नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए न्यूनतम इनपुट एकल bliss-वर्षण (IP) प्रतिक्रिया प्रति १०,००० कक्ष है । आपूर्ति प्रयोगात्मक वर्कशीट बाहर प्रिंट और प्रयोग की योजना के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में उपयोग. कमरे के तापमान पर गर्मी ~ 22 डिग्री सेल्सियस पर माना जाता है । बफर व्यंजनों के सभी तालिका 1में प्रदान की जाती हैं । बफ़र्स के सभी 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा, जब तक अंयथा कहा । 1. सेल की तैयारी कल्चरल सेल फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने और सही सेल एकाग्रता का उपयोग कर एक hemocytometer का निर्धारण । यदि १,०००,००० से अधिक कक्ष हैं, तो पंजाबियों की मात्रा बढ़ाएं । सेल गणना के आधार पर, एक बाँझ १.५ एमएल ट्यूब में 70000-100000 कोशिकाओं के बराबर aliquot, और 4 ° c पर 6 मिनट के लिए ५०० x g पर नीचे स्पिन । एक पिपेट का उपयोग करना, धीरे से हटाने और supernatant (सेल गोली परेशान किए बिना) त्यागें और बर्फ में गोली फिर से स्थगित-शीत lysis बफर + 1x चिढ़ाने की एक एकाग्रता के लिए कॉकटेल (PIC) १,००० कोशिकाओं/µ एल मिश्रण अच्छी तरह से pipetting द्वारा और नीचे 20-30 बार. यह महत्वपूर्ण है कि सेल के झुरमुट बाधित कर रहे हैं । बुलबुले बनाने के लिए नहीं की कोशिश करो । 1 दिन के लिए सीधे आगे बढ़ें (खंड 2) ndChIP-seq प्रोटोकॉल या फ़्लैश तरल नाइट्रोजन और स्टोर में सेल गोली फ्रीज-८० ° c । सॉर्ट किए गए कक्ष इकट्ठा 70000-100000 एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में16 कोशिकाओं को हल हांक के बफर नमक समाधान (HBSS), या पंजाब + 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के ३५० µ एल के साथ । 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए ५०० x g पर प्रत्येक कोशिका aliquot नीचे स्पिन । एक पिपेट का प्रयोग, धीरे (सेल गोली परेशान बिना) supernatant हटाने और बर्फ में reसस्पेंड-शीत lysis बफर + 1x १,००० कोशिकाओं के एक अंतिम एकाग्रता के लिए PIC/µ l. lysis बफर में अच्छी तरह से pipetting ऊपर और नीचे 20-30 बार मिश्रण । सुनिश्चित करें कि सेल के झुरमुट बाधित हो रहे हैं । बुलबुले बनाने के लिए नहीं की कोशिश करो । 1 दिन के लिए सीधे आगे बढ़ें (खंड 2) ndChIP-seq प्रोटोकॉल, या फ़्लैश तरल नाइट्रोजन और स्टोर में सेल गोली फ्रीज-८० ° c । 2. दिन 1: ndChIP-seq एंटीबॉडी-मनका परिसर की तैयारी एक ३७ ° c पानी स्नान और एक बर्फ बाल्टी तैयार करें । बर्फ पर कार्य करना, 1x आईपी बफर/1x PIC और 1x एंटीबॉडी (Ab) कमजोर पड़ने बफर तैयार है, और बर्फ पर उंहें रखने के लिए । पुनः प्राप्त प्रोटीन एक (या जी) चुंबकीय मोती (चयन मानदंड के लिए चर्चा देखें) से 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण, और बहुत अच्छी तरह से कोमल नाड़ी-भंवर से मिश्रण । इसे बर्फ पर रखें ।नोट: पल्स भंवर का मतलब है भंवर हर बार बंद कर दिया है एक पूर्ण भंवर ट्यूब में बना है । एक नई 2 एमएल ट्यूब में आईपी प्रतिक्रिया प्रति प्रोटीन एक (या जी) चुंबकीय मोतियों की 24 µ एल स्थानांतरण । मोती की मात्रा रिकॉर्ड और बर्फ पर ट्यूब रखने के लिए । उदाहरण के लिए, 7 आईपीएस के लिए, 24 µ l x 7 = १६८ µ l का उपयोग करें । ट्यूब चुंबक पर ट्यूब प्लेस और समाधान के लिए प्रतीक्षा करने के लिए स्पष्ट संकेत मनका जुदाई बन जाते हैं । मोतियों को परेशान किए बिना, ध्यान से एक पिपेट का उपयोग कर supernatant को हटा दें और छोड़ें । ट्यूब चुंबक से ट्यूब ले लो और यह बर्फ पर जगह है । एक बराबर मात्रा (यानी, मोतियों की प्रारंभिक मात्रा) बर्फ ठंडा आईपी बफर + 1x तस्वीर मिश्रण जोड़ें । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स । भंवर मत करो । आईपी बफर प्लेस + 1x PIC + मोती वापस ट्यूब चुंबक पर और समाधान के लिए प्रतीक्षा करने के लिए स्पष्ट संकेत मनका जुदाई बन जाते हैं । मोतियों को परेशान किए बिना, ध्यान से एक पिपेट का उपयोग कर supernatant को हटा दें और छोड़ें । दोहराएं शीत आईपी बफर + 1x तस्वीर 3 बहाकर की कुल के लिए दो बार और धो लो । अंतिम धोने के बाद, एक समान मात्रा (यानी, मोतियों की प्रारंभिक मात्रा) बर्फ ठंड आईपी बफर + 1x तस्वीर मिश्रण में मोतियों को फिर से स्थगित । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स । भंवर मत करो । बर्फ पर ट्यूब रखें । बर्फ पर, एक 25 मिलीलीटर वी के आकार का जलाशय में आईपी बफर के 10 मिलीलीटर + तस्वीर डालो । एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, एक साफ V-नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में बर्फ ठंडा आईपी बफर + 1x PIC मिश्रण के १३० µ एल जोड़ें । एक आईपी प्रति अच्छी तरह से भरें । “Ab-मनका जटिल” के रूप में प्लेट लेबल । एक अच्छी तरह से युक्त आईपी बफर में धोया प्रोटीन एक (या जी) चुंबकीय मोती के 12 µ एल जोड़ें + तस्वीर, और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण । शेष धोकर मोतियों को बर्फ पर रखें. यदि आवश्यक हो तो बर्फ पर अपने कोल्ड स्टोरेज और गल से मान्य एंटीबॉडी प्राप्त करें । बर्फ पर कार्य करना, तालिका 2में दिखाया सांद्रता के लिए 1x अटल बिहारी कमजोर करने बफर के साथ एंटीबॉडी पतला । अटल-मनका जटिल प्लेट के प्रत्येक कुआं के लिए, उपयुक्त, पतला एंटीबॉडी (तालिका 1) के 1 µ l जोड़ें. एंटीबॉडी कुंजी को अच्छी तरह से रिकॉर्ड करें । मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक पंक्ति को pipetting करके ऊपर और नीचे 20 बार मिलाएं । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । एक एल्यूमीनियम प्लेट कवर के साथ और एक घूर्णन मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस से कम 2 ज के लिए बहुत अच्छी तरह से अटल-मनका जटिल प्लेट सील ।नोट: यह मशीन कदम २.४ शुरू करने के लिए तैयार जब तक आगे बढ़ सकते हैं । कोशिका lysis और क्रोमेटिन पाचन बर्फ पर काम करना, 1x lysis बफर + 1x तस्वीर और MNase के 1 मिलीलीटर मैं कमजोर पड़ने बफर तैयार (तालिका 3) और उंहें बर्फ पर रखो । उनके-८० ° c संग्रहण से सेल छर्रों पुनः प्राप्त (या बर्फ से, अगर हौसले से तैयार) । गल एक 10 एस के लिए एक ३७ ° c पानी के स्नान में प्रत्येक कोशिका गोली, तो बर्फ को हस्तांतरण । प्रत्येक सेल गोली करने के लिए तुरंत बर्फ ठंडा 1x lysis बफर + 1x तस्वीर जोड़ने के लिए १०,००० कोशिकाओं के एक अंतिम एकाग्रता/20 µ एल, और मिश्रण 10 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा, बुलबुले बनाने के बिना । उदाहरण के लिए, ७०,००० कक्षों के लिए अंतिम खंड १४० µ है l बर्फ पर कार्य करना, aliquot 20 µ l/परिणामस्वरूप lysates के एक ९६-अच्छी तरह से थाली में । एक प्लास्टिक सील के साथ थाली कवर और बर्फ पर 20 मिनट के लिए मशीन लेबल प्लेट “MNase पाचन” और एक कुंजी टेंपलेट के कुओं रिकॉर्ड । आदेश में क्रोमेटिन पाचन प्रतिक्रिया का एक सटीक समय आश्वासन देने के लिए, एक समय में नमूनों की 2 से अधिक पंक्तियों के साथ पाचन के लिए आगे बढ़ना नहीं है । बस से पहले 20 मिनट lysis पूरा हो गया है, MNase मैं कमजोर पड़ने बफर के साथ MNase एंजाइम पतला, 20 यू के एक अंतिम एकाग्रता के लिए/µ एल, और यह बर्फ पर रखो । बर्फ पर कार्य करना, MNase मैं पाचन मास्टर मिश्रण तैयार के अनुसार तालिका 4 और aliquot 20 µ एल के नमूनों की प्रत्येक पंक्ति से अधिक 5 µ l मृत मात्रा एक ९६-अच्छी तरह से जलाशय प्लेट की एक पंक्ति में और बर्फ पर रखने के प्रति । दो पंक्तियों के लिए, वॉल्यूम होना चाहिए: (20 µ l x 2) + 5 µ l = ४५ µ l. lysates