Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

Published: August 8, 2017 doi: 10.3791/56069
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

Abstract

קידוד מידע ביולוגי שנגיש לדורות מושגת בדרך כלל באמצעות שינויים רצף הדנ א. ירושה מאריכים מקודד חלבון קונפורמציה (במקום רצף) שהוצג זמן הפרדיגמה-shifting אבל נדיר. הדוגמאות מאופיין בצורה הטובה ביותר של רכיבים כגון epigenetic נמצאים prions, אשר בעלי התנהגות וההספק עצמית שיכולים להביא ביטוי heritable של פנוטיפים חדש. Prions ארכיטיפי רבים להציג דעה קדומה רצף מרשים של N/Q-עשיר ולהרכיב לתוך קיפול עמילואיד. אלה מאפיינים יוצאי דופן יש הודיע רוב המאמצים ההקרנה כדי לזהות חלבונים חדשים פריון. עם זאת, לפחות שלושה prions ידוע (כולל את הפריון המייסדים, PrPSc) לא הנמל מאפיינים אלו הביוכימי. לכן פיתחנו שיטה חלופית כדי לחקור את היקף הירושה חלבון מבוססת בהתבסס על מאפיין של פעולה המונית: ביטוי ארעית של חלבונים פריון מגדיל את תדירות שבו הם רוכשים קונפורמציה של העצמי-תבניות. מאמר זה מתאר שיטה לניתוח הקיבולת של שמרים ORFeome להפיק חלבון מבוססת ירושה. באמצעות אסטרטגיה זו, מצאנו כי בעבר > 1% של חלבונים שמרים יכול לתדלק את הופעתה של תכונות ביולוגיות היו מאריכים, יציב, וקם בתדירות גבוהה יותר מאשר מוטציה גנטית. יכול להיות מועסקים גישה זו תפוקה גבוהה על פני כל ORFeomes או פרדיגמה ההקרנה ממוקד עבור רשתות גנטיות ספציפיות או גירויים סביבתיים. בדיוק כמו מסכי גנטי קדימה להגדיר אינספור מסלולים התפתחותית, איתות, טכניקות אלה מספקים מתודולוגיה לחקור את ההשפעה של חלבון מבוססת ירושה תהליכים ביולוגיים.

Introduction

מערכות ביולוגיות חווים לעתים קרובות תנודות ארעי בשפע חלבון. בין אם אלה יש השפעה ממושכת בעיצוב של פנוטיפ של אורגניזם או של דורות העתיד עדיין לא ברור. המופעים הידועים ביותר של ביולוגיה זה לערב מחלקה נדיר של חלבונים, prions, אשר כונן את הופעתה של תכונות heritable ללא שינוי הגנום. במקום זאת, החלקיקים fectious pro, teinaceous וב -לשדר פנוטיפים באמצעות שינויים המנציחים את החלבון קונפורמציה1,2. סוג זה של ירושה התגלה כגורם של הדפוסים ירושה יוצא דופן של מחלה ניווניות הרסנית. עם זאת, מחקרים אורגניזמים ועד פטריות יונקים3,4,5,6,7,8,9,10 מאז גילו כי רכיבים דמויי פריון יכול להתייעץ ערך מסתגלת. למרות זאת, prions מתפרשת מרתקת אבל נדיר oddity ביולוגי.

זו חוכמה הרווחת מתקיים באופן חלקי בגלל האפיון של ירושה חלבון מבוססת זמן הוגבלה על ידי קבוצה קטנה של דוגמאות. מאמצי ההקרנה שיטתית ובמתמטיקה תמונה זו במידה ניכרת על-ידי זיהוי מספר bona אמן חדש prions11 וכמעט שני תריסר חלבון תחומים12 עם יכולת המרה הסתגלותי פריון כמו דלק. עם זאת, כי גישות אלה התמקדו בדרך כלל הטיות רצף חומצות אמיניות חזקה, prions זה התגלו לשתף את המאפיינים הביוכימי של המייסד שמרים prions [PSI+]13,14, [URE3]15,11,[RNQ+]16. אלה כוללים: 1) מודולרי תחומים שאינם עשירים מותח פולימריים זמן של אספרגין (N) וגלוטמין (Q) 2) הרכבה לתוך עמילואיד [פריון+] קונפורמציה17,18,19, ו- 3) להשלים את ההסתמכות על disaggregase Hsp104 פונקציה עבור הפצת נאמן מאמא ל בת13,20,21. ואכן, רבים בונה פיד ה prions, לרבות [גאר+], [הט-s], והוא אפילו את הפריון המקורי (PrPSc), יהיו חסרים תחת קריטריונים מחמירים כגון. אולי חשוב יותר, הם יהיו מסוגלים ללכוד את כל מנגנוני הרומן של ירושה מבוססי חלבונים22. לכן, מגוון ביולוגי אמיתי תופעות כאלה עשויים להיות הרבה יותר נפוץ בטבע מכפי ששוער.

כדי לחקור את השאלה הזו, הועסק אסטרטגיה תפוקה גבוהה, פרוטאום ברוחב. סימן היכר של כל prions, כולל PrPSc, [גאר+], והוא [הט-s], כי ביטוי ארעית של החלבונים סיבתי חזק מגביר את הקצב של פריון רכישה15,23,24,25,26. אנחנו ניצלו תכונה זו באופן שיטתי לשאול, על פני כולו שמרים ORFeome, אם הברית מבוסס-חלבון, epigenetic יציב יכול להיות ביוזמת transiently שייצור את ביטוי של חלבונים בודדים. ידוע שכי ביטוי חלבון יכול לשנות פנוטיפים27. עם זאת, פריון חלבונים הם יוצא דופן כי שלהם מתערובת זמנית מייצרת שינוי פנוטיפ זה heritable מאות רבות של דורות לאחר ביטוי ראשוני. בעבר לקחנו לנצל תכונה זו, כמו גם את דפוסי ירושה יוצא דופן של חלבון מבוססת מרכיבים גנטיים, לזהות עשרות חלבונים המסוגלים heritably חיווט מחדש נופים פנוטיפי מבלי לשנות את הגנום28. למרות כמה לזהות חלבונים היו בעבר המכונה prions, רובם היו לא, דבר המלמד את הכוח של גישה זו לחשוף את צורות חדשות של חלבון מבוססת ירושה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Prions הראשון שמרים זוהו על ידי שלהם יוצא דופן פנוטיפים ודפוסי מביך של ירושה. המאפיינים של אלה prions ואז שימשו לבניית אלגוריתמים, כלים חישוביים למסך חלבונים פריון נוספים. השיטה המתוארת כאן, לעומת זאת, נסיוני ומסתמך על ביטוי ארעית כדי ליצור מתמשך שינוי-a יציב מקודד המדינה קונפורמציה חלבון. עם זאת, אם היעילות של "זריעה" ההרכבות פריון על ידי ביטוי עבור כל חלבון נתון נמוך מאוד, את הפרוטאין ללא הרף יתגלה תוצאה שלילית שגויה במסכים ביטוי מסוג זה. אחד כגון השינוי כדי לתקן זאת תהיה לשימוש של פלסמיד 2-מיקרו-ביטוי חלבון בעתיד ניסויים. לבסוף כל פריון המושרה יש מערך ייחודי של פנוטיפים צמיחה, יהיה לא להיות ניכרת בכל מצב לבדיקה. לפיכך, מספר מצבים שונים, מנות נבדק מגביל את מספר פעולות האחזור.

חשוב לציין, שלא כל סוגי חלבון מבוססת ירושה באותה מידה יחולץ בשיטה זו. חלבונים לא יכול להיות overexpressed ביעילות או ללא רעילות ברור ייחסר ללא הרף. אלמנטים לא יציבים mitotically, כגון "mnemons", לא להפיץ בנות בעקבות ביטוי ראשוני22. לעומת זאת, סוגים אחרים של bistable חיים ארוכים מתגים יכולים להיגרם באופן תיאורטי דרך ביטוי ארעי42,43. עם זאת, מדינות אלה בדרך כלל אינם תלויים מכונות homeostatic חלבון או מדבקות באמצעות חלבונים "נזרע". בנוסף, prions המסתמכים על אחרים מלווים (מחוץ Hsp70 ו- Hsp104) או נשק נוספים של הרשת הומאוסטזיס חלבון עבור הפצת יכשל את מבחני התלות המלווה המתוארים כאן. לבסוף, חלבונים נמוכה שפע גם טופס עמילואיד ייתכן infectivity המחירים מתחת לגבול של זיהוי בכיוונון טרנספורמציה חלבון.

פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור גרימת יציב חלבון מבוססת epigenetic הברית באמצעות ביטוי חלבון, כמו גם רחוק במורד הזרם צעדים כדי לאמת אם אחד המושרה המדינה epigenetic הוא נגיף פיד ה bona . הדוגמה שהוצגו במאמר זה, Psp1, היא דוגמה של חלבון זה מציג דעה קדומה "פריון כמו" חומצת אמינו, יכול באופן תיאורטי ניתן לשחזר באמצעות בעבר פיתחה אלגוריתמים bioinformatic. אולם, חוסר היכולת של Psp1 ליצירת עמילואיד ותלות המלווה יוצא דופן שלה (Hsp104) צריך במהירות נפסל זה מניתוחי עוד יותר, ובכך לסלק אותה מן שיקול פריון. עם זאת, טכניקות ההקרנה הציג נייר זה אגנוסטי כדי בהנחות אלו, במקום להתמקד הדפוסים הבסיסית של ירושה, את כמות מספקת של חלבון לבד כדי לשדר על הפנוטיפים המתאימים. אכן, הרוב המכריע של חלבון מבוססת הירושה החלים בשיטה זו היה חסר הטיה רצף N/Q-עשיר.

