Bemærk: Minimum input for denne protokol er 10.000 celler pr. enkelt immuno-nedbør (IP) reaktion. Udskrive den medfølgende eksperimentelle regneark og udnytte som en retningslinje til at planlægge ud i eksperimentet. Inkubationer ved stuetemperatur antages for at være på ~ 22 ° C. Alle buffer opskrifter er fastsat i tabel 1. Alle bufferne skal opbevares ved 4 ° C og opbevares på is under proceduren, medmindre andet er angivet. 1. celle forberedelse Dyrkede celler Cellerne vaskes med 1 mL af fosfat buffer saltvand (PBS) og præcist bestemme celle koncentrationen ved hjælp af en hemocytometer. Hvis der er mere end en million celler, øge omfanget af PBS. Baseret på celletal, alikvot en svarer til 70.000-100.000 celler ind i en sterile 1,5 mL tube, og spin-ned på 500 x g for 6 min. ved 4 ° C. Ved hjælp af en pipette, langsomt fjerne og supernatanten (uden at forstyrre den celle pellet) og resuspenderes i iskold lysisbuffer + 1 x protease hæmmer cocktail (PIC) til en koncentration af 1000 celler / µL. Bland godt af pipettering op og ned ad 20-30 gange. Det er afgørende, at celle klumper er forstyrret. Prøv ikke at skabe bobler. Fortsætte direkte til dag 1 (afsnit 2) i protokollen om ndChIP-seq eller flash fryse celle pellet i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C. Sorterede celler Indsamle 70.000-100.000 sorteret16 celler ind i en 1,5 mL rør med 350 µL af Hank’s salt bufferopløsning (HBSS), eller PBS + 2% føtal bovint serum (FBS). Spin ned hver celle alikvot på 500 x g for 6 min. ved 4 ° C. Ved hjælp af en pipette, langsomt Fjern supernatanten (uden at forstyrre den celle pellet) og resuspend i iskold lysisbuffer + 1 x PIC til en endelig koncentration på 1000 celler / µL. Bland godt i lysisbuffer af pipettering op og ned 20 – 30 gange. Sikre, at cellen klumper er forstyrret. Prøv ikke at skabe bobler. Fortsætte direkte til dag 1 (afsnit 2) i protokollen om ndChIP-FF., eller flash fryse celle pellet i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C. 2. dag 1: ndChIP-seq Forberedelse af antistof-perle kompleks Forberede et 37 ° C vandbad og en isspand. Arbejder på is, forberede 1 x IP buffer/1 x PIC og 1 x antistof (Ab) fortynding buffer, og holde dem på is. Hente Protein A (eller G) magnetiske perler (Se diskussion for udvælgelseskriterier) fra 4 ° C opbevaring og mix meget godt af blid pulse-vortexing. Hold det på køl.Bemærk: Pulse-vortexing betyder, at vortexing er stoppet hver gang en fuld vortex dannes i røret. Overføre 24 µL af Protein A (eller G) magnetiske perler per IP reaktion ind i et nyt 2 mL rør. Registrere omfanget af perler og holde røret på is. For eksempel, for 7 IPs, bruge 24 µL x 7 = 168 µL. Røret anbringes på tube magnet og vente på opklaring at blive klar angivelse perle adskillelse. Uden at forstyrre perlerne, omhyggeligt Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette og kassér. Tage tube off tube magnet og placere den på is. Tilføje en tilsvarende mængde (dvs., første bind af perler) iskold IP buffer + 1 x PIC mix. Mix af pipettering op og ned. Gør ikke vortex. Placere den IP buffer + 1 x PIC + perler tilbage på tube magnet og vente på opklaring at blive klar angivelse perle adskillelse. Uden at forstyrre perlerne, omhyggeligt Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette og kassér. Gentag kolde IP buffer + 1 X PIC vask, to gange mere for i alt 3 vasker. Efter den sidste vask, resuspend perler i en tilsvarende mængde (dvs., første bind af perler) iskold IP buffer + 1 x PIC mix. Mix af pipettering op og ned. Gør ikke vortex. Hold røret på is. På is, hæld 10 mL af IP buffer + PIC i en 25 mL V-formet reservoir. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 130 µL af iskold IP buffer + 1 x PIC mix i individuelle brønde på en ren V-bund 96-brønd plade. Udfylde et godt pr. IP. Mærke pladen som “Ab-perle complex”. Tilføj 12 µL af den vasket Protein A (eller G) magnetiske perler i hver godt indeholder IP buffer + PIC, og mix af pipettering op og ned. Holde de resterende vasket perler på is. Få validerede antistoffer fra deres kølelager og tø på is, hvis det kræves. Arbejder på is, fortyndes antistoffer med 1 x Ab fortynding buffer til de koncentrationer, der er vist i tabel 2. Hver brønd af Ab-perle komplekse plade, tilføje 1 µL af de relevante, fortyndede antistof (tabel 1). Optage godt til nøglen antistof. Ved hjælp af multikanalpipette mix hver række af pipettering op og ned ad 20 gange. Ændre tips mellem rækkerne. Forsegle Ab-perle komplekse pladen meget godt med en aluminium plade cover og inkuberes ved 4 ° C på en roterende platform i mindst 2 timer.Bemærk: Denne inkubation kan fortsætte indtil klar til at starte trin 2.4. Celle lysis og kromatin fordøjelsen Arbejder på is, forberede 1 x lysisbuffer + 1 x PIC og 1 mL af MNase jeg fortynding buffer (tabel 3) og holde dem på is. Hente cell pellets,-80 ° C opbevaring (eller fra is, hvis frisklavet). Tø hver celle pellet i et 37 ° C vandbad til en 10 s og derefter overføre til is. Til hver celle pellet straks tilføje iskold 1 x lysisbuffer + 1 x PIC til en endelig koncentration på 10.000 celler/20 µL, og -mix 10 gange af pipettering op og ned, uden at skabe bobler. For 70.000 celler er den endelige rumfang f.eks 140 µL. Arbejder på is, alikvot 20 µL/brønd af den resulterende lysates ind i en 96-brønd plade. Dække pladen med en plast sæl og inkuberes i isbad i 20 min. etiket plade “MNase fordøjelsen” og optage brønde til en skabelon nøgle. For at sikre en nøjagtig timing af kromatin fordøjelsen reaktion, ikke går til fordøjelse med mere end 2 rækker af prøver ad gangen. Lige før 20 min lysis er komplet, fortyndes MNase jeg enzym med MNase jeg fortynding buffer, til en slutkoncentration på 20 U/µL, og holde det på is. Arbejder på is, forberede MNase jeg fordøjelsen master mix ifølge tabel 4 og alikvot 20 µL af mix pr. hver række af prøver plus 5 µL dødvolumen i en række i en 96-brønd reservoir pladen og holde det på is. To rækker, volumen skal være: (20 µL x 2) + 5 µL = 45 µL. Når lysates færdig med at inkubere, fjerne MNase fordøjelse plade fra isen. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 20 µL af MNase jeg fordøjelsen master mix i hver række af prøver, og bland 10 gange af pipettering op og ned. Ændre tips mellem rækkerne. Inkuber ved stuetemperatur i nøjagtigt 5 min. Efter 5 min, til reaktionen standses, brug en multikanalpipette til at tilføje 6 µL af 250 µM ethylendiamintetra syre (EDTA) i hver række af prøver og blande op og ned et par gange. Ændre tips mellem rækkerne. Efter EDTA tilsætning, skifte indstilling af pipetten til 20 µL og mix 10 gange af pipettering op og ned for at sikre en komplet stop for fordøjelsen reaktion. Ændre tips mellem rækkerne. Ved hjælp af en multikanalpipette til hver række i MNase tilføje udtog prøver, 6 µL af 10 x lysisbuffer og bland godt ved pipettering op og ned 10 gange. Dække med en plast sæl og inkuberes i isbad i 15 min. Input