematopoiético40. Além disso, pode ajudar a lançar luz sobre o potencial dos progenitores único para gerar distintas linhagens neuronais.
Em comparação com outras técnicas destinadas a imagem NSCs mamíferos em animais vivos ou em culturas de fatia, o método descrito aqui tem algumas vantagens importantes. Em primeiro lugar, o baixo custo do método é um benefício significativo. Simples microscópios invertidos, equipados com transmitidos e luzes de fluorescência e uma câmera controlada por computador com base em software podem ser usados para adquirir imagens de culturas 2D para até várias semanas. Em segundo lugar, o número de animais utilizados para estes é significativamente menor do que em outros métodos. Em terceiro lugar, o sistema permite um controle preciso das condições ambientais, permitindo assim a análise dos efeitos de célula autónomos e não-celular-autónomos de diferentes manipulações. Finalmente, as células individuais podem ser observadas inequivocamente para até 15 dias, permitindo a reconstrução precisa de árvores de grande linhagem, que atualmente não é possível tanto no córtex cerebral fatia de culturas ou em vivo. Por outro lado, o sistema pode apresentar desvantagens associadas com a perda da organização do tecido. Portanto, recomendamos que o celulares comportamentos observados nestas culturas 2D devem ser idealmente confirmados por outros experimentos in vivo.
Dados anteriores usando este sistema que a célula ciclo alongamento do progenitor cortical na vivo48 são reproduzido em vitro15. A neurogênica e gliogenic potencial de individual córtex cerebral progenitores também são imitadas no sistema de cultura 2D descrito aqui3. Finalmente, rácios de saída do ciclo celular e proliferação celular observaram na vivo pode também ser imitada usando este celular cultura sistema15,18. Assim, acreditamos que viver de imagem das células do córtex cerebral primário cultivado nas condições descritas no presente protocolo é um método poderoso e fácil de usar para estudar os mecanismos celulares e moleculares, controlando a proliferação de células progenitoras, diferenciação celular neuronal e glial e especificação de destino da célula.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FAPERN (Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio Grande do Norte).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
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