Summary
इस प्रोटोकॉल कार्यात्मक प्रोटीन आधारित एस cerevisiaeमें वंशानुक्रम के लिए स्क्रीन के लिए एक उच्च-थ्रूपुट पद्धति का वर्णन करता है।
Abstract
भविष्य की पीढ़ियों के लिए पहुँच योग्य है जो जैविक जानकारी की एन्कोडिंग डीएनए अनुक्रम में परिवर्तन के माध्यम से आम तौर पर हासिल की है। लंबे समय रहते भाग प्रोटीन रचना (के बजाय अनुक्रम) इनकोडिंग लंबे समय प्रतिमान-स्थानांतरण लेकिन दुर्लभ रूप में देखा गया है। ऐसे epigenetic तत्वों के सर्वश्रेष्ठ विशेषता उदाहरण prions, जो नए phenotypes की आनुवंशिक अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते हैं एक स्वयं कोडांतरण व्यवहार के अधिकारी कर रहे हैं। कई ठेठ prions एक हड़ताली N/Q-रिच अनुक्रम पूर्वाग्रह प्रदर्शित और एक amyloid गुना में इकट्ठा। इन असामान्य सुविधाओं नए prion प्रोटीन की पहचान करने के लिए सबसे ज्यादा स्क्रीनिंग प्रयास बताया है। हालांकि, कम से कम तीन ज्ञात prions (संस्थापक prion, पीआरपीअनुसूचित जातिसहित) इन जैव रासायनिक लक्षण बंदरगाह नहीं। हम इसलिए बड़े पैमाने पर कार्रवाई की एक संपत्ति पर आधारित प्रोटीन आधारित भाग के दायरे से छानबीन करने के लिए किसी वैकल्पिक पद्धति विकसित: क्षणिक overexpression prion प्रोटीन की जिस पर वे एक स्व-templating रचना प्राप्त आवृत्ति बढ़ जाती है। इस कागज भाग प्रोटीन आधारित प्रकाश में लाना करने के लिए खमीर ORFeome की क्षमता का विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इस रणनीति का उपयोग करके, हम पहले पाया कि > 1% खमीर प्रोटीन का उद्भव जैविक लक्षण है कि स्थिर, लंबे समय रहते थे, और अधिक बार आनुवंशिक उत्परिवर्तन से पैदा हुई के ईंधन सकता है। इस दृष्टिकोण में उच्च throughput पूरे ORFeomes भर में या विशिष्ट आनुवंशिक नेटवर्क या पर्यावरण उत्तेजनाओं के लिए एक लक्षित स्क्रीनिंग प्रतिमान के रूप में नियोजित किया जा सकता। बस आगे आनुवंशिक स्क्रीन कई विकासात्मक और सिगनल रास्ते परिभाषित के रूप में, इन तकनीकों जैविक प्रक्रियाओं में वंशानुक्रम आधारित प्रोटीन के प्रभाव की जांच करने के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं।
Introduction
जैविक प्रणालियों अक्सर प्रोटीन बहुतायत में क्षणिक उतार चढ़ाव का अनुभव। चाहे ये phenotype एक जीव के या भविष्य की पीढ़ियों के आकार देने में एक स्थायी प्रभाव है अस्पष्ट बनी हुई है। यह जीव विज्ञान के सबसे प्रसिद्ध उदाहरण प्रोटीन, prions, जो आनुवंशिक लक्षण जीनोम संशोधन के बिना के उद्भव के लिए ड्राइव का एक दुर्लभ वर्ग शामिल है। इसके बजाय, इन प्रो मेंteinaceous और fectious कणों phenotypes प्रोटीन रचना1,2में स्व-अप्रवासी परिवर्तन के माध्यम से संचारित। इस प्रकार का वर्सा असामान्य भाग पैटर्न के एक विनाशकारी neurodegenerative रोग के कारण के रूप में की खोज की थी। हालांकि, अध्ययन से कवक स्तनधारी3,4,5,6,7,8,9,10 को लेकर जीवों में चूंकि prion की तरह तत्वों अनुकूली मूल्य प्रदान कर सकते हैं से पता चला है। फिर भी, prions एक दुर्लभ जैविक विषमता लेकिन आकर्षक रूप में देखा गया है।