adskillelse og før clearing Efter 15 min inkubation, arbejder på is, pool alle brønde til den samme celle pellet/skabelon i en steril, pre kølet på is, 1,5 mL tube (forud mærket med skabelon-ID) og blandes grundigt, men langsomt ved hjælp af en pipette til at undgå vaskemiddel skummende. For hver celle pellet/skabelon, skal du overføre 8 µL af fordøjet kromatin ind i en ny steril, 0,5 mL tube (forud mærket med skabelon-ID) og opbevares ved 4 ° C natten over. Dette vil tjene som input kontrol. Distribuere den resterende mængde af den fordøjede kromatin i 48 µL delprøver, ind i en ny 96-brønd plade. Celle pellet/skabelon 1 går ind i wells A01-A06, celle pellet/skabelon 2 går i brønde A07-A12, osv. Optage brønde til en skabelon nøgle. Label pladen “Før clearing”. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 120 µL 1 x IP Buffer + 1 x PIC og 12 µL af vasket Protein A (eller G) magnetiske perler i hvert hul i den Pre-clearing plade fra trin 2.3.3. Bland hver række af pipettering op og ned 10 gange. Ændre tips mellem rækkerne. Forsegle pladen meget godt med en aluminium plade cover og Ruger på en roterende platform ved 4 ° C i mindst 2 h. Immunoprecipitation reaktion Før du starter dette trin Sørg for, at den Ab-perle komplekse plade (trin 2.1.10) og før clearing plade (trin 2.3.4) har rugede for mindst 2 h. hurtig spin begge plader ved centrifugering for 10 s på 200 x g. Ab-perle komplekse pladen (fra trin 2.1.10) anbringes på en plade magnet og vente 15 s løsning at blive klar. Forsigtigt fjerne og supernatanten ved hjælp af en pipette uden at forstyrre perlerne. Fjerne pladen fra plade magnet og holde det på is. Før clearing reaktion pladen (fra trin 2.3.4) anbringes på en plade magnet og vente 15 s for perlerne at adskille og til løsningen at blive klar. Uden at forstyrre perlerne, omhyggeligt overføre supernatanten ved hjælp af en pipette til de tilsvarende wells Ab-perle komplekse plade opbevares på is og bland forsigtigt 15 gange af pipettering op og ned. Seal pladen godt med en aluminium plade cover og der inkuberes natten over (12-18 h) ved 4 ° C på en roterende platform. Re label plade “IP reaktion”. 3. dag 2: ndCHIP-seq Vasker og eluering Angiv den varme mixer til 65 ° C. På is, forberede en saltfattig wash buffer og høj-salt wash buffer. Hurtig spin IP reaktion plade fra trin 2.4.3 for 10 s på 200 x g. IP reaktion pladen anbringes på en plade magnet og vente 15 s løsning at blive klar. Ved hjælp af en multikanalpipette, uden at forstyrre perlerne, forsigtigt fjerne og supernatanten. Tag pladen ud plade magnet og placere den på is. Til hver række af prøver i IP reaktion plade, Tilføj 150 µL af iskold saltfattig vaske buffer og mix langsomt 10 gange op og ned for at fuldt resuspend perlerne. Placere IP reaktion plade tilbage på plade magnet, vente på perler til at adskille, og ved hjælp af en multikanalpipette, uden at forstyrre perlerne fjerne og supernatanten. Pladen anbringes tilbage på isen og Gentag trin 3.1.3 og 3.1.4 i alt 2 vasker. På isen, til hver række af prøver i IP reaktion plade, Tilføj 150 µL af den høje salt vaske buffer og mix langsomt 10 gange af pipettering op og ned for at fuldt resuspend perlerne. Placere IP reaktion plade tilbage på plade magnet, vente på perler til at adskille, og ved hjælp af en multikanalpipette, uden at forstyrre perlerne fjerne og supernatanten. IP reaktion pladen anbringes på is og pre chill en nye 96-brønd plade ved siden af. Til hver række af