Summary
このプロトコルでは、出芽酵母でタンパク質に基づく継承のため画面の機能的に高スループット方法論について説明します。
Abstract
将来の世代にアクセス可能な生物学的情報のエンコードは、DNA シーケンスの変更を介して達成される一般に。(シーケンスではなく) 蛋白質立体構造でエンコードされた長寿命の継承は、パラダイム シフトしますが、珍しいとして表示されている長い。などのエピジェネティックな要素の最高の特徴の例は、プリオンは、新しい表現型の遺伝的症状をドライブすることができます自己組織化挙動を所有しています。多くの典型的なプリオンは印象的な豊富な N/Q シーケンス バイアスを表示し、アミロイドの折りにアセンブルします。これらの珍しい特徴は、新しいプリオン蛋白質を識別するほとんどのスクリーニングの努力を知らせています。ただし、(創設のプリオン、PrPScを含む)、少なくとも 3 つの知られているプリオンは、これらの生化学的な特徴を港ないです。したがってプローブ質量作用のプロパティに基づいて蛋白質ベースの継承の範囲に代替法を開発した: プリオン蛋白質の一時的な過剰発現する彼らは自己テンプレート構造を取得頻度が増加します。本稿では、蛋白質ベースの継承を引き出す酵母 ORFeome の能力を分析するためのメソッドについて説明します。この戦略を使用して、我々 は以前ことを発見した > イースト蛋白質の 1% は長寿命、安定した遺伝の突然変異よりも頻繁に起こったされ生物学的形質の出現を燃料でした。全体 ORFeomes 全体または特定の遺伝子ネットワークまたは環境刺激の標的スクリーニング パラダイムとして、高スループットでこの方法を採用できます。同様に前方遺伝的画面多数発達とシグナル伝達経路を定義する、これらの技術は生物学的過程での蛋白質ベースの継承の影響を調査するための方法論を提供します。
Introduction
生物学的システムはよくタンパク質豊富で過渡変動を経験します。これらは有機体のまたは将来の世代の表現型を形作る上で永続的な影響をあるかどうかは不明します。この生物の最も有名なインスタンスを含むタンパク質、プリオンは、ゲノム修正なしの遺伝性の特性の出現をドライブの珍しいクラス。代わりに、これらのプロの teinaceous とのfectious 粒子タンパク質構造1,2の自己永続的変更による表現型を送信します。この型を継承は、壊滅的な神経変性疾患の異常な継承のパターンの原因として発見されました。しかし、菌類から哺乳類3,4,5,6,7,8,9,10まで及ぶ有機体の研究は以来プリオンのような要素が適応値を与えることができること明らかに。それにもかかわらず、プリオンは、魅惑的で珍しい生物風変わりなしかしとして表示されています。
この相場の知恵は、継承の蛋白質ベースの特性は長い例の小さなセットによって制限されているので一部で開催されます。最近の組織的スクリーニングの努力は大幅燃料プリオンのような構造変換する能力を持ついくつかの新しいbona fideプリオン11およびほぼ 2 つのダース蛋白質ドメイン12を識別することによってこの画像を拡大しています。ただし、これらのアプローチは、一般的に強力なアミノ酸シーケンス バイアスを当てている、ので、発見されているプリオンは創立酵母プリオン [PSI+]13,14、[URE3]15[RNQ+]11,16の生化学的性質を共有します。これらが含まれます: 1) モジュラー ドメイン アスパラギン (N) とグルタミン (Q)、2)、アミロイド [プリオン+] 構造17,18,に19アセンブリの長い高分子の伸張に富んでいる、3) 完了 disaggregase 母から娘13,20,21に忠実な伝播のための Hsp104 関数に依存します。確かに、多くbona fideプリオンを含む [ガー+] [ヘット s]、元プリオン (PrPSc) にも、このような厳しい条件下では見逃されること。おそらくもっと重要なは、彼らことはできません蛋白質ベースの継承22の任意の新規メカニズムをキャプチャします。したがって、このような現象の真の生物学的幅は、はるか以前の仮定より自然で一般的な可能性があります。
この問題を調べるためには、高スループット、プロテオーム的戦略が採用されました。PrPSc[ガー+] を含む全てのプリオンの特徴 [ヘット-s] は、原因タンパク質の一過性発現が強くプリオン買収15,23,24,25,26の率を増加することとします。一過性個々 のタンパク質の発現を誘導することによって安定した蛋白質ベース、エピジェネティック状態を開始できる場合、体系的に全体にわたって酵母の ORFeome、お願い、この機能の利用をしました。その蛋白の過剰発現は、表現型27を変更できますをよく知られています。しかし、彼らの一時的な過剰世代初期の過剰発現後の数百の遺伝性は表現型の変化を生成するため、プリオン蛋白質は通常ありません。以前、ホリールード ゲノム28を変えないで表現型の風景を再配線することができる蛋白質の多数を識別するために、タンパク質ベース遺伝的要素の異常な継承のパターンだけでなく、この機能を利用しました。いくつかの特定蛋白質以前として知られていたプリオン、ほとんどなかった、タンパク質ベースの継承の新たな形態を明らかにするこのアプローチの力を強調します。
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Discussion
最初の酵母プリオンは、彼らの異常な表現型と継承の複雑なパターンによって識別されました。これらのプリオンの特性は、アルゴリズムと計算ツール追加プリオン蛋白質のため画面を構築するそれから使用されました。ここで説明する方法は対照的は実験的一時的な過剰発現タンパク質の立体構造の状態でエンコードされた永続的な変更は安定を作成するに依存しています。ただし、任意の特定の蛋白質の過剰発現によるプリオン アセンブリを「シーディング」の効率が非常に低い場合、そのタンパク質はこのタイプの過剰発現画面で偽陰性として出現継続的に。この問題を解決する 1 つこのような変更は、将来的に蛋白の過剰発現に 2 ミクロン プラスミドを使用する実験でしょう。最後に、各誘導のプリオンは成長の表現型の独自のセットがすべての条件で明白な試金しません。したがって、さまざまな条件と用量テストの数は、ヒット数を制限します。
重要なは、すべての種類のタンパク質に基づく継承同様に回復されますこのメソッドを使用しています。タンパク質を効率的に毒性の有無で過剰に発現することはできません明らかに継続的に逃されます。"Mnemons、"などの有糸分裂不安定な要素は決して初期過剰発現22を次の娘に反映されます。対照的に、長命の双安定のスイッチの他のタイプは一過性発現42,43経由で誘導することが理論的に。しかし、これらの状態は通常蛋白質の恒常性機械に依存して「シード」蛋白質を介して伝染です。さらに、他のシャペロン (Hsp70 の Hsp104 外) または伝播の蛋白質の恒常性ネットワークの追加武器に依存するプリオンここで説明したシャペロン依存関係の試金は失敗します。最後に、またアミロイドを形成する低豊富な蛋白質は蛋白質の変換設定で検出限界以下の感染率があります。
このプロトコルでは、 bona fideプリオンは、それぞれ誘起エピジェネティックな状態かどうかを検証するためさらに下流ステップと同様に蛋白過剰発現を介して安定した蛋白質ベースのエピジェネティックな状態を誘導するための手法について説明します。Psp1、本稿で紹介するサンプルは、「プリオンのような"アミノ酸バイアスを表示して以前を使用して理論的に回復できる蛋白質の例バイオインフォマティクス アルゴリズムを開発しました。しかし、Psp1 のアミロイドとその異常なシャペロン依存性 (Hsp104) を形成することができないだろうがすぐにそれを失格とさらなる分析、こうしてプリオンの考察からそれを排除します。ただし、本稿で紹介するスクリーニング手法はこれらの仮定に依存しない、代わりに継承の基になるパターンと対応する表現型を転送するだけでタンパク質の十分性に焦点を当てます。確かに、この方法で回復蛋白質ベースの継承の大半は豊富な N/Q シーケンス バイアスに欠けていた。
このメソッド全体の酵母ストレッサー (25 mM 塩化カドミウム、塩化コバルト 1 mM、2 mM 銅硫酸塩、1 mM 著者、0.2 mM フルコナゾール、50 mM ヒドロキシウレア、塩化マンガン 20 mM、0.75 mM パラコート、50 ミリメートル radicicol、80 J/m2紫外線照射の数が少ないを使用して公平な方法で蛋白質ベースの継承を引き出すためにその容量の ORFeome をプローブに使用されました。、及び硫酸亜鉛 10 mM)。ただし、このアプローチよりターゲットを絞った方法で画面遺伝的ネットワークや特定の細胞に簡単に修正できます。例、機能的に関連蛋白質またはすべての蛋白質で規制の離散のシグナル伝達ネットワークを一時的な過剰発現によるし、ストレッサー、生物学的機能に関連の上映でした。対照的に、細胞の特定の応答が自然にプリオン スイッチを港に発展したかどうかを調査するストレッサーのより包括的なセットを持つ蛋白質のより大きいセットを選別できます。最後に、これらの研究を行ったが酵母、実験の多くの側面 (例えば、一時的な蛋白質の表現、「硬化」シャペロンなど)、将来的に他のモデル システムを一般化する可能性が。たとえば、哺乳類の組織培養は過剰発現プラスミド ベースのシステム経由で影響を受けやすい、蛍光巣ことができる遺伝的自己組織化として前述した28の読み出しとして使用します。さらに、他の生物からの蛋白質のコーディング シーケンスを酵母で発現し、ここで説明する方法を使用してプリオンのような継承を引き出す能力のテストでした。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は、彼らの思慮深いコメントの校閲者と同様に、本稿で使用される試金の開発に彼らの支援のため Sohini Chakrabortee、サンドラ ・ ジョーンズ、ダビド ガルシア、Bhupinder Bhullar、アメリア チャン、彼女はリチャードとスーザン ・ リンドキストをありがちましょう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
- Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).
- Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
- Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
- Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
- Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
- Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
- Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
- Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
- Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
- Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
- Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
- Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
- Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
- Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
- Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
- Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
- Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
- Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
- Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
- Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766 (2016).
- Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).
- Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
- Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
- Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
- Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
- Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
- Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
- Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).
