Summary
Живая визуализация является мощным инструментом для изучения клеточного поведения в режиме реального времени. Здесь мы описываем протокол для покадровой видео микроскопии клетки первичной коры головного мозга, позволяющий подробного изучения фаз, принятый в ходе линии переход от первичного нервных стволовых клеток в дифференцированных нейронов и глии.
Abstract
В ходе развития головного мозга клетки-предшественники пройти несколько раундов симметричных и асимметричных клеточных делений для создания новых прародителями или Постмитотические нейронов. Позже некоторые прародителями переключиться на gliogenic судьбы, добавив экзоцитоз и Олигодендроциты населению. Использование отснятого видео микроскопия культур клеток первичной коры головного мозга, это возможно для изучения молекулярных и клеточных механизмов, контролирующих режим деления клеток и клеточного цикла параметров клеток-предшественников. Аналогично судьба постмитотических клеток может проверяться с помощью клеток конкретных флуоресцентные репортер белки или после визуализации иммуноцитохимии. Что еще более важно все эти особенности могут быть проанализированы на уровне одной ячейки, позволяя идентификации прародителями, совершенные в поколение типов конкретных клеток. Манипуляция экспрессии генов также может выполняться с использованием вирусных опосредованной трансфекции, позволяя изучение клеток автономной и клеток неавтономной явлений. Наконец использование флуоресцентных белков фьюжн позволяет исследование симметричного и асимметричного распределения отдельных белков во время разделения и корреляции с судьбой клетки дочи. Здесь мы описываем метод покадровой видео микроскопии изображений первичной коры головного мозга мышиных клетки для до нескольких дней и анализировать режим деления клеток, длина клеточного цикла и судьба вновь сгенерированный клеток. Мы также описать простой метод для transfect клеток-предшественников, которые могут быть применены для манипулирования генов интерес или просто ярлык клетки с репортером белков.
Introduction
Нервные стволовые клетки (НСК) генерировать нейронов и macroglial клетки во время разработки коры головного мозга. В начале corticogenesis NSCs пройти несколько раундов симметричный деления клеток и расширение пула прародителя. Затем NSCs делят несимметрично сформировать нейронов, прямо или косвенно через промежуточные1. Только в середине - до конца corticogenesis, прародители переключиться генерировать астроциты и Олигодендроциты2,3,4. Однако полная механизмы, которые управляют клеточной пролиферации и дифференциации, а также вклада ограничено судьбы прародителями для генерации уникальных типов нейронов или macroglial клетки остаются считанные интенсивных дебатов4,5,6. Потенциал отдельных корковых NSCs для создания нейронов, астроциты и Олигодендроциты был широко изучены в пробирке и в естественных условиях с помощью множество методов, таких как: жить изображений в сингл клеточных культур,78,9,10,11,12,13; живут изображений в высокой плотности культур культур3,,1415; живут изображений в ломтик культур16,17,18; Клональный анализ с использованием вирусный вектор опосредованной генетических маркировки в высокой плотности культур14,15,19,,2021; Клональный анализ в естественных условиях с помощью ретровируса22,23,24,25,26,27,28,29,30,,3132,33; и Клональный анализ в естественных условиях с использованием трансгенные животные34.
Каждый из этих методов представлены плюсы и минусы. К примеру в естественных условиях трассировки линии подвержен комков и расщепления ошибки3, ведущих к противоречивые выводы о потенциале отдельных корковых прародителей. Кроме того как в пробирке и в vivo исследования на основе маркировки прогениторных клеток в начале моменты времени и задняя анализ линий клеток может зависеть от незамеченными наступления смерти клетки во время lineage прогрессии35. Таким образом приемлемую систему для анализа потенциальных возможностей одного NSCs должны позволить идентификации всех созданных клеток, а также соответствующие характеристики клеток судьбы в lineage. Сочетание культуры главной ячейки и живой изображений обеспечивает этот параметр. С помощью одной клеточной культуры и покадровой видео микроскопии, Храм et al. показали переключатель линии отдельных коре прародителей от нейрогенез глиогенез11. Позже они использовали ту же систему чтобы показать, что различные типы нейронов создаются из одного кортикального прародитель12. Однако, эта система представляет важное предостережение: только 1% кортикальной прародителей, изолированных в начале corticogenesis создавать клоны 4 или больше потомства9. После добавления FGF2 частота генерации 4 или более ячеек клеток увеличивается до 8-10%9. Тем не менее это число является слишком мала, учитывая, что практически все корковых прародителями пролиферативной на этой стадии. Кроме того нельзя исключать потенциальные последствия FGF2 на судьбу спецификации36. Чтобы обойти эти ограничения, мы использовали высокой плотности клеточных культур, которые поддерживают распространения обоих желудочков (Pax6-выражая) и субвентрикулярной корковых прародителями (Tbr2-выражая)15. Кроме того в реальном времени наблюдения этих культур показал, что некоторые особенности НСК линии прогрессии воспроизводятся в этих условиях, таких как режим деление клеток, удлинение клеточного цикла, потенциал одиночных клеток генерировать нейронов и глии, среди прочих3,15. Совсем недавно мы использовали эту систему чтобы показать, что CREB-сигнализации влияет на выживание клетки незрелые коре нейронов в мышей37. Таким образом, мы считаем, что промежуток времени видео микроскопия первичной мышиных коре клеток, выращиваемых в высокой плотности является мощным и доступным инструментом для изучения молекулярных и клеточных механизмов клеточного цикла прогрессии, режим деления клеток, выживаемость клеток и клеток судьба спецификации. Последний может осуществляться с помощью трансгенных животных, позволяя определение судьбы конкретных клеток на реальном времени38,,3940 или использование после визуализации immunocytochemistry3,38,,41-42.
