Summary
En proyección de imagen es una poderosa herramienta para estudiar el comportamiento celular en tiempo real. Aquí, describimos un protocolo para Time-lapse vídeo-microscopía de células de la corteza cerebral primaria que permite un examen detallado de las fases promulgadas durante la progresión del linaje de las células madre neurales primarias diferenciadas neuronas y glia.
Abstract
Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las células progenitoras someterse a varias rondas de divisiones celulares simétricas y asimétricas para generar nuevos progenitores o neuronas postmitotic. Más tarde, algunos progenitores cambiar a una suerte de gliogenic, añadiendo a las poblaciones de astrositos y oligodendrocyte. Usando Time-lapse vídeo-microscopía de cultivos de células de la corteza cerebral primaria, es posible estudiar los mecanismos celulares y moleculares que controlan el modo de la división celular y parámetros de ciclo celular de células progenitoras. Del mismo modo, el destino de postmitotic células puede ser examinado usando reportero fluorescente específica de la célula proteínas o proyección de imagen la inmunocitoquímica. Más importante aún, todas estas características pueden ser analizadas a nivel unicelular, permitiendo la identificación de progenitores comprometidos con la generación de tipos celulares específicos. Manipulación de expresión génica puede realizarse también mediante transfección viral mediada, lo que permite el estudio de fenómenos celulares autónomos y célula autónoma. Finalmente, el uso de proteínas fluorescentes de fusión permite el estudio de la distribución simétrica y asimétrica de las proteínas durante la división y la correlación con el destino de las células hijas. Aquí, describimos el método de microscopia video Time-lapse para primaria corteza cerebral células murinas para hasta varios días de la imagen y analizar el modo de división celular, duración del ciclo celular y destino de las células recién generadas. También describimos un método simple para transfectar las células progenitoras, que pueden aplicarse para manipular genes de interés o simplemente etiquetar las células con proteínas de reportero.
Introduction
Las células madre neurales (NSC) generan neuronas y células macroglial durante el desarrollo de la corteza cerebral. En principios corticogenesis, NSCs someterse a varias rondas de división simétrica de la célula y amplían las progenitoras. Entonces, NSCs dividen asimétricamente para generar las neuronas directamente o indirectamente a través de productos intermedios1. Sólo en medio - al final-corticogenesis, progenitores cambiar para generar astrocitos y oligodendrocitos2,3,4. Sin embargo, los mecanismos de información que controlan la proliferación celular y diferenciación, así como la contribución de los progenitores sino restringida a la generación de tipos singulares de neuronas o células macroglial siguen siendo un asunto de intenso debate4,5,6. El potencial de generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos de NSCs corticales individuales ha sido extensivamente estudiado en vitro y en vivo con una gran variedad de técnicas tales como: vivir en culturas de célula de solo7,8,9,10,11,12,la13; en vivo imágenes de alta densidad culturas culturas3,14,15; en vivo imagen en rebanada culturas16,17,18; Análisis clonal con viral mediada por vectores genéticos etiquetado en culturas de alta densidad14,15,19,20,21; Análisis clonal en vivo utilizando retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; y análisis clonal en vivo mediante animales transgénicos34.
Cada una de estas técnicas presenta ventajas y desventajas. Por ejemplo, en vivo calco de linaje es susceptible a los reagrupamientos y división errores3, conduce a conclusiones contradictorias acerca del potencial de los progenitores corticales. Además, tanto estudios in vitro e in vivo basan en el etiquetado de células progenitoras en momentos tempranos y posterior análisis de linajes celulares pueden estar influenciada por la ocurrencia de muerte celular durante la progresión de linaje35. Por lo tanto, un sistema apropiado para analizar el potencial de NSCs solo debe permitir la identificación de todas las células que generan, así como la caracterización apropiada de los sinos de la célula dentro del linaje. Combinación de cultivo celular primaria y la proyección de imagen vivo proporciona esta configuración. Usando sola célula cultura y microscopia video Time-lapse, Templo et al han demostrado el interruptor en el linaje de los progenitores de la corteza cerebral individual de neurogénesis gliogenesis11. Más tarde, utilizaron el mismo sistema para demostrar que se generan diferentes tipos de neuronas de un solo progenitor cortical12. Sin embargo, este sistema presenta una importante salvedad: sólo 1% de progenitores corticales aislados en corticogenesis temprano generar clones de 4 o más progenie9. Después de la adición de FGF2, la frecuencia de las células generadoras de 4 o más células aumenta a 8-10%9. Sin embargo, este número es demasiado pequeño teniendo en cuenta que prácticamente todos los progenitores corticales son proliferativos en esta etapa. Por otra parte, los efectos potenciales de FGF2 en Especificación de destino no se puede descartar de36. Para evitar estas limitaciones, se utilizaron cultivos de células de alta densidad que apoyan la proliferación de ambos ventricular (expresión de Pax6) y subventricular de progenitores cortical (Tbr2-expresando)15. Por otra parte, la observación en tiempo real de estas culturas ha demostrado que varias características de la progresión de linaje del NSC se reproducen en estas condiciones, como modo de división celular, alargamiento del ciclo celular, potencial de las células para generar neuronas y glia, entre otros3,15. Más recientemente, también hemos utilizado este sistema para mostrar que CREB-señalización afecta la supervivencia de la célula de las neuronas de la corteza cerebral inmadura en ratones37. Por lo tanto, creemos que Time-lapse vídeo-microscopía de corteza cerebral murina primaria las células cultivadas en alta densidad es una herramienta poderosa y accesible para el estudio de mecanismos celulares y moleculares de la progresión del ciclo celular, el modo de división celular, supervivencia celular y especificación de destino celular. Este último se puede lograr mediante animales transgénicos, permitiendo la identificación de destinos específicos de la célula en tiempo real38,39,40 o el uso de la proyección de imagen immunocytochemistry3,38,41,42.