prøver i IP reaktion plade, Tilføj 150 µL af den høje salt vaske buffer og mix langsomt 10 gange af pipettering op og ned for at fuldt resuspend perlerne. Efter resuspension, overføre hver række af prøver til den tilsvarende række i den nye, pre kølet, 96-brønd plade. Label pladen “IP reaktion”. Kassér den gamle plade. Ny IP reaktion pladen anbringes på plade magnet og vente på perler til at adskille. Ved hjælp af en multikanalpipette, uden at forstyrre perlerne, forsigtigt fjerne og supernatanten. Holde pladen ved stuetemperatur. Til hver række af prøver i IP reaktion plade, tilføje 30 µL af ChIP eluering buffer (EB) og bland langsomt 10 gange af pipettering op og ned. Sørg for at forhindre boble dannelse. Forsegle pladen godt med en PCR dækning og inkuberes i en varme mixer på 65 ° C til 1,5 h med en blanding hastighed på 1.350 rpm. Efter 1,5 h inkubation, spin ned IP reaktion plade ved 200 x g i 1 min. ved 4 ° C. Ændre indstillingen af varme mixer til 50 ° C. Efter spin, IP reaktion pladen anbringes på en plade magnet og vente på opklaring at rydde. Ved hjælp af en multikanalpipette, uden at forstyrre perler, omhyggeligt overføre 30 µL af supernatanten ind i en ny 96-brønd plade. Bruge friske tips for hver række. Etiket pladen “IP reaktion” og opbevare det ved stuetemperatur. Protein fordøjelse Hente 30% PIND/1 M NaCl magnetisk bead17 (buffer sammensætning tabel) løsning fra 4 ° C køleskabet og opbevare det ved stuetemperatur i mindst 30 min. kritisk: sikre at den perle løsning fuldt til stuetemperatur før du fortsætter. Hente input kontrolprøver fra 4 ° C opbevaring (trin 2.3.2) og hurtig spin. Måle volumen ved hjælp af en pipette og tilføje ultrarent vand til hvert input kontrol for en endelige mængden af 30 µL. overføre input kontrolprøver forudvalgte input brønde (Tom brønde) i Undersøgelsesperioden reaktion plade (trin 3.1.12). Post at godt at prøve nøglen. På is, forberede Protein fordøjelse Master Mix som vist i tabel 5 og rumfanget af lig i en række i en 96-brønd reservoir plade. Ved hjælp af en multikanalpipette til hver række af prøver i IP reaktion plade, tilføje 40 µL af Protein fordøjelse Master Mix og mix langsomt 10 gange op og ned. Forsegle pladen godt med en PCR cover, spin ned på 200 x g i 1 min og inkuberes i en varme mixer ved 50 ° C i 30 min på 650 rpm. Mens pladen inkubere, forberede frisk 70% ethanol (EtOH) og opbevare det ved stuetemperatur. Efter 30 min inkubation er komplet, spin IP reaktion plade ved 200 x g i 1 minut, 4 ° C. Holde pladen ved stuetemperatur.Bemærk: Det samlede volumen skal være nu ~ 70 µL/brønd. Perle clean-up ved hjælp af 30% PIND/1 M NaCl magnetisk bead løsning Alikvot stuetemperatur 30% af PIND/1 M NaCl magnetisk bead løsning i en række i en ren 96-brønd reservoir plade (75 µL pr. prøve x # rækker). Arbejder ved stuetemperatur, ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 70 µL (1:1 forholdet) af 30% PIND/1 M NaCl magnetisk bead løsning til hver række af prøver i IP reaktion plade og bland 10 gange af pipettering op og ned. Ændre tips mellem rækkerne. Inkuber plade i 15 min. ved stuetemperatur. Pladen anbringes på plade magnet og Inkuber i 5 min at lade perlerne til at adskille. Ved hjælp af en pipette, uden at forstyrre perlerne, forsigtigt fjerne og supernatanten. Holde perlerne. Mens IP reaktion plade er stadig på plade magnet, ved hjælp af en multikanalpipette til hver række i prøver, Tilføj 150 µL af stuetemperatur 70% EtOH og Inkuber i 30 s. Efter 30 s, ved hjælp af en multikanalpipette, fjerne og supernatanten. Gentag dette trin en gang mere for en total af 2 vasker. Efter den anden EtOH vask, Ruger ‘tør’ pladen på plade magnet for 3 min. Inspicér visuelt plade for at sikre, at alle EtOH er fordampet. Hvis ikke, inkuberes plade i 1 min. over tørring perler resulterer i et lavere udbytte. Tag pladen ud plade magnet og ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 35 µL EB (Tabel af materialer). Bland godt af pipettering 10 gange op og ned. Ændre tips mellem rækkerne. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min. at eluere. Efter inkubationen placere IP reaktion plade tilbage på plade magnet og inkuberes i 2 min. Perlerne skal adskille og løsningen bliver klart. Overføre ved hjælp af en multikanalpipette, uden at forstyrre perler, omhyggeligt supernatanten ind i de tilsvarende huller i en ny 96-brønd pladen. Forsegle pladen med en aluminium plade cover, etiket “IPed + Input DNA”, og opbevares ved 4 ° C natten over eller ved-20 ° C for langsigtede (> 48 h) opbevaring. 4. dag 3: Bibliotek opbygning Ende reparation og fosforylering Input til den ende reparation/fosforylering reaktion er IPed + Input plade fra trin 3.3.10. Efter optøning, dreje pladen ned på 200 x g i 1 min. ved 4 ° C og holde det på is. Hente fra-20 ° C fryser alle reagenser (bortset fra enzymer) kræves til udgangen reparation/fosforylering reaktion (tabel 6) og tø dem ved stuetemperatur, så straks overføre til is. Arbejder på is, Følg tabel 6 for at indstille op ende reparation/fosforylering Master Mix i en steril, 1,5 mL microcentrifuge tube. Efter tilsætning af alle ikke-enzymet komponenter, bland godt af puls-vortexing og læg tuben tilbage på isen. Hente de relevante enzymer fra deres kolde opbevaring og transport til bænken i en kølet rør cool rack. Bland hvert enzym ved at bladre til rør, hurtig spin, og læg den tilbage i kølet rør cool rack. Når pipettering enzymet, Aspirér langsomt for at sikre en nøjagtig volumen overførsel. Efter tilsætning, vaske spidsen i master mix af pipettering op og ned. Når enzymerne, der er tilføjet, tilbage forsigtigt pulse-vortex master mix 5 gange til at sikre en jævn fordeling af alle komponenter, så hurtig spin og straks placere røret på isen. På is, alikvot et passende volumen af slutningen reparation/fosforylering Master Mix i en række i en ny 96-brønd reservoir plade; volumen til at være aliquoted: (15 µL x # rækker) + 5 µL dødvolumen. Et eksempel beregning til to rækker: (15 µL x 2) + 5 µL = 35 µL/brønd. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 15 µL af slutningen reparation/fosforylering Master Mix til hver række af prøver og bland 10 gange af pipettering op og ned. Ændre tips mellem rækkerne. Forsegle pladen med en plastik cover, spin ned på 200 x g i 1 min. ved 4 ° C, og der inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. Perle oprydning efter udgangen reparation og fosforylering Fra 4 ° C køleskab, hente 20% PIND/1 M NaCl magnetisk bead opløsning og 30% PIND/1 M NaCl opløsning og inkuberes ved stuetemperatur i mindst 30 min.Bemærk: 30% PIND/1 M NaCl løsning gør ikke indeholde magnetiske perler. Når begge løsninger nå stuetemperatur, for hver prøve forberede 80 µL af 1:2 blanding af 30% PIND/1 M NaCl og 20% PIND/1 M NaCl magnetisk bead løsninger. Et eksempel for 24 prøver: 80 µL x 24 = 1.920 µL (640 µL 30% PIND/1 M NaCl og 1,288 µL af 20% PIND/1 M NaCl magnetisk bead løsninger). Alikvot perle løsning mix, lige saa stort volumen, i en række i en 96-brønd reservoir plade og opbevare det ved stuetemperatur. Alikvot EB buffer (40 µL pr. prøve x # rækker) i en række i en ren 96-brønd reservoir plade. Et eksempel på to rækker: 40 µL x 2 = 80 µL/brønd. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 75 µL af perle blanding forberedt i trin 4.2.2 i hver række i prøver fra trin 4.1.7 og blande op og ned 10 gange. Ændre tips mellem rækkerne. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min. Fortsæt med perle oprydning procedure som beskrevet i trin 3.3.3-3.3.10. Dække pladen med en plast sæl, hurtig spin og placere den på is. Fortsæt til trin 4.3. A-hale reaktion Hente fra-20 ° C fryser alle reagenser (bortset fra enzymer) kræves til A-hale reaktion (tabel 7), tø dem ved stuetemperatur derefter straks overføre til is. Arbejder på is, følge tabel 7 til at oprette A-hale Master Mix i en steril, 1,5 mL microcentrifuge tube. Følg instruktionerne generelle enzymatisk bryg opsætning, som beskrevet i trin 4.1.4-4.1.6. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 15 µL af A-hale Master Mix til hver række af prøver og bland 10 gange af pipettering op og ned. Ændre tips mellem rækkerne. Forsegle pladen med en PCR cover, spin ned på 200 x g i 1 min. ved 4 ° C, og Inkuber i et thermocycler ved 37 ° C i 30 min. Efter inkubation, dreje pladen ned på 200 x g i 1 min og opbevare det ved stuetemperatur. Perle oprydning efter A-hale Udfør trinene beskrevet taktfast 4.2. Dække pladen med en plast sæl, mærket “A-hale + BC”, hurtig spin, og placere den på is. Fortsæt til trin 4.5. Adapter ligatur Hente fra-20 ° C fryser alle reagenser (bortset fra enzymer) kræves til adapter ligatur reaktion (tabel 8), tø dem ved stuetemperatur derefter straks overføre til is. Hente 10 µM PE adapter (supplerende tabel 1) stamopløsning og fortyndet til 0,5 µM ved hjælp af EB. Bland godt af puls vortexing. Volumen kræves er 3 µL x # af prøver. Arbejder på is, alikvot 0,5 µM PE adapter, lige saa stort volumen, til 12 brønde i en ren 96-brønd reservoir plade. Hold det på køl. Arbejder på is, Følg tabel 8 at oprette Adapter ligatur Master Mix i en steril, 1,5 mL microcentrifuge tube. Følg instruktionerne generelle enzymatisk bryg opsætning, som beskrevet i trin 4.1.4-4.1.6. Sørg for, at 5 X hurtig ligatur Buffer er helt optøede og meget godt blandet før brug. På is, alikvot et passende volumen af Adapter ligatur Master Mix i en række i en ny 96-brønd reservoir plade. For eksempel, beregning til to rækker: (23 µL x 2) + 5 µL = 51 µL/brønd. Holde pladen på is. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 2 µL af den 0,5 µM parret ende (PE) netværkskort i hver række i prøver fra trin 4.4.1 og mix. Ændre tips mellem rækkerne. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 23 µL af Adapter ligatur Master Mix til hver række af prøver og bland 15 gange af pipettering op og ned. Ændre tips mellem rækkerne. Forsegle pladen med en metal dække, etiketten “Ligatur”, spin ned på 200 x g i 1 min. ved 4 ° C, og der inkuberes ved rumtemperatur natten over. Dag 4: Perle oprydning #1 efter adapter ligatur Fra 4 ° C køleskab, hente 20% PIND/1 M NaCl magnetisk bead opløsning og inkuberes ved stuetemperatur i mindst 30 min. Mens løsningen equilibrating forberede frisk 70% EtOH. Alikvot 20% PIND/1 M NaCl magnetisk bead løsning, 55 µL pr. prøve, i en række i en 96-brønd reservoir plade og opbevare det ved stuetemperatur. Et eksempel på to rækker: 55 µL x 2 = 110 µL/brønd. Alikvot EB buffer, 50 µL pr. prøve, i en række i en ren 96-brønd reservoir plade. Et eksempel på to rækker: 50 µL x 2 = 100 µL/brønd. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 48 µL af 20% PIND/1 M NaCl magnetisk bead løsning i hver række af prøver i ligatur plade fra trin 4.5.6 og blande op og ned 10 gange. Ændre tips mellem rækkerne. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min. Fortsæt med perle oprydning procedure som beskrevet i trin 3.3.3-3.3.7. Tag pladen ud plade magnet og ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 45 µL EB (Tabel af materialer). Bland godt af pipettering 10 gange op og ned. Ændre tips mellem rækkerne. Inkuber i stuetemperatur i 3 min. at eluere. Efter inkubationen sted IP reaktion plade tilbage på plade magnet og inkuberes i 2 min. ved hjælp af en multikanalpipette, uden at forstyrre perlerne, omhyggeligt overføre supernatanten ind i de tilsvarende huller i en ny 96-brønd pladen. Mærke pladen, “Ligatur + 1 f.kr.”. Til hver brønd tilsættes 5 µL af 10 x PCR high fidelity buffer og bland godt ved pipettering op og ned. Ændre tips mellem rækkerne. Dække pladen med en plast sæl, hurtig spin, og opbevare det ved stuetemperatur. Perle oprydning #2 efter adapter ligatur Udføre oprydning til perle, som beskrevet i afsnit 4.6 med følgende ændringer: tilsættes 60 µL af 20% PIND/1 M NaCl magnetisk bead løsning til hver aktive brønd i ligatur + 1 BC plade (trin 4.6.7) og elueres fra perlerne ved hjælp af 35 µL af EB buffer. Etiket pladen “Ligatur + 2 f.kr.” og holde det på is. PCR-amplifikation Hente fra-20 ° C fryser alle reagenser (bortset fra enzymer) kræves til PCR reaktion (tabel 9), tø dem ved stuetemperatur og derefter straks placere dem på is. Arbejder på is, Følg tabel 9 at oprette PCR Master Mix i en steril, 1,5 mL microcentrifuge tube. Følg generelle bryg set-up instruktioner, som beskrevet i trin 4.1.4-4.1.5. På is, alikvot et passende volumen af PCR Master Mix i en række i en ny 96-brønd reservoir plade. Hold det på køl. Se trin 4.5.4 for prøven beregninger. Arbejder på is, ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 2 µL af hver unik 12,5 µM PCR reverse indeksering primer (supplerende tabel 2) i hver brønd i Ligation + 2 BC plade (trin 4.7.1) og bland langsomt op og ned. Ændre tips mellem rækkerne. Holde pladen på is. Arbejde på is, ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 23 µL PCR master mix i hver række i prøver fra trin 4.8.3 og mix 10 gange af pipettering op og ned. Forsegle pladen med en PCR cover, spinde det ned på 200 x g i 1 min og inkuberes i en thermocycler (Se tabel 10 for PCR cykling betingelser). Perle oprydning efter PCR-amplifikation Efter PCR-amplifikation spin plade ved 200 x g i 1 minut, 4 ° C. Udføre perle oprensning som beskrevet i afsnit 4.6 med følgende ændringer: tilføje 51 µL af 20% PIND/1 M NaCl magnetisk bead løsning til hver PCR reaktion og elueres fra perlerne ved hjælp af 25 µL af EB buffer. Forsegle pladen med en aluminium cover og spin ned på 200 x g til 1 min. butik prøver ved-20 ° C. For at validere opbygget biblioteker, udføre DNA kvantificering ved hjælp af et fluorescens-baseret analyse, visualisere det færdige produkt ved hjælp af en chip-baserede kapillær elektroforese analyzer (høj følsomhed assay) og køre berigelse kvantitativ PCR (qPCR) (Se Repræsentant resultater, validering af ndChIP-seq bibliotek kvalitet af qPCR).