प्रोटीन-आधारित वंशानुक्रम के लक्षण वर्णन लंबे समय उदाहरण के एक छोटे सेट द्वारा प्रतिबंधित किया गया है, क्योंकि इस प्रचलित ज्ञान भाग में आयोजित की जाती है। हाल ही में व्यवस्थित स्क्रीनिंग प्रयास इस चित्र काफी ईंधन prion की तरह पुष्टिकारी रूपांतरण करने के लिए क्षमता के साथ कई नए नेकनीयती फाइड prions11 और लगभग दो दर्जन से अधिक प्रोटीन डोमेन12 की पहचान करके चौड़ी है। हालांकि, इन तरीकों आम तौर पर मजबूत अमीनो एसिड अनुक्रम biases पर ध्यान केंद्रित किया है, क्योंकि prions कि खोज की गई है संस्थापक खमीर prions [साई+]13,14,15[URE3] और [RNQ+]11,16के जैव रासायनिक गुण साझा करें। ये शामिल हैं: 1) मॉड्यूलर डोमेन है कि पूर्ण 3) disaggregase माँ बेटी13,20,21से श्रद्धालु प्रचारण के लिए Hsp104 फ़ंक्शन पर निर्भरता और asparagine (N) और glutamine (Q), 2) एक amyloid [PRION+] रचना17,18,19, में विधानसभा के लंबे पॉलीमेरिक हिस्सों में अमीर हैं। सहित वास्तव में, कई नेकनीयती फाइड prions [GAR+], [Het-s], और यहाँ तक कि मूल prion (पीआरपीअनुसूचित जाति), ऐसे कड़े मानदंडों के तहत याद किया जाएगा। शायद अधिक महत्वपूर्ण बात, वे प्रोटीन आधारित भाग22के किसी भी उपन्यास तंत्र पर कब्जा करने में असमर्थ होगा। इस प्रकार, ऐसी घटना का सच जैविक चौड़ाई से प्रकृति में कहीं अधिक आम हो सकता है।
इस प्रश्न की जांच करने के लिए, एक उच्च-थ्रूपुट, proteome-व्यापी रणनीति कार्यरत था। सभी prions पीआरपीअनुसूचित जाति, [GAR+], सहित, की एक बानगी और [Het-s], है कि क्षणिक overexpression कारण प्रोटीन का जोरदार prion अधिग्रहण15,23,24,25,26की दर बढ़ जाती है। स्थिर प्रोटीन आधारित, epigenetic राज्यों transiently अलग-अलग प्रोटीन की overexpression उत्प्रेरण द्वारा शुरू किया जा सकता है, तो हम व्यवस्थित पूछो, ORFeome, पूरे भर में खमीर के लिए इस सुविधा का लाभ लिया। यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि प्रोटीन overexpression phenotypes27को बदल सकते हैं। हालांकि, prion प्रोटीन असामान्य हैं क्योंकि उनके अस्थायी overproduction प्रारंभिक overexpression के बाद की पीढ़ियों के कई सैकड़ों के लिए आनुवंशिक है phenotype में परिवर्तन पैदा करता है। हम पहले इस सुविधा का लाभ, साथ ही साथ असामान्य भाग पैटर्न दर्जनों प्रोटीन है कि heritably phenotypic परिदृश्य जीनोम28बदलने के बिना फिर से तारों के लिए सक्षम कर रहे हैं की पहचान करने के लिए प्रोटीन-आधारित आनुवंशिक तत्वों, के ले लिया। यद्यपि कुछ पहचाना प्रोटीन थे पहले ज्ञात prions के रूप में, विरासत आधारित प्रोटीन के नए रूपों को उजागर करने के लिए इस दृष्टिकोण की शक्ति underscoring थे ही नहीं।
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Discussion