Presentamos un protocolo paso a paso para preparar el cultivo de células de la corteza cerebral primaria apoyando la proliferación de NSCs y la subsecuente generación de neuronas y células macroglial. También discutimos el uso de la transfección mediada por retrovirus para manipular la expresión genética de células individuales, que pueden ser identificados y rastreados a nivel unicelular usando microscopia video Time-lapse. Este protocolo se puede utilizar para el estudio de las células de la corteza cerebral primaria aisladas desde el principio hasta el final de la corticogenesis en roedores, pero unos pocos ajustes pueden ser requeridos según la etapa14. NSC aislado de otras fuentes también puede ser estudiada usando microscopia video Time-lapse de culturas 2D, pero el sistema de cultivo adecuado debe determinarse comparando celulares comportamientos in vitro e in vivo38,43.
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Discussion
Observación en tiempo real de las células de la corteza cerebral primaria permite el análisis de la proliferación celular, el modo de división celular, duración del ciclo celular, diferenciación celular y la célula de supervivencia3,14,15,37. Lo más importante, permite el estudio de los linajes de unicelulares, conduce a la identificación de las fases intermedias promulgada durante la progresión de NSCs a neuronas3. Finalmente, la combinación de este sistema de cultivo con herramientas de bioingeniería para manipular la expresión genética es una técnica poderosa para estudiar el efecto célula Autónoma de objetivos seleccionados5. El método descrito aquí puede ser modificado para estudiar el linaje de los progenitores de la corteza cerebral aislados en diferentes etapas de desarrollo14, así como NSC aislado de otras fuentes38,42. Métodos similares se han utilizado también para el estudio de linajes celulares en la retina en desarrollo41.
Aquí, mostramos un sencillo experimento mediante transfección mediada por retrovirus a células progenitoras de etiqueta con una proteína fluorescente de reportero. Sin embargo, pueden lograrse metas similares utilizando otros vectores virales, químicos/eléctricos transfección o animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes bajo el control del tipo de células neuronales específicos promotores38,39. Todos estos métodos para controlar la expresión génica pueden aplicarse también para inducir o suprimir la expresión de genes de interés, permitiendo el estudio de mecanismos moleculares implicados en la célula de vástago neuronales linaje progresión15,18,39. También se prevé que este sistema puede utilizarse para evaluar la expresión de cómo los diferentes niveles de proteínas específicas regulan NSC comportamiento neuronal/macroglial diferenciación y, similar a lo que se ha hecho en el sistema hematopoyético40. También, puede ayudar a arrojar luz sobre el potencial de progenitores solo generar linajes neuronales separados.
En comparación con otras técnicas destinadas a la NSC de mamíferos en los animales viven o en las culturas de la rebanada de la proyección de imagen, el método descrito aquí tiene algunas ventajas importantes. En primer lugar, el bajo costo del método es un beneficio significativo. Microscopios invertidos simple dotados de transmiten y fluorescencia luces y una cámara controlada por software de computadora pueden utilizarse para adquirir imágenes de culturas 2D de hasta varias semanas. En segundo lugar, el número de animales usados para estos experimentos es significativamente menor que en otros métodos. En tercer lugar, el sistema permite un control preciso de las condiciones ambientales, permitiendo el análisis de efectos célula autónoma y células autónomas de diferentes manipulaciones. Finalmente, las células individuales se pueden observar claramente hasta por 15 días, permitiendo la reconstrucción exacta de los árboles de gran linaje, que actualmente no es posible tanto en corteza cerebral cortar las culturas o en vivo. Por otro lado, el sistema puede presentar desventajas asociadas con la pérdida de la organización del tejido. Por lo tanto, recomendamos que los comportamientos celulares observados en estas culturas 2D deben confirmarse idealmente por otros experimentos en vivo.
Los datos anteriores con este programa de sistema que el celular ciclo de alargamiento de la cortical del progenitor en vivo48 están reproducido en vitro15. El neurogénico y potencial gliogenic de cada corteza cerebral progenitores son también mímico en el sistema de cultivo 2D aquí descrito3. Finalmente, la proliferación de célula y ciclo celular salida ratios observan en vivo pueden también mímico usando esta célula cultura sistema15,18. Por lo tanto, creemos que en vivo imágenes de las células de la corteza cerebral primaria cultivado en las condiciones descritas en el presente Protocolo es un método potente y fácil de usar para el estudio de mecanismos celulares y moleculares de control de la proliferación de células progenitoras, diferenciación neuronal y glial de la célula y especificación de destino celular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), cabos (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) y FAPERN (Fundação de Amparo a Pesquisa Rio Grande do Norte).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
References
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