Здесь мы предоставляем пошаговые протокол подготовить культуры клеток первичной коры головного мозга, поддержки распространения NSCs и последующее поколение нейронов и macroglial клеток. Мы также обсудим использование антиретровирусной опосредованной трансфекции манипулировать экспрессии генов отдельных клеток, которые могут быть определены и отслеживаются на уровне одной ячейки, используя покадровой видео микроскопии. Этот протокол может использоваться для изучения клетки первичной коры головного мозга, изолированные от начала до конца corticogenesis грызунов, но несколько корректировок, которые могут потребоваться согласно этап14. NSCs, изолированный от других источников также могут быть изучены с помощью покадровой видео микроскопии 2D культур, но соответствующие культивирования система должна определяться путем сравнения клеток поведений in vitro и in vivo38,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Реальном времени наблюдения клеток первичной коры головного мозга позволяет анализ пролиферации клеток, режим деления клеток, длина клеточного цикла, дифференцировки клеток и клеток выживания3,14,15,37. Что еще более важно это позволяет исследование одноклеточных линий, ведущих к идентификации промежуточных этапов, принятый во время перехода от NSCs нейронов3. Наконец сочетание этой культуры системы с инструментами биоинженерии манипулировать экспрессии генов – это мощный метод для изучения клеток автономная эффект выбранной цели5. Метод, описанный здесь может быть изменен для изучения линии прародителями коры головного мозга, изолированные на различных этапах своего развития14, а также NSCs, изолированный от других источников38,42. Аналогичные методы использовались также для изучения линий клеток в развивающихся сетчатки41.
Здесь мы покажем простой эксперимент с помощью антиретровирусной опосредованной transfection клетки-предшественники ярлык с репортером флуоресцентный белок. Однако аналогичные цели могут быть достигнуты с помощью других вирусных векторов, химическая/электрические трансфекции или трансгенных животных, выражая флуоресцентных белков под контролем нервных клеток тип конкретных промоутеров38,39. Все эти методы контроля экспрессии генов может также применяться к побудить или подавлять экспрессию генов интерес, позволяя изучение молекулярных механизмов участвующих в нервных стволовых клеток линии прогрессии15,18,39. Мы также предполагаем, что эта система может использоваться для оценки как различные выражения уровня специфических белков регулировать НСК поведение и нейрональных/macroglial дифференцировки, похож на то, что было сделано в кроветворной системы40. Кроме того это может помочь пролить свет на потенциал одного прародителями для создания отдельных нейронов линий.
По сравнению с другими методами, направленных на визуализации NSCs млекопитающих живут животных или ломтик культур, метод, описанный здесь имеет ряд важных преимуществ. Во-первых лоу кост метода является значительным преимуществом. Простые Перевернутый Микроскопы оснащены передается и флуоресценции огни и камеры контролируется на основе компьютера программное обеспечение может использоваться для получения изображений 2D культур для до нескольких недель. Во-вторых количество животных, используемых для этих экспериментов значительно меньше, чем в других методов. В-третьих система позволяет точный контроль состояния окружающей среды, таким образом позволяя анализ клеток автономной и клеток неавтономной эффекты различных манипуляций. Наконец, однозначно отдельные клетки могут наблюдаться, на срок до 15 дней, позволяя точной реконструкции больших линии деревьев, который в настоящее время не возможно как в коре фрагмент культур или в естественных условиях. С другой стороны система может представлять недостатки, связанные с потерей ткани Организации. Поэтому мы рекомендуем клеточного поведения, наблюдается в этих 2D культур должны быть идеально подтверждены другие эксперименты в естественных условиях.
Предыдущие данные, с помощью этой системы показывают, что клетки цикла, удлинение корковых прародитель в vivo48 -воспроизводится в vitro15. Нейрогенные и gliogenic потенциал отдельных головного мозга предшественники также передразнил в системе 2D культуры описанных здесь3. Наконец пролиферация клеток и клеточного цикла выхода соотношения отметил, что в естественных условиях можно также имитировать с помощью этой клетки культуры системы15,18. Таким образом, мы считаем, что жить изображений первичной коры головного мозга клетки культивировали в условиях, указанных в настоящем Протоколе является мощный и удобный метод для изучения молекулярных и клеточных механизмов, контролирующих прародитель пролиферации клеток, нейронов и глиальных клеток и клеток судьба спецификации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e парке), накидки (повышению де Coordenação де Pessoal де уровня Superior) и FAPERN (Фонд-де-ампаро Pesquisa ду Риу-Гранди-ду-Норти).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
- Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449 (2015).
- Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76 (2015).
- Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
- Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
- Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
- Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
- Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
- Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
- Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
- Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
- Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
- Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
- Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
- Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
- Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
- Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
- Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
- Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
- Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).