पहले खमीर prions उनके असामान्य phenotypes और हैरान करनेवाला पैटर्न विरासत के द्वारा की पहचान की गई। इन prions के लक्षण तब एल्गोरिदम और अतिरिक्त prion प्रोटीन के लिए स्क्रीन के लिए गणना उपकरणों का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। यहाँ वर्णित विधि इसके विपरीत, प्रयोगात्मक है और क्षणिक overexpression राज्य-एनकोडेड प्रोटीन रचना में एक स्थायी परिवर्तन एक स्थिर बनाने के लिए पर निर्भर करता है। "Prion विधानसभा किसी भी दिए गए प्रोटीन के लिए overexpression द्वारा बीज बोने की क्रिया" की क्षमता बहुत कम है, तो हालांकि, कि प्रोटीन लगातार इस प्रकार के overexpression स्क्रीन में एक झूठी नकारात्मक के रूप में उभरेगा। इसे ठीक करने के लिए एक तरह के संशोधन एक 2-माइक्रोन प्लाज्मिड प्रोटीन overexpression के लिए भविष्य में उपयोग करने के लिए प्रयोग किया जाएगा। अंत में, प्रत्येक प्रेरित prion विकास phenotypes का अपना अनूठा सेट है, और नहीं हर हालत में स्पष्ट assayed हो जाएगा। इस प्रकार, विभिन्न स्थितियों और परीक्षण खुराक की संख्या हिट्स की संख्या को सीमित करता है।
महत्वपूर्ण बात, नहीं सभी प्रकार के प्रोटीन-आधारित भाग समान रूप से इस विधि का उपयोग कर पुनर्प्राप्त नहीं किया जा जाएगा। प्रोटीन है कि कुशलता से या विषाक्तता के बिना overexpressed किया जा सकता जाहिर है लगातार याद किया जाएगा। Mitotically अस्थिर तत्वों, "mnemons," जैसे कभी नहीं प्रारंभिक overexpression22के बाद बेटियों के लिए प्रचार करेंगे। इसके विपरीत, लंबे समय रहते bistable स्विचेस के अन्य प्रकार के सैद्धांतिक रूप से परिवर्तनीय overexpression42,43के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है। हालांकि, इन राज्यों विशेष रूप से प्रोटीन homeostatic मशीनरी पर निर्भर या प्रोटीन "वरीयता प्राप्त" के माध्यम से संक्रामक नहीं हैं। इसके अलावा, prions अन्य कुछ (Hsp70 और Hsp104) के बाहर या प्रचार के लिए प्रोटीन समस्थिति नेटवर्क के अतिरिक्त हथियारों पर भरोसा करते हैं कि यहाँ वर्णित हांकने-निर्भरता assays असफल होता। अंत में, एक कम बहुतायत प्रोटीन है कि भी रूप में amyloid प्रोटीन परिवर्तन सेटअप में infectivity दरों का पता लगाने की सीमा नीचे हो सकता है।
स्थिर प्रोटीन आधारित epigenetic राज्य प्रोटीन overexpression, के रूप में अच्छी तरह से सत्यापित करें कि क्या प्रत्येक epigenetic राज्य प्रेरित करने के लिए आगे डाउनस्ट्रीम चरणों के माध्यम से उत्प्रेरण एक नेकनीयती फाइड prion है के लिए इस प्रोटोकॉल एक तकनीक का वर्णन करता है। इस कागज में, Psp1, प्रस्तुत उदाहरण एक प्रोटीन जो एक एमिनो एसिड है "prion की तरह" पूर्वाग्रह प्रदर्शित करता है और सैद्धांतिक रूप से पहले का उपयोग कर पुनर्प्राप्त किया जा सकता का एक उदाहरण bioinformatic एल्गोरिदम विकसित किया है। हालांकि, Psp1 की अक्षमता amyloid और अपनी असामान्य हांकने निर्भरता (Hsp104) के रूप में करने