Summary
Ce protocole décrit une méthode de haut-débit pour dépister fonctionnellement héritage basées sur les protéines chez S. cerevisiae.
Abstract
Le codage de l’information biologique qui est accessible aux générations futures est généralement réalisé par l’intermédiaire de modifications apportées à la séquence d’ADN. Longévifs héritage codé en protéine conformation (au lieu de séquence) a longtemps été considéré comme paradigme, mais rares. Les exemples les mieux caractérisées de tels éléments épigénétiques sont des prions, qui possèdent un comportement auto-assemblage qui permet de piloter la manifestation héréditaire de nouveaux phénotypes. Prions archétypales beaucoup affichent un biais de séquence riche en N/Q frappant et assemblent dans un giron amyloïde. Ces caractéristiques inhabituelles ont informé la plupart des efforts dépistage pour identifier de nouvelles protéines prion. Cependant, au moins trois prions connues (y compris le prion fondateur, PrPSc) héberger pas ces caractéristiques biochimiques. Nous avons donc mis au point une autre méthode pour sonder l’étendue de l’héritage à base de protéines basé sur un terrain d’action de masse : la passagère surexpression de la protéine prion augmente la fréquence à laquelle ils acquièrent une conformation self-création de modèles. Cet article décrit une méthode pour analyser la capacité de la levure ORFeome pour susciter l’héritage à base de protéines. En utilisant cette stratégie, nous avons constaté précédemment que > 1 % des protéines de levure pourrait alimenter l’émergence des traits biologiques qui étaient à long terme, stable et se pose plus fréquemment que la mutation génétique. Cette approche pouvant servir au haut débit à travers toute ORFeomes ou comme un paradigme de dépistage ciblé pour réseaux génétiques spécifiques ou des stimuli environnementaux. A l’instar des écrans génétiques avant définissent de nombreuses voies de signalisation et de développement, ces techniques offrent une méthodologie pour étudier l’influence de l’héritage basées sur les protéines dans les processus biologiques.
Introduction
Les systèmes biologiques expérience fréquemment des fluctuations transitoires dans l’abondance de la protéine. Ne sait pas si ceux-ci ont un impact durable dans l’élaboration du phénotype d’un organisme ou des générations futures. Les instances plus connus de cette biologie impliquent une classe rare des protéines prions, qui entraînent l’apparition de caractères héréditaires sans modification du génome. Au lieu de cela, ces particules de fectious proteinaceous et entransmettent les phénotypes via des changements qui se perpétues à la conformation de protéine1,2. Ce type d’héritage a été découvert comme étant la cause des modèles héritage inhabituelle d’une maladie neurodégénérative. Toutefois, des études dans les organismes allant des champignons aux mammifères3,4,5,6,7,8,9,10 ont révélé depuis que le prion comme éléments peuvent conférer la valeur adaptative. Néanmoins, les prions ont été considérées comme une fascinante mais rare curiosité biologique.
Cette sagesse qui prévaut est tenue en partie parce que la caractérisation de l’héritage à base de protéines a longtemps été limitée par un petit ensemble d’exemples. Les efforts récents de dépistage systématique ont élargi cette photo significativement en identifiant plusieurs nouveaux bona fide prions11 et protéines de près de deux douzaines de domaines12 avec la capacité de conversion conformationnelle de prion comme carburant. Cependant, puisque ces approches portent généralement sur des préjugés séquence des acides aminés, les prions qui ont été découverts partagent les propriétés biochimiques de la fondatrice levure prions [PSI+]13,14, [URE3]15et [RNQ+]11,16. Ceux-ci incluent : domaines 1) modulaires qui sont riches en longs polymères s’étend de l’asparagine (N) et de la glutamine (Q), ensemble 2) dans un amyloïde [PRION+] conformation17,18,19et 3) complet dépendance disaggregase Hsp104 fonction de multiplication fidèle de mère en fille13,20,21. En effet, nombreux bona fide prions, y compris [GAR+], [Het-s] et même l’origine prion (PrP-Sc), qui serait incomprise en vertu de ces critères stricts. Peut-être plus important encore, ils seraient incapables de capturer tout nouveaux mécanismes d’héritage à base de protéines,22. Ainsi, la vraie largeur biologique de ces phénomènes peut être beaucoup plus courante dans la nature que prévu.
Pour étudier cette question, a été employée une stratégie haut-débit, à l’échelle du protéome. Une caractéristique des prions tous, y compris les PrPSc, [GAR+], et [Het-s], est que la surexpression transitoire des causalité protéines augmente fortement le taux de prion acquisition15,23,24,25,26. Nous avons profité de cette fonctionnalité de systématiquement demander, sur l’ensemble de la levure ORFeome, si des États stables basées sur les protéines, épigénétiques pourraient être initiées par transitoirement induire la surexpression de protéines individuelles. Il est bien connu que la surexpression de protéines peut altérer les phénotypes27. Toutefois, la protéine prion est inhabituelle car leur surproduction temporaire produit un changement dans le phénotype c’est héréditaire pour plusieurs centaines de générations après la surexpression initiale. Nous avons déjà pris parti de cette fonctionnalité, ainsi que les patrons de succession inhabituelle d’éléments génétiques basées sur les protéines, à identifier des dizaines de protéines capables de duplications recâblage paysages phénotypiques sans altérer le génome28. Bien que certains ont identifié les protéines étaient anciennement prions, la plupart n’étaient pas, soulignant la puissance de cette approche pour découvrir de nouvelles formes d’héritage à base de protéines.