בשיטה זו נעשה שימוש כדי לחקור את השמרים כולה ORFeome עבור הקיבולת שלו להפיק חלבון מבוססת הירושה בצורה לא משוחדת תוך שימוש רק מספר קטן של לחצים (כלוריד קדמיום 25 מ מ 1 מ"מ קובלט כלוריד, 2 מ מ נחושת גופרתית, 1 מ diamide, פלוקונאזול 0.2 מ מ, הידרוקסיוראה 50 מ מ, 20 מ מ מנגן כלורי, 0.75 מ מ paraquat, radicicol 50 מ מ, 80 J/m2 הקרנת UV סולפט אבץ 10 מ מ). עם זאת, גישה זו יכול בקלות להיות שונה מסך רשתות גנטיות או תגובות הסלולר ספציפיות באופן יותר ממוקד. לדוגמה, חלבונים הקשורים באופן פונקציונלי או כל החלבונים מוסדר ב רשת איתות דיסקרטית יכול להיות המושרה דרך ביטוי ארעי, מוקרן עם לחצים הקשורים לתפקוד הביולוגי שלהם. לעומת זאת, יכול להיות מוקרן ערכה גדול יותר של חלבונים עם ערכה מקיפה יותר של לחצים כדי לחקור אם תגובות ספציפיות הסלולר התפתחו באופן טבעי למעגן מתגים פריון. בסופו של דבר, למרות ביצענו מחקרים אלה בשמרים, היבטים רבים של הניסויים (למשל, ביטוי חלבונים ארעי, המלווה "אשפרה", וכדומה) יכול להכליל למערכות אחרות דגם בעתיד. לדוגמה, בתרבית של תרביות רקמה הוא נוטה ביטוי באמצעות מערכות מבוססות פלסמיד, קרינה פלואורסצנטית foci יכול להיות גם לשמש readout עבור heritable הרכבה עצמית, כפי שתואר לעיל28. יתר על כן, חלבונים רצפים של אורגניזמים אחרים יכול להיות ביטוי שמרים ונבדק ביכולתם להפיק ירושה כמו פריון באמצעות השיטות המתוארות כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים Sohini Chakrabortee סנדרה ג'ונס, דייוויד גרסיה, Bhupinder Bhullar, אמיליה צ'אנג, ריצ'רד היא, סוזן Lindquist לסיוע שלהם בפיתוח מבחני את הנייר הזה, כמו גם הבודקים המשמש את הערותיהם מתחשב.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine hydrochloride Sigma Cat#G3272-25G Chemical
Manganese chloride Sigma Cat#M8054-100G Chemical
Ethidium bromide Sigma E1510 Chemical
5-Fluoroorotic Acid Sigma Cat#F5013-50MG Chemical
BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 N/A Yeast strain
BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 N/A Yeast strain
Hsp70 (K69M)  Jarosz et al., 2014b N/A Plasmid
FLEXGene library Hu et al., 2007 N/A Plasmid library
Dextrose (glucose) Fisher Scientific D16-3 Media component
Raffinose Sigma R0250-25G Media component
Galactose Fisher Scientific BP656-500 Media component
CSM Sunrise Science 1001-100 Media component
CSM-URA Sunrise Science 1004-100 Media component
CSM-LYS Sunrise Science 1032-100 Media component
CSM-MET Sunrise Science 1019-100 Media component
CSM-LYS-MET Sunrise Science 1035-100 Media component
yeast extract Fisher Scientific BP1422-2 Media component
peptone Research Products International P20240-5000 Media component
bacto-peptone BD 211677 Media component
glycerol EMD Millipore GX0185-2 Media component
yeast nitrogen base w/o amino acids BD 291920 Media component
agar IBI Scientific IB49172 Media component
Adenine sulfate Sigma A3159-25G Media component
Potassium acetate Sigma P1190-500G Media component
Uracil Sigma U0750-100G Media component
Histidine Sigma H8000-100G Media component
Leucine Sigma L8000-25G Media component
Lysine Sigma L5501-25G Media component
RNase I  Thermo Fisher Scientific EN0601 Enzyme
biotinylated DNase Thermo Fisher Scientific AM1906 Enzyme
zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) Sunrise Science N0766555 Enzyme
Microplate reader BioTek Synergy H1 Equipment
Microplate stacker BioTek BioStack3 Equipment
Plate filler BiotTek EL406 Equipment
Liquid handling robot Beckman Coulter Biomek FX Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
  2. Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).
  3. Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
  4. True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
  5. Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
  6. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
  7. Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
  8. Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
  9. Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
  10. Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
  11. Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
  12. Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
  13. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  14. Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
  15. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  16. Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
  17. Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
  18. Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
  19. King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
  20. Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
  21. Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
  22. Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
  23. Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
  24. Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
  25. Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
  26. Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
  27. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  28. Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
  29. Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
  30. Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766 (2016).
  31. Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
  32. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  33. Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).
  34. Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
  35. Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
  36. Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
  37. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
  38. Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
  39. Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
  40. Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
  41. Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
  42. Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
  43. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 126 פריון שמרים מסך תפוקה גבוהה מתקפלים חלבון epigenetic הירושה הירושה מבוססי חלבונים
הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה <em>cerevisiae ס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Byers, J. S., Jarosz, D. F.… More

Byers, J. S., Jarosz, D. F. High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae. J. Vis. Exp. (126), e56069, doi:10.3791/56069 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter