Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatz-Methodik, funktionell für die Protein-basierten Vererbung in S. CerevisiaeBildschirm.
Abstract
Die Codierung von biologischen Informationen, der für künftige Generationen zugänglich ist wird in der Regel über Änderungen an der DNA-Sequenz erreicht. Langlebige Vererbung in Protein Konformation (anstatt Sequenz) codiert wurde lange als Paradigma-Verschiebung, aber selten gesehen. Am besten charakterisiert Beispiele solcher epigenetische Elemente sind Prionen, die selbstorganisierende Verhalten besitzen, die die vererbbare Manifestation des neuen Phänotypen fahren können. Viele archetypische Prionen zeigt eine auffallende N/Q-reichen Sequenz Voreingenommenheit und montieren in eine Amyloid Falten. Diese Besonderheiten haben darüber informiert, dass die meisten Screening-Bemühungen um neue Prionproteine zu identifizieren. Mindestens drei bekannten Prionen (einschließlich der Gründung Prions, PrPSc) jedoch nicht diese biochemischen Eigenschaften Hafen. Deshalb haben wir eine alternative Methode, um die Reichweite der Protein-basierten Vererbung anhand einer Eigenschaft der Masse Sonde entwickelt: die transiente Überexpression von Prionproteinen erhöht die Frequenz bei dem erwerben sie eine selbst-Template-Konformation. Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren zur Analyse der Fähigkeit der Hefe ORFeome, Protein-basierten Vererbung zu entlocken. Bei dieser Strategie wir zuvor gefunden, > 1 % Hefe Proteine könnte die Entstehung biologischer Merkmale, die langlebig, stabil, und häufiger als genetische Mutation entstanden Kraftstoff. Dieser Ansatz kann in hohem Durchsatz über gesamte ORFeomes oder als gezielte Screening Paradigma für spezifische genetische Netzwerke oder Reize aus der Umwelt eingesetzt werden. Ebenso wie vorwärts genetischer Bildschirme zahlreiche Entwicklungs- und Signalisierung Wege definieren, bieten diese Techniken eine Methode um den Einfluss von Protein-basierten Vererbung in biologischen Prozessen zu untersuchen.
Introduction
Biologische Systeme erleben häufig vorübergehende Schwankungen in Protein Hülle und Fülle. Es bleibt unklar, ob diese einen bleibenden Eindruck bei der Gestaltung des Phänotyps eines Organismus oder zukünftiger Generationen haben. Die bekanntesten Fälle von diesem Biologie beinhalten eine seltene Klasse von Proteinen, Prionen, die die Entstehung von vererbbaren Merkmale ohne Änderung des Genoms zu fahren. Stattdessen übermitteln diese proTeinaceous und inFectious Partikel Phänotypen über selbsterhaltend Änderungen an Protein Konformation1,2. Diese Art der Vererbung wurde als Ursache für die ungewöhnliche Erbschaft-Muster einer verheerenden Neurodegenerative Krankheit entdeckt. Studien in Organismen von Pilzen bis hin zu Säugetieren3,4,5,6,7,8,9,10 haben da ergab jedoch, dass Prion-Elementen Anpassungswert verleihen können. Dennoch wurden Prionen als einen faszinierenden, aber selten biologische Kuriosität angesehen.
Diese vorherrschende Meinung ist teilweise statt, weil die Charakterisierung von Protein-basierten Vererbung von einer kleinen Gruppe von Beispielen lange eingeschränkt wurde. Die jüngsten Bemühungen der systematischen Screening haben dieses Bild erheblich ausgeweitet, durch die Identifizierung mehrere neue Bona Fide Prionen11 und fast zwei Dutzend Protein Domänen12 mit einer Kapazität von Prion-wie Konformationsänderungen Brennstoffumstellung. Da jedoch diese Ansätze in der Regel auf starke Aminosäure-Sequenz Vorurteile konzentriert haben, Austauschen der Prionen, die entdeckt wurden die biochemischen Eigenschaften der Gründung Hefe Prionen [PSI+]13,14, [URE3]15und [RNQ+]11,16. Dazu gehören: (1) modulare Domains, sind reich an lange Polymeren erstreckt sich von Asparagin (N) und Glutamin (Q), (2) Montage in ein Amyloid [PRION+] Konformation17,18,19, und 3) vollständige Abhängigkeit von Disaggregase Hsp104-Funktion für die treuen Vermehrung von Mutter zu Tochter13,20,21. In der Tat viele Bona Fide Prionen, einschließlich [GAR+], [Het-s] und sogar das original Prion (PrP-Sc), würde unter solchen strengen Kriterien verfehlt werden. Vielleicht noch wichtiger ist, wäre sie nicht in der Lage, neuartige Mechanismen von Protein-basierten Vererbung22zu erfassen. So kann die wahre biologische breite solcher Phänomene weitaus häufiger in der Natur als bisher angenommen sein.
Um diese Frage zu untersuchen, wurde eine Hochdurchsatz-Proteom-weite Strategie eingesetzt. Ein Markenzeichen für alle Prionen, einschließlich PrPSc, [GAR+], und [Het-s], ist, dass die transiente Überexpression der kausalen Proteine stark erhöht die Rate der Prion Erwerb15,23,24,25,26. Wir nutzten diese Funktion, um systematisch Fragen, über die gesamte Hefe ORFeome, wenn stabile Protein-basierten, epigenetische Zustände durch Induktion vorübergehend die Überexpression von einzelnen Proteinen initiiert werden könnten. Es ist bekannt, dass das Protein-Überexpression Phänotypen27verändern kann. Prionproteine sind jedoch ungewöhnlich, weil ihre temporäre Überproduktion eine Änderung im Phänotyp produziert, die für viele Hunderte von Generationen nach der anfänglichen Überexpression vererbbar ist. Bisher haben wir dieses Feature sowie die ungewöhnliche Erbschaft-Muster von Protein-basierten genetischen Elementen, Dutzende von Proteinen dar, die in der Lage, haben Neuverkabelung phänotypische Landschaften ohne Veränderung der Genom-28sind. Obwohl einige identifiziert wurden Proteine vormals Prionen, die meisten waren nicht, unterstreicht die Kraft dieses Ansatzes um neue Formen der Protein-basierten Erbe zu entdecken.
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Discussion
Die erste Hefe Prionen wurden durch ihre ungewöhnliche Phänotypen und verwirrenden Muster der Vererbung identifiziert. Die Merkmale der diese Prionen wurden dann verwendet, um Algorithmen und Berechnungswerkzeuge zum Bildschirm für zusätzliche Prionproteine zu bauen. Die hier beschriebene Methode dagegen ist experimentell und stützt sich auf vorübergehende Überexpression erstelle ich eine dauerhafte Veränderung-eine stabile Zustand in Konformation Protein kodiert. Wenn die Effizienz der "Aussaat" Prion Montage durch Überexpression für jede gegebenes Protein sehr niedrig ist, wird das Protein jedoch kontinuierlich als eine falsche Negative in Überexpression Bildschirme dieser Art hervorgehen. Eine solche Änderung, dies zu korrigieren wäre ein 2-Mikron-Plasmid für Protein-Überexpression in Zukunft verwenden experimentiert. Schließlich jeder induzierte Prion hat seinen eigenen einzigartigen Satz von Wachstum Phänotypen und wird nicht sichtbar in jedem Zustand geprüft werden. So begrenzt die Anzahl der unterschiedlichen Bedingungen und Dosen getestet die Anzahl der Treffer.
Wichtig ist, werden mit dieser Methode nicht alle Arten von Protein-basierten Vererbung ebenso wiederhergestellt werden. Proteine, die können nicht effizient überexprimiert oder ohne Toxizität werden natürlich ständig vermisst. Mitotically instabile Elemente, z. B. "Mnemons," würde nie an Töchter nach der anfänglichen Überexpression22weitergegeben. Im Gegensatz dazu können andere Arten von langlebigen bistabiler Schalter theoretisch über vorübergehende Überexpression42,43induziert werden. Diese Staaten sind jedoch in der Regel nicht abhängig von Protein homöostatischen Maschinen oder übertragbaren über "entkernt" Proteine. Darüber hinaus würde Prionen, die auf andere Chaperone (außerhalb von Hsp70 und Hsp104) oder zusätzliche Waffen des Proteins Homöostase Netzwerks für die Vermehrung der hier beschriebenen Chaperon-Abhängigkeit-Assays fehlschlagen. Schließlich, möglicherweise einen geringen Fülle-Proteine, die auch Amyloid bilden Infektiosität Preise unterhalb der Nachweisgrenze im Protein-Transformation-Setup.
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik für Induktion stabile Protein-basierten epigenetische Zustände über Protein-Überexpression sowie weitere nachgelagerte Schritte zu prüfen, ob jede epigenetische Zustand induziert eine Bona Fide Prion ist. In diesem Papier, Psp1, vorgestellte Beispiel ist ein Beispiel für ein Protein, das zeigt einen "Prion-Like" Aminosäure-Bias und könnte theoretisch unter Verwendung der zuvor zurückgewonnen bioinformatische Algorithmen entwickelt. Aber die Unfähigkeit der Psp1 Amyloid und seine ungewöhnliche Chaperon-Abhängigkeit (Hsp104) bilden würde haben es schnell vom weiteren Analysen ausgeschlossen und somit eliminiert es Prion berücksichtigt. Jedoch in diesem Dokument vorgestellten Screening-Verfahren sind agnostisch gegenüber diesen Annahmen und konzentriert sich auf die zugrunde liegenden Muster der Vererbung und die ausreichende Protein allein um die entsprechenden Phänotypen zu übertragen. In der Tat war die überwiegende Mehrheit der Protein-basierten Vererbung erholte sich mit dieser Methode ohne N/Q-reichen Sequenz Voreingenommenheit.
Diese Methode wurde verwendet, um die gesamte Hefe ORFeome für seine Kapazität auf Proteinbasis Vererbung auf unvoreingenommene Weise mit nur einer geringen Anzahl von Stressoren (25 mM Cadmium Chlorid, 1 mM-Kobalt-Chlorid, Kupfersulfat 2 mM, 1 mM Diamide, 0,2 mM Fluconazol, 50 mM Hydroxyharnstoff, 20 mM-Mangan-Chlorid, 0,75 mM Paraquat, 50 mM Radicicol, 80 J/m2 UV-Bestrahlung zu entlocken Sonde und 10 mM Zinksulfat). Jedoch konnte dieser Ansatz leicht Bildschirm genetische Netzwerke oder spezifische zelluläre Reaktionen in gezielter geändert werden. Für Beispiel, funktionell verwandte Proteine oder Proteine geregelt könnte eine diskrete Signalisierung Netzwerk über vorübergehende Überexpression induziert und abgeschirmt mit Stressoren bezogen auf ihre biologische Funktion. Im Gegensatz dazu könnte eine größere Anzahl von Proteinen untersucht werden, mit einem umfassenden Satz von Stressoren zu untersuchen, ob spezifische zelluläre Reaktionen natürlich gewachsenen Prion Schalter hegen. Schließlich, obwohl wir diese Studien in Hefe, viele Aspekte der Experimente (z. B. vorübergehende Proteinexpression, Chaperon "heilen", etc.) könnte in der Zukunft zu Fremdsystemen Modell verallgemeinert werden. Z. B. Säugetier-Zellkultur ist zugänglich Überexpression über Plasmid-basierte Systeme, und Fluoreszenz Brennpunkte könnte auch als eine Anzeige verwendet werden, für erbliche Selbstmontage, wie zuvor28 beschrieben. Darüber hinaus könnte Protein-kodierenden Sequenzen aus anderen Organismen ausgedrückt in Hefe und getestet für ihre Fähigkeit, Prion-wie Vererbung mit den beschriebenen Methoden hier zu entlocken.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She und Susan Lindquist für ihre Unterstützung bei der Entwicklung der Assays in diesem Papier sowie die Gutachter für ihre nachdenklichen Kommentaren verwendet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
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