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Discussion
Les premiers prions de levure ont été identifiées par leurs phénotypes inhabituelles et modèles déconcertants de l’héritage. Les caractéristiques de ces prions ont ensuite servis à construire des algorithmes et des outils informatiques pour dépister les protéines prions supplémentaires. La méthode décrite ici, en revanche, est expérimentale et s’appuie sur la surexpression transitoire pour créer une écurie durable de changement-a état codé dans la conformation des protéines. Toutefois, si l’efficacité du « ensemencement » Assemblée prion par la surexpression d’une protéine donnée est très faible, cette protéine continuellement émergera comme un faux négatif dans les écrans de la surexpression de ce type. Une telle modification pour corriger ce problème serait d’utiliser un plasmide de 2 microns pour la surexpression de la protéine à l’avenir des expériences. Enfin, chaque prion induite a son propre ensemble de phénotypes croissance et ne va pas être évident dans toutes les conditions dosé. Ainsi, le nombre de différentes conditions et doses testées limite le nombre de visites.
Ce qui est important, pas tous les types d’héritage à base de protéines seront également récupérés à l’aide de cette méthode. Les protéines qui ne peuvent pas être surexprimés efficacement ou sans toxicité seront évidemment constamment ressenties. Les éléments mitotiquement instables, tels que « mnemons », seraient propageraient jamais aux filles après la surexpression initiale22. En revanche, autres types de commutateurs bistables longue durée de vie pourraient théoriquement être induites par l’intermédiaire de surexpression transitoire42,43. Toutefois, ces États ne sont généralement pas dépendants sur les mécanismes homéostatiques protéine ou transmissible par l’intermédiaire de protéines « graines ». En outre, prions qui dépendent d’autres chaperons (à l’extérieur de la Hsp70 et Hsp104) ou armes supplémentaires du réseau homéostasie protéiques pour la propagation ne satisferait pas les dosages de chaperon-dépendance décrites ici. Enfin, une protéines de faible abondance qui forment également amyloide pourraient avoir taux d’infectiosité inférieure au seuil de détection dans les paramètres de transformation de protéines.
Ce protocole décrit une technique pour induire des États épigénétiques stables basées sur les protéines par la surexpression de la protéine, mais aussi des mesures en aval à valider si chacun induite état épigénétique est un prion bona fide . L’exemple présenté dans cet article, Psp1, est un exemple d’une protéine qui affiche un biais d’acides aminés « prion-like » et pourrait théoriquement être récupérée en utilisant déjà développé des algorithmes de bioinformatique. Cependant, l’incapacité de Psp1 pour former l’amyloïde et sa dépendance inhabituelle chaperon (Hsp104) serait ont rapidement il inhabile à approfondir les analyses et donc il éliminé de l’examen de prion. Cependant, les techniques de dépistage présentés dans cet article sont agnostiques à ces hypothèses et plutôt se concentrent sur les modèles sous-jacents de l’héritage et la suffisance de la protéine seul de transmettre les phénotypes correspondants. En effet, la grande majorité de l’héritage à base de protéines Récupérée à l’aide de cette méthode était dépourvu de préjugés séquence riche en N/Q.
Cette méthode a été utilisée pour sonder la levure toute ORFeome pour sa capacité à susciter l’héritage basées sur les protéines de façon impartiale, en utilisant seulement un petit nombre de facteurs de stress (chlorure de cadmium de 25 mM, dichlorure de cobalt 1 mM, sulfate de cuivre de 2 mM, 1 mM diamide, 0,2 mM fluconazole, hydroxyurée 50 mM, chlorure de manganèse de 20 mM, paraquat 0,75 mM, 50 mM radicicol, 80 J/m2 irradiation UV et sulfate de zinc 10 mM). Toutefois, cette approche pourrait facilement être modifiée pour réseaux génétiques écran ou réponses cellulaires spécifiques de manière plus ciblée. Pour exemple, protéines fonctionnellement reliées ou toutes les protéines sont réglementés dans un réseau de signalisation discrète pourrait être induit par l’intermédiaire de surexpression transitoire et diffusé stresseurs liés à leur fonction biologique. En revanche, un vaste ensemble de protéines pourrait subir avec un ensemble plus complet d’agents stressants pour étudier si les réponses cellulaires spécifiques ont naturellement évolué pour héberger des commutateurs de prion. Enfin, bien que nous avons effectué ces études en levure, beaucoup d’aspects des expériences (par exemple, l’expression protéique transitoire, chaperon, « guérir », etc.) puissent être généralisés à d’autres systèmes de modèle à l’avenir. Par exemple, culture de tissus mammifères se prête à la surexpression par l’intermédiaire de systèmes axés sur le plasmide et foyers de fluorescence peuvent être également être utilisé comme une lecture pour héréditaires auto-assemblage, comme décrit précédemment28. En outre, les séquences codant pour des protéines provenant d’autres organismes pourraient être exprimées chez la levure et testés pour leur capacité à déclencher des prions comme héritage à l’aide des méthodes décrites ici.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She et Susan Lindquist ont aidé à développer les dosages utilisés dans ce document, ainsi que les réviseurs pour leurs commentaires judicieux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
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