Summary
Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.
Abstract
De codering van biologische informatie die toegankelijk is voor toekomstige generaties wordt over het algemeen bereikt via veranderingen in de opeenvolging van DNA. Ingezien langlevende overname gecodeerd in eiwit conformatie (eerder dan reeks) lang als paradigma-shifting maar zeldzaam. De beste gekarakteriseerd voorbeelden van dergelijke epigenetische elementen zijn prionen, die een zelfassemblerende gedrag dat de erfelijke manifestatie van nieuwe fenotypen rijden kan bezitten. Vele archetypische prionen weergeven een opvallende N/Q-rijke reeks bias en monteren in een amyloïde schoot. Deze ongebruikelijke kenmerken hebben laten weten dat de meeste screening inspanningen te identificeren van nieuwe prion-eiwitten. Ten minste drie bekende prionen (met inbegrip van de stichtende prion, PrPSc) doen echter niet deze biochemische kenmerken haven. Daarom ontwikkelden we een alternatieve methode om de sonde van de werkingssfeer van de op basis van eiwitten overname op basis van een eigenschap van massa-actie: de voorbijgaande overexpressie van prion-eiwitten verhoogt de frequentie waarop zij een zelf-templating bevleesdheid verwerven. Dit document beschrijft een methode voor het analyseren van de capaciteit van de gist ORFeome te verduidelijken met overname op basis van eiwitten. Met behulp van deze strategie, eerder vonden we dat > 1% van gist eiwitten kon brandstof de opkomst van biologische eigenschappen die waren langlevende, stabiel, en vaker dan genetische mutatie is ontstaan. Deze aanpak kan worden gebruikt in hoge-doorvoer over de gehele ORFeomes of als een gerichte screening paradigma voor specifieke genetische netwerken of milieu prikkels. Net zoals voorwaartse genetische schermen talrijke ontwikkelings- en signalering trajecten definiëren, bieden deze technieken een methodologie voor het onderzoek naar de invloed van overname op basis van eiwitten in biologische processen.
Introduction
Biologische systemen ervaren vaak voorbijgaande fluctuaties in eiwit overvloed. Het is onduidelijk of deze hebben een blijvende invloed bij het vormgeven van het fenotype van een organisme of van de toekomstige generaties. De bekendste voorbeelden van deze biologie betrekken een zeldzame klasse van eiwitten, prionen, die het ontstaan van erfelijke eigenschappen genoom ongewijzigd rijden. In plaats daarvan zenden deze proteinaceous en infectious deeltjes fenotypen via zichzelf onderhoudende wijzigingen aan eiwit conformatie1,2. Dit soort erfenis werd ontdekt als de oorzaak van de ongewone erfenis patronen van een verwoestende neurodegeneratieve ziekte. Echter, studies in organismen variërend van schimmels aan zoogdieren3,4,5,6,7,8,9,10 aangezien is gebleken dat het prion-achtige elementen adaptieve waarde kunnen verlenen. Prionen hebben echter werd bekeken als een fascinerende maar zeldzame biologische eigenaardigheid.
Deze heersende wijsheid is gedeeltelijk gehouden omdat de karakterisering van proteïne gebaseerde overname lang met een klein aantal voorbeelden is beperkt. Recente systematische screening inspanningen hebben deze foto aanzienlijk verruimd door het identificeren van verschillende nieuwe bona fide prionen11 en bijna twee dozijn eiwit domeinen12 met het vermogen om brandstof prion-achtige conformationele conversie. Echter, omdat deze benaderingen over het algemeen op sterke aminozuur reeks vooroordelen gericht hebben, delen de prionen die zijn ontdekt de biochemische eigenschappen van de stichtende gist prionen [PSI+]13,14, [URE3]15en1611,[RNQ+]. Deze omvatten: 1) modulaire domeinen die rijk zijn aan lang polymere stukken van asparagine (N) en glutamine (Q), 2) vergadering in een amyloïde [PRION+] conformatie17,18,19, en 3) volledige afhankelijkheid van disaggregase Hsp104 functie voor trouwe vermeerdering van moeder op dochter13,20,21. Inderdaad, vele bona fide prionen, waaronder [GAR+], [Het-s], en zelfs de oorspronkelijke prion (PrPSc), onder dergelijke strenge criteria zouden worden gemist. Misschien nog belangrijker, zou ze kunnen vangen elke nieuwe mechanismen van overname op basis van eiwitten22. De echte biologische breedte van dergelijke verschijnselen kunnen dus veel vaker in de natuur dan eerder aangenomen.
Om te onderzoeken van deze vraag, een high-throughput, Proteoom-brede strategie werkte. Een kenmerk van alle prionen, met inbegrip van PrPSc, [GAR+], en [Het-s], is dat de voorbijgaande overexpressie van de causale eiwitten sterk verhoogt het tarief van prion overname15,23,24,25,26. We profiteerde van deze functie te systematisch vragen, over de gehele gist ORFeome, als stabiel op basis van eiwitten, epigenetische Staten kon worden gestart door Transient inducerende de overexpressie van individuele eiwitten. Het is bekend dat eiwit overexpressie fenotypen27kunt wijzigen. Prion-eiwitten zijn echter ongebruikelijk omdat hun tijdelijke overproductie produceert een verandering in fenotype thats erfelijke voor vele honderden generaties na de initiële overexpressie. Eerder hebben we voordeel van deze functie, alsook de ongewone erfenis patronen van op basis van eiwitten genetische elementen te identificeren van tientallen eiwitten die kunnen heritably bedrading opnieuw fenotypische landschappen zonder te veranderen van het genoom28. Hoewel sommige geïdentificeerd waren eiwitten voorheen bekend als prionen, de meeste waren niet onderstrepen van de kracht van deze aanpak te ontdekken van nieuwe vormen van overname op basis van eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eerste gist prionen werden geïdentificeerd door hun ongewone fenotypes en verbijsterende patronen van overerving. De kenmerken van deze prionen werden vervolgens gebruikt om te bouwen van algoritmen en computerhulpmiddelen aan het scherm voor extra prion-eiwitten. De hier beschreven methode in tegenstelling, is experimenteel en voorbijgaande overexpressie maken een duurzame verandering-een stabiele staat-gecodeerd in eiwit conformatie afhankelijk. Echter, als de efficiëntie van het "zaaien" prion vergadering door overexpressie voor een bepaalde proteïne zeer laag is, dat eiwit zal voortdurend ontstaan als een valse negatief in overexpressie schermen van dit type. Een dergelijke wijziging om dit te corrigeren zou gebruik van een 2-micron plasmide voor eiwit overexpressie voortaan experimenten. Tot slot, elke geïnduceerde prion heeft zijn eigen unieke set van groei fenotypes en zal niet worden herkenbaar in elke toestand bepaald. Dus beperkt het aantal verschillende omstandigheden en doses getest het aantal hits.
Nog belangrijker is, worden niet alle soorten eiwit gebaseerde erfenis even hersteld met behulp van deze methode. Eiwitten die kunnen niet efficiënt of zonder toxiciteit worden overexpressie zal uiteraard voortdurend worden gemist. Mitotically unstable elementen, zoals "mnemons," zou nooit doorgeven aan dochters na de initiële overexpressie22. Andere soorten langlevende bistabiele schakelaars kunnen daarentegen theoretisch worden geïnduceerd via voorbijgaande overexpressie42,43. Deze Staten zijn echter meestal niet afhankelijk proteïne homeostatische machines of overdraagbare via "zaadjes" eiwitten. Daarnaast prionen die afhankelijk zijn van andere chaperones (buiten Hsp70 en Hsp104) of extra takken van het eiwit homeostase netwerk voor vermeerdering zou het mislukken van het testen van de Chaperon-afhankelijkheid die hier worden beschreven. Tot slot, een lage overvloed eiwitten die ook vormen amyloid wellicht infectiviteit tarieven onder de limiet van detectie in de eiwit-transformatie-instellingen.
Dit protocol wordt een techniek beschreven voor inducerende stabiele epigenetische Staten op basis van eiwitten via eiwit overexpressie, evenals verder stroomafwaarts stappen om te controleren of elk epigenetische staat geïnduceerde een bona fide -prion is. In het voorbeeld gepresenteerd in deze paper, Psp1, is een voorbeeld van een eiwit dat wordt weergegeven een vooroordeel "prion-achtige" aminozuur en theoretisch kan worden hersteld met behulp van eerder ontwikkeld bioinformatic algoritmen. Echter, het onvermogen van Psp1 amyloid en haar ongewone chaperone afhankelijkheid (Hsp104) zou het snel uit verdere analyses hebben gediskwalificeerd en dus uitgeschakeld het prion overweging. Echter de screening technieken gepresenteerd in deze white paper zijn agnostisch aan deze veronderstellingen en in plaats daarvan richten op de onderliggende patronen van overname en de toereikendheid van eiwit alleen om over te brengen van de overeenkomstige fenotypen. Inderdaad, de overgrote meerderheid van op basis van eiwitten overname hersteld met deze methode was verstoken van N/Q-rijke reeks bias.
Deze methode werd gebruikt om de gehele gist ORFeome voor haar vermogen om te ontlokken van overname op basis van eiwitten op een onpartijdige wijze met behulp van slechts een klein aantal stressoren (25 mM cadmium chloride, 1 mM kobalt chloride, kopersulfaat 2 mM, 1 mM diamide, fluconazol van 0,2 mM, 50 mM hydroxyurea, 20 mM mangaan chloride, 0,75 mM paraquat, 50 mM radicicol, 80 J/m2 UV-bestraling sonde en 10 mM zinksulfaat). Deze benadering kan echter eenvoudig worden aangepast tot scherm genetische netwerken of specifieke cellulaire reacties op een meer gerichte manier. Voor bijvoorbeeld functioneel verwante proteïnen of alle eiwitten geregeld kon een discrete signalering netwerk worden geïnduceerde via voorbijgaande overexpressie en vertoond met stressoren verwant met hun biologische functie. Daarentegen kan een grotere set van eiwitten met een uitgebreidere set van stressoren om te onderzoeken of specifieke cellulaire reacties hebben natuurlijk geëvolueerd naar haven prion schakelaars worden gescreend. Tot slot, hoewel wij hebben gevoerd deze studies in gist, vele aspecten van de experimenten (bijvoorbeeld voorbijgaande eiwit expressie, chaperon "genezen", enz.) kan worden gegeneraliseerd naar andere modelsystemen in de toekomst. Bijvoorbeeld, zoogdieren weefselkweek is vatbaar voor overexpressie via plasmide-gebaseerde systemen, en fluorescentie foci zou ook worden gebruikt als een uitlezing voor erfelijke zelf-assemblage, als eerder28 beschreven. Bovendien, eiwit-codeert-sequenties van twee andere organismen kunnen worden uitgedrukt in gist en getest op hun vermogen om te ontlokken prion-achtige erfenis met behulp van de beschreven methoden hier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She en Susan Lindquist voor hun hulp bij de ontwikkeling van de tests die in dit document, evenals de revisoren gebruikt voor hun doordachte opmerkingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
- Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).
- Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
- Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
- Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
- Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
- Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
- Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
- Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
- Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
- Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
- Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
- Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
- Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
- Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
- Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
- Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
- Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
- Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
- Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
- Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766 (2016).
- Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).
- Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
- Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
- Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
- Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
- Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
- Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
- Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).