के लिए जल्दी से यह विश्लेषण से आगे निरर्हित होगा और इस प्रकार यह prion विचार से सफाया कर दिया। हालांकि, इस समाचार पत्र में प्रस्तुत की गई स्क्रीनिंग तकनीक इन मान्यताओं को नास्तिक हैं और इसके बजाय भाग के अंतर्निहित पैटर्न और अकेले इसी phenotypes संचारित करने के लिए प्रोटीन की यथेष्टता पर ध्यान केंद्रित। दरअसल, प्रोटीन-आधारित भाग इस विधि के साथ बरामद की विशाल बहुमत N/Q-रिच अनुक्रम पूर्वाग्रह से रहित था।
यह विधि पूरे खमीर ORFeome प्रोटीन आधारित भाग केवल तनाव (25 मिमी कैडमियम क्लोराइड, 1 मिमी कोबाल्ट क्लोराइड, 2 मिमी कॉपर सल्फेट, 1 मिमी diamide, 0.2 mM fluconazole, hydroxyurea 50 मिमी, 20 मिमी मैंगनीज क्लोराइड, 0.75 मिमी paraquat, 50 मिमी radicicol, 80 J/एम2 यूवी विकिरण की एक छोटी संख्या का उपयोग कर एक निष्पक्ष फैशन में प्रकाश में लाना करने के लिए अपनी क्षमता के लिए जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और 10 मिमी जिंक सल्फेट)। हालांकि, इस दृष्टिकोण से आसानी से स्क्रीन आनुवंशिक नेटवर्क या विशिष्ट सेलुलर उत्तर करने के लिए एक लक्षित तरीके से संशोधित किया जा सका। उदाहरण, कार्यात्मक संबंधित प्रोटीन या सभी प्रोटीन में विनियमित के लिए एक असतत सिगनल नेटवर्क क्षणिक overexpression के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है और उनके जैविक कार्य करने के लिए संबंधित तनाव के साथ जांच की। इसके विपरीत, प्रोटीन का एक बड़ा सेट विशिष्ट सेलुलर उत्तर स्वाभाविक रूप से prion स्विच बंदरगाह के लिए विकसित किया गया है या नहीं की जाँच करने के लिए तनाव का एक और अधिक व्यापक सेट के साथ जांच की जा सकता है। अंत में, हम इन अध्ययनों में आयोजित किया है, हालांकि खमीर, प्रयोगों के कई पहलुओं (उदाहरण के लिए, क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति, ", इलाज" हांकने आदि) अन्य मॉडल प्रणाली के लिए भविष्य में सामान्यीकृत किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, स्तनधारी टिशू कल्चर प्लाज्मिड आधारित प्रणाली के माध्यम से overexpression करने के लिए उत्तरदायी है, और हो सकता है प्रतिदीप्ति foci भी इस्तेमाल किया जा के रूप में एक ऊंची आनुवंशिक स्व-संयोजन, के रूप में पहले वर्णित28के लिए। इसके अलावा, प्रोटीन-कोडिंग दृश्यों अन्य जीवों से कर सकते हो खमीर में व्यक्त की और prion की तरह वंशानुक्रम यहाँ बताई गई विधियों का उपयोग कर प्रकाश में लाना करने के लिए अपनी क्षमता का परीक्षण किया।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम Sohini Chakrabortee, Sandra जोन्स, डेविड गार्सिया, भूपिन्दर Bhullar, Amelia चांग, रिचर्ड वह और Susan Lindquist assays इस कागज, साथ ही समीक्षक उनके विचारशील टिप्पणी के लिए प्रयोग किया जाता के विकास में उनकी सहायता के लिए धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
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