Summary
Dit artikel beschrijft een proces voor het afstemmen van de grootte en crosslinking dichtheid van covalent kruisverwijzende nanodeeltjes van lineaire polyesters met hanger functionaliteit. Door afstemming synthese parameters (polymeer moleculair gewicht, hanger functionaliteit opneming en simulaties van de crosslinker), worden een nanoparticle van de gewenste grootte en crosslinking dichtheid bereikt voor drug delivery toepassingen.
Abstract
Beschrijven we een protocol voor de synthese van lineaire polyesters met hanger epoxide functionaliteit en hun integratie in een nanosponge met gecontroleerde afmetingen. Deze benadering begint met de synthese van een functionalized lacton die is de sleutel tot het functionalization van de tegenhanger van het resulterende polymeer. Valerolactone (VL) en allyl-valerolactone (AVL) zijn vervolgens copolymerized met ring-opening polymerisatie. Na polymerisatie wijziging wordt vervolgens gebruikt om te installeren een epoxide-groep op sommige of alle van de hanger allyl-groepen. Epoxy-amine chemie is werkzaam aan formulier nanodeeltjes in een verdunde oplossing van polymeer zowel klein molecuul diamine crosslinker op basis van de gewenste nanosponge grootte en crosslinking dichtheid. Nanosponge maten kunnen worden gekarakteriseerd door Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) imaging om de dimensie en de distributie te bepalen. Deze methode biedt een weg die zeer afstembare polyesters afstembare nanodeeltjes, die kan worden gebruikt voor de inkapseling van de drug van de kleine molecuul kunnen maken. Deze deeltjes zijn vanwege de aard van de ruggengraat, hydrolytisch en enzymatisch afbreekbaar voor een gecontroleerde afgifte van een breed scala van hydrofobe kleine moleculen.
Introduction
Juist het afstemmen van de grootte en crosslinking dichtheid van nanodeeltjes gebaseerd op intermoleculaire crosslinking is van groot belang te beïnvloeden en gids van de drug release-Profiel van deze nanosystems1. Ontwerpen nanosponge tunability, dat wil zeggen, voorbereiding van deeltjes van verschillende netwerk dichtheden, is afhankelijk van de functionaliteit van de tegenhanger van het polymeer voorloper en de equivalenten van de hydrofiele crosslinker opgenomen. In deze benadering is de concentratie van de voorloper en crosslinker in het oplosmiddel belangrijk om formulier nanodeeltjes van een discrete formaat in plaats van een bulk-gel. Met behulp van spectroscopie van kwantitatieve nucleaire magnetische resonantie (NMR) als een karakterisering techniek zorgt voor de precieze bepaling van opgenomen hanger functionaliteit en polymeer molecuulgewicht. Zodra nanoparticles zijn gevormd, kunnen worden geconcentreerd en ontbindend in organics zonder het karakter van een nanogel.
Recente werkzaamheden in nanoparticle drug levering heeft gericht op het gebruik van poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) zelf geassembleerd nanodeeltjes2,3,4,5,6. PLGA heeft afbreekbaar ester verbanden waardoor het geschikt voor drug delivery toepassingen en wordt vaak gecombineerd met poly(ethylene glycol) (PEG) als gevolg van zijn onzichtbare eigenschappen7. Echter, vanwege de zelf samengestelde aard van PLGA deeltjesvorming, de deeltjes kunnen niet worden solubilized in organische verbindingen voor verdere functionalization. In tegenstelling tot PLGA nanodeeltjes biedt de voorgestelde methode covalente crosslinking vormen een nanoparticle met de gedefinieerde grootte en morfologie, die stabiel in organische verbindingen en degraderen in waterige oplossingen1. Voordelen van deze aanpak zijn de mogelijkheid om verder chemisch functionalize het oppervlak van de nanosponge8, en de stabiliteit in organische oplosmiddelen kan worden gebruikt voor de post laden van de deeltjes met farmaceutische stoffen1,9. Met deze methode kan de inkapseling van hydrofobe kleine moleculen door neerslag in waterige media worden bereikt. De hydrophobicity van de polyester ruggengraat samen met de hydrofiele korte crosslinker geeft deze deeltjes een amorfe karakter op lichaamstemperatuur. Bovendien kan het deeltje na drug laden, fijne schorsingen vormen in waterige media als direct ingespoten in vivo. Het is ons doel bij deze werkzaamheden te evalueren van de parameters voor de synthese van deze polyester nanosponges en die zijn van vitaal belang voor het ontwerp en de controle van de grootte en morfologie bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te beoordelen van de relatie tussen de parameters van de synthese van de nanosponge en de resulterende grootte, is de concentratie en hanger functionaliteit van elke polymeer voorloper belangrijk. In Figuur 1, wordt een regeling van de successfulsynthetic van de nanosponges uitgevoerd onder de voorwaarden van de Terugvloeiing na de integratie van beide voorloper polymeer en diamine crosslinker in DCM voor 12u. De concentratie van epoxiden in de oplossing is ook kritisch tot de vorming van de afzonderlijke deeltjes. Zodra nanosponges werden gesynthetiseerd, was TEM imaging gebruikt om te bepalen van de precieze afmetingen van een verzameling van deeltjes. In Figuur 2, werd een verzameling van verschillende nanosponge experimenten geanalyseerd op basis van hun polymeer voorloper molecuulgewicht en hanger functionaliteit opname om te bepalen als een relatie tussen de twee een effect op de grootte van de nanosponge hebben kan. In Figuur 2, wordt een trend van toenemende deeltjesgrootte gezien als moleculair gewicht wordt verhoogd voor zowel een 6% en 8% EVL integratie met één diamine crosslinker per epoxide (2 aminen per epoxide).
Figuur 3 toont dat verhoging van zowel de crosslinker de epoxide percentage equivalenten een vergelijkbaar effect hebben zou met behoud van een soortgelijke molecuulgewicht tussen nanosponge sets. Nogmaals, een trend in het vergroten van de nanosponge tijdens het wijzigen van deze parameters wordt gezien. Het is belangrijk om te begrijpen hoe de synthese van polymere precursors een vitale rol kan spelen in de grootte van de resulterende nanoparticle precies afstellen nanosponges voor diverse toepassingen. Het is ook belangrijk om een reproduceerbare en betrouwbare methode voor nanosponge synthese die kleine afwijkingen tussen de grootte van de afzonderlijke deeltjes, heeft zoals blijkt uit Figuur 4. Door gebruik te maken van deze parameters, een scala aan maten en een formule voor het betrouwbaar weergeven van een nanosponge van een bepaalde grootte kan worden ontwikkeld voor een bepaalde toepassing of gewenste doel, waaruit dit als een veelzijdige en praktische nanosponge-chemie.
Figuur 1: reactie regeling voor de synthese van Nanosponge. Een lineaire polyester copolymeer met hanger allyl en epoxide functionele groepen is gereageerd met een diamine crosslinker vormen discrete nanodeeltjes met instelbare afmetingen van ongeveer 100 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: analyse van Nanosponge Tunability op basis van het molecuulgewicht en hanger functionaliteit. Door de verandering in de grootte van de nanosponge op basis van het molecuulgewicht van het polymeer voorloper terwijl de relatieve hanger-functionaliteit te evalueren hetzelfde, een toename van de grootte van de deeltjes als de verhogingen van de moleculair gewicht kan worden aangetoond voor zowel 6% en 8% EVL polymeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: analyse van Nanosponge Tunability door Crosslinker en hanger functionaliteit strijdkrachten. Door het ingedrukt houden van de crosslinker gelijkwaardig stabiel, een hogere hanger functionaliteit zal resulteren in hogere crosslinker integratie. In deze afbeelding zijn vier aminen per epoxide (twee diamine crosslinker equivalenten per epoxide) toegevoegd aan zowel een 6% en 10% EVL polymeer. Als meer crosslinker in de nanosponge als gevolg van meer epoxiden per polymeer en hogere crosslinker equivalenten is opgenomen, wordt de omvang toeneemt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: TEM beeld van Nanosponges. Een TEM beeld van covalent gekoppelde nanodeeltjes gevormd tijdens de synthese. Aangegeven grootte van 79 ± 12 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verkrijgen van reproduceerbaar nanosponge maten is essentieel in drug levering toepassingen. Meerdere parameters in de polymerisatie en nanosponge synthese van invloed op de grootte en de dwarslijn dichtheid van de resulterende deeltje. Drie belangrijke parameters werden vastgesteld in onze analyse: polymeer moleculair gewicht, epoxide hanger functionaliteit en simulaties van de crosslinker. Om te produceren een reeks molecuulgewichten en epoxide functionaliteiten voor nanosponge synthese, moet de stoichiometrie van de VL -co -AVL copolymeer worden gewijzigd. De concentratie van de functiegroep allyl tijdens epoxidatie van het copolymeer kan worden gebruikt om te epoxidize, ofwel een gewenste percentage van allyls of alle van hen. Als een overmaat van oxiderende agent wordt gebruikt, kan de afbraak van het polymeer keten optreden; echter, dit kan worden verholpen door het verminderen van de hoeveelheid oxidator. Wanneer alle allyls geëpoxideerd zijn, zijn er geen hanger met allyls op het oppervlak van de nanosponge voor verdere functionalization. Het is ook belangrijk voor de synthese van de nanosponge die de concentratie van epoxide in oplossing nanosponge synthese 0.0054 M is.
De reactie van de nanosponge is eerder geëvalueerd om te bepalen van een optimale concentratie voor gewenste nanosponge grootte bereiken13. Deze concentratie is berekend op basis van de herhaalde eenheidswaarde voor het epoxide-functionaliteit in het polymeer. De herhaling eenheid is het gewicht van polymeer per een reactieve eenheid, die wordt gebruikt voor het berekenen van de mollen voor reactieve units in één polymeer. Bijvoorbeeld, zoals hieronder is als een polymeer met een molecuulgewicht van 2.000 g/mol 10 reactieve bevat monomeereenheden (RMU) hanger functionaliteit, bepaald door de kwantitatieve NMR, rekening houdend met de reactieve eenheid van het polymeer 200 g/mol RMU. Met behulp van deze waarde, kunnen de mollen van reactieve eenheden worden berekend uit het gewicht polymeer om te bepalen crosslinker strijdkrachten voor nanosponge synthese.
Als een algemene trend, verhoging van zowel de polymeer moleculair gewicht en epoxide functionaliteit bijgedragen tot een verhoogde nanosponge formaat onafhankelijk. Een smalle polydispersiteit behaalt de grootteverdeling van een smalle nanosponge (~ standaarddeviatie van 10%) en verbetert de reproduceerbaarheid van nanosponge synthese.
De voorgestelde aanpak behaalt een smalle polymeer dispersiteit door gebruik van een tin triflaat katalysator14. Het crosslinking strijdkrachten zijn berekend op basis van de amine per epoxide-equivalenten, en een toename van de crosslinker-equivalenten is getoond om de grootte van de nanosponge te verhogen. Het is echter belangrijk als gevolg van het doel van de consumptie van alle beschikbare epoxiden met behulp van een overmaat van crosslinker. Resterende amine functionaliteit op het oppervlak van de nanosponge kan worden gebruikt voor verdere functionalization van het oppervlak van het deeltje.
Vergeleken met conventionele methoden voor de voorbereiding van de nanoparticle, zijn de voordelen in deze benadering de meerdere parameters door welke precieze grootte en bevolkingsdichtheid controle kan worden bereikt, de mogelijkheid om verdere functionalize van het oppervlak van de nanosponge, en de oplosbaarheid in de organische stoffen voor de inkapseling van de hydrofobe drug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
LK is dankbaar voor de financiering van de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (DGE-1445197) en de Vanderbilt Universiteit scheikunde departement. LK en EH bedank de financiering voor het Osiris TEM instrument (NSF EPS-1004083).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-(Ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506-100ML | |
| 3-methyl-1-butanol | Sigma-Aldrich | 309435-100ML | anhydrous, ≥99% |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124-4L | |
| Allyl bromide | Sigma-Aldrich | A29585-5G | ≥99% |
| Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | saturated solution in DI water |
| Cell culture water | Sigma-Aldrich | W3500-500ML | Filtered through 0.45 μm syringe filter |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-100ML | anhydrous, ≥99%, contains 40 - 150 ppm amylene as stabilizer |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145SK-4 | |
| EZFlow 0.2 μm Syringe Filter | Foxx Life Sciences | 386-2116-OEM | Hydrophillic PTFE, 13 mm |
| EZFlow 0.45 μm Syringe Filter | Foxx Life Sciences | 386-3126-OEM | Hydrophillic PTFE, 25 mm |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Test Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-31 | |
| Fisherbrand Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-666-318 | 1.5 mL |
| Hamilton Microliter Syringe, 100 μL | Hamilton Company | 80600 | Model 710 N SYR, Cemented NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Hexamethylphosphoramide | Sigma-Aldrich | H11602-100G | ≥99%, contains ≤1,000 ppm propylene oxide as stabilizer |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | |
| Magnesium sulfate anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Meta-chloroperoxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031-100G | Purified to ≥99% by buffer wash |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | anhydrous, ≥99% |
| N-butyllithium solution | Sigma-Aldrich | 230707-100ML | 2.5 M in hexanes |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma-Aldrich | 550043-500ML | ≥99% |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| PELCO Pro Reverse (Self-Closing) Tweezers | Ted Pella, Inc. | 5375-NM | |
| Phosphotungstic acid hydrate | Alfa Aesar | 40116 | |
| Q55 Sonicator | Qsonica | Q55-110 | 55 Watts, 20 kHz |
| SiliaMetS Cysteine | Silicycle | R80530B-10g | |
| SnakeSkin Dialysis Clips | Thermo Scientific | 68011 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | 5233-500 | saturated solution in DI water |
| TEM grid | Ted Pella, Inc. | 01822-F | Ultrathin Carbon Type-A, 400 mesh, Copper, approx. grid hole size: 42 µm |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Anhydrous, ≥99.9%, inhibitor-free |
| Tin(II) trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 388122-1G | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Whatman Filter Paper, Grade 1 | Fisher Scientific | 09-805H | Circles, 185 mm |
| δ-valerolactone | Sigma-Aldrich | 389579-100ML | Purified by vacuum distillation |
References
- van der Ende, A. E., Sathiyakumar, V., Diaz, R., Hallahan, D. E., Harth, E. Linear release nanoparticle devices for advanced targeted cancer therapies with increased efficacy. Polym Chem. 1 (1), 93 (2010).
- Sharma, S., Parmar, A., Kori, S., Sandhir, R. PLGA-based nanoparticles: A new paradigm in biomedical applications. Trends Anal Chem. 80, 30-40 (2016).
- Cao, L. B., Zeng, S., Zhao, W. Highly Stable PEGylated Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) Nanoparticles for the Effective Delivery of Docetaxel in Prostate Cancers. Nanoscale Res Lett. 11 (1), 305 (2016).
- Chelopo, M. P., Kalombo, L., Wesley-Smith, J., Grobler, A., Hayeshi, R. The fabrication and characterization of a PLGA nanoparticle-Pheroid® combined drug delivery system. J Mater Sci. 52 (6), 3133-3145 (2016).
- Guan, Q., et al. Preparation, in vitro and in vivo evaluation of mPEG-PLGA nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol. J Mater Sci Mater Med. 27 (2), 24 (2016).
- Cannava, C., et al. Nanospheres based on PLGA/amphiphilic cyclodextrin assemblies as potential enhancers of Methylene Blue neuroprotective effect. RSC Adv. 6, 16720-16729 (2016).
- Locatelli, E., Franchini, M. C. Biodegradable PLGA-b-PEG polymeric nanoparticles: synthesis, properties, and nanomedical applications as drug delivery system. J Nanopart Res. 14 (12), (2012).
- van der Ende, A. E., Croce, T., Hamilton, S., Sathiyakumar, V., Harth, E. M. Tailored polyester nanoparticles: post-modification with dendritic transporter and targeting units via reductive amination and thiol-ene chemistry. Soft Matter. 5 (7), 1417 (2009).
- Lockhart, J. N., Stevens, D. M., Beezer, D. B., Kravitz, A., Harth, E. M. Dual drug delivery of tamoxifen and quercetin: Regulated metabolism for anticancer treatment with nanosponges. J Control Release. 220 (Pt. B), 751-757 (2015).
- Shriner, R. L., Hermann, C. K. F., Morrill, T. C., Curtin, D. Y., Fuson, R. C. The Systematic Identification of Organic Compounds. , 8th ed, Wiley. (2004).
- Derome, A. E. Modern NMR Techniques for Chemistry Research. , Pergamon Press. (1987).
- Williams, D. B., Barry Carter, C. Transmission Electron Microscopy: A Textbook for Materials Science. , 2nd ed, Springer. (2009).
- van der Ende, A. E., Kravitz, E. J., Harth, E. M. Approach to Formation of Multifunctional Polyester Particles in Controlled Nanoscopic Dimensions. J Am Chem. Soc. 130 (27), 8706-8713 (2008).
- Stevens, D. M., Watson, H. A., LeBlanc, M. A., Wang, R. Y., Chou, J., Bauer, W. S., Harth, E. M. Practical polymerization of functionalized lactones and carbonates with Sn(OTf)2 in metal catalysed ring- opening polymerization methods. Polym Chem. 4, 2470-2474 (2013).
