Summary
Este protocolo describe una metodología de alto rendimiento para funcionalmente basados en proteína herencia en S. cerevisiae.
Abstract
La codificación de la información biológica que es accesible a las generaciones futuras se obtiene generalmente mediante cambios en la secuencia de ADN. Herencia longeva codificada en proteínas conformación (en lugar de secuencia) durante mucho tiempo ha sido visto como cambio de paradigma pero rara. Los mejores ejemplos de tales elementos epigenéticos caracterizados son los priones, que poseen un comportamiento uno mismo-montaje que puede conducir la manifestación hereditaria de fenotipos nuevos. Muchos priones arquetípicos mostrar un sesgo de secuencia impactante de N/Q-rico y montan en un doblez amiloideo. Estas características inusuales han informado de más esfuerzos de investigación para identificar nuevas proteínas del prión. Sin embargo, por lo menos tres priones conocidos (incluyendo el fundador del prión, PrPSc) no albergan estas características bioquímicas. Por lo tanto, desarrollamos un método alternativo para probar el alcance de la herencia basados en proteínas, basada en una propiedad de la acción de masas: la sobreexpresión transitoria de las proteínas del prión aumenta la frecuencia en que adquieren una conformación de plantillas de uno mismo. Este artículo describe un método para el análisis de la capacidad de la levadura ORFeome para obtener la herencia basados en proteínas. Usando esta estrategia, hemos encontrado que > 1% de proteínas de levadura podrían impulsar la aparición de rasgos biológicos que duradero, estable y se presentó con mayor frecuencia que la mutación genética. Este enfoque puede ser empleado en alto rendimiento en todo ORFeomes o como un paradigma de proyección específica para redes genéticas específicas o estímulos ambientales. Como pantallas genéticas adelantados definen numerosas vías de señalización y de desarrollo, estas técnicas proporcionan una metodología para investigar la influencia de la herencia basados en proteína en procesos biológicos.
Introduction
Sistemas biológicos con frecuencia experimentan fluctuaciones transitorias en abundancia de la proteína. No está claro si éstos tienen un impacto duradero en la formación del fenotipo de un organismo o de las generaciones futuras. Los casos más conocidos de esta biología implican una clase rara de las proteínas, los priones, que conducen a la aparición de rasgos hereditarios sin modificación del genoma. En cambio, estos proteinaceous y enfectious las partículas transmiten fenotipos mediante cambios perpetúa a sí mismo a la conformación de la proteína1,2. Este tipo de herencia fue descubierto como la causa de los patrones de herencia inusual de una enfermedad neurodegenerativa devastadora. Sin embargo, estudios en organismos que van desde hongos hasta mamíferos3,4,5,6,7,8,9,10 han revelado desde entonces que elementos como prión pueden conferir valor adaptativo. Sin embargo, los priones han sido vistos como una fascinante pero rara rareza biológica.
Esta sabiduría que prevalece en parte se lleva a cabo porque la caracterización de la herencia basados en proteínas durante mucho tiempo ha sido restringida por un pequeño conjunto de ejemplos. Los esfuerzos recientes de cribado sistemático han ampliado esta imagen significativamente mediante la identificación de varios nuevos priones de bona fide 11 y casi dos docenas de proteína dominios12 con capacidad de conversión conformacional de combustible-como prión. Sin embargo, debido a estos enfoques se han centrado generalmente en sesgos de secuencia del aminoácido fuerte, los priones que se han descubierto compartan las propiedades bioquímicas de la Fundación levadura prions [PSI+]13,14[URE3]15y [RNQ+]11,16. Estos incluyen: 1) modulares dominios que son ricos en tramos largos polímeros de asparagina (N) y glutamina (Q), 2) el conjunto en un amiloide [prión+] conformación17,18,19y 3) completan dependencia disaggregase Hsp104 función de propagación fiel de madre a hija13,20,21. De hecho, muchos bona fide priones, incluyendo [GAR+], [Het-s] y aun el original del prión (PrPSc), sería faltado bajo criterios estrictos. Tal vez lo más importante, serían incapaces de capturar nuevos mecanismos de herencia basados en proteína22. Así, la verdadera amplitud biológica de tales fenómenos puede ser mucho más común en la naturaleza que se suponía.
Para investigar esta cuestión, se empleó una estrategia de alto rendimiento de todo el proteoma. Una característica de los priones, incluyendo PrPSc, [GAR+], y [Het-s], es que la sobreexpresión transitoria de las proteínas causales aumenta fuertemente la tasa de prión adquisición15,23,24,25,26. Hemos aprovechado esta característica para pedir sistemáticamente, a través de toda la levadura ORFeome, si Estados estables basados en proteína, epigenéticos podrían ser iniciados por transitoriamente induce la sobreexpresión de proteínas individuales. Es bien sabido que sobreexpresión de proteína puede alterar los fenotipos27. Sin embargo, las proteínas del prión son inusuales porque su superproducción temporal produce un cambio en el fenotipo que es heredable por cientos de generaciones después de la sobreexpresión de inicial. Previamente hemos tomado ventaja de esta característica, así como los patrones de herencia inusual de elementos genéticos basados en proteínas, para identificar docenas de proteínas que son capaces de heritably re-wiring fenotípicas paisajes sin alterar el genoma28. Aunque algunos identifican proteínas fueron conocido como los priones, la mayoría eran no, lo que subraya la potencia de este enfoque para descubrir nuevas formas de herencia basados en proteína.
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Discussion
Los priones de levadura primeros fueron identificados por sus fenotipos inusuales y desconcertantes patrones de herencia. Las características de estos priones fueron utilizadas para construir algoritmos y herramientas computacionales para detectar proteínas priónicas adicional. El método descrito aquí, en cambio, es experimental y depende de la sobreexpresión transitoria para crear un duradero un cambio estable estado codificado en la conformación de proteínas. Sin embargo, si la eficiencia de "siembra" Asamblea del prión por sobreexpresión de cualquier proteína dada es muy baja, esa proteína continuamente surgirá como un falso negativo en las pantallas de la sobreexpresión de este tipo. Una modificación para corregir esto sería utilizar un plásmido 2 micras para la sobreexpresión de la proteína en el futuro los experimentos. Finalmente, cada prión inducida tiene su propio conjunto de fenotipos de crecimiento y que no aparente en cada condición de ensayarse. Así, el número de diferentes condiciones y dosis probadas limita el número de golpes.
Lo importante, no todos los tipos de herencia basados en proteínas serán igualmente recuperados usando este método. Proteínas que no se sobre expresa eficientemente o sin toxicidad obviamente siempre extrañaremos. Elementos mitotically inestables, como "mnemons," nunca se propagan a hijas siguiendo la sobreexpresión inicial22. En cambio, otros tipos de interruptores biestables duradero teóricamente podían ser inducidos mediante sobre-expresión transitoria42,43. Sin embargo, estos Estados suelen ser no dependiente de maquinaria homeostática de la proteína o transmisibles a través de las proteínas "sembrado". Además, los priones que dependen otros acompañantes (fuera de Hsp70 y Hsp104) o más armas de la red de homeostasis de proteínas para la propagación no los ensayos de acompañante-dependencia descritos aquí. Finalmente, una proteínas de baja abundancia que también forman amiloide podrían tener tasas por debajo del límite de detección de infectividad en la configuración de la transformación de la proteína.
Este protocolo describe una técnica para inducir estados epigenéticos proteínicos estables mediante la sobreexpresión de la proteína, así como más abajo pasos para validar si cada uno inducido estado epigenético es un prión de bona fide . El ejemplo presentado en este documento, Psp1, es un ejemplo de una proteína que muestra un sesgo "prion-como" aminoácidos y teóricamente podría recuperarse mediante previamente desarrollado algoritmos bioinformáticos. Sin embargo, la incapacidad de Psp1 para formar amiloide y su dependencia de acompañante inusual (Hsp104) rápidamente hubiera descalificado de mayores análisis y así eliminó de consideración del prión. Sin embargo, las técnicas de investigación presentadas en este documento son agnósticas a estos supuestos y centran en cambio en los patrones subyacentes de la herencia y la suficiencia de proteínas solamente para transmitir los fenotipos correspondientes. De hecho, la gran mayoría de la herencia basada en la proteína recuperada con este método estuvo carente de sesgo de secuencia N/Q-rico.
Este método fue utilizado para probar la levadura toda ORFeome por su capacidad obtener la herencia basados en proteína de forma imparcial usando sólo un pequeño número de factores estresantes (cloruro de cadmio de 25 mM, cloruro de cobalto de 1 mM, sulfato de cobre de 2 mM, diamida de 1 mM, fluconazol 0,2 mM, hidroxiurea 50 mM, 20 mM cloruro de manganeso, paraquat 0, 75 mM, 50 mM radicicol, 80 J/m2 irradiación UV y 10 mM de sulfato de cinc). Sin embargo, este enfoque podría ser modificado fácilmente a redes genéticas de la pantalla o las respuestas celulares específicas de manera más específica. Por ejemplo, proteínas funcionalmente relacionadas o las proteínas regulación en una red de señalización discreta podría inducida mediante sobre-expresión transitoria y defendida con factores de estrés relacionados con su función biológica. En cambio, un conjunto más amplio de proteínas podría ser defendido con un conjunto más amplio de factores estresantes para investigar si las respuestas celulares específicas han evolucionado naturalmente para abrigar los interruptores del prión. Por último, aunque hemos realizado estos estudios en levadura, muchos aspectos de los experimentos (por ejemplo, la expresión de proteína transitoria, acompañante "curado", etc.) podría ser generalizado a otros sistemas modelo en el futuro. Por ejemplo, cultivo de tejidos de mamífero es favorable a la sobreexpresión por sistemas basados en el plásmido, y focos de fluorescencia puede utilizarse también como una lectura para hereditario uno mismo-Asamblea, como se ha descrito anteriormente28. Además, secuencias de codificación de proteínas de otros organismos podrían expresadas en levadura y probadas por su capacidad para provocar-como prión herencia utilizando los métodos descritos aquí.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She y Susan Lindquist por su asistencia en el desarrollo de los ensayos utilizados en este documento, así como los revisores por sus comentarios reflexivos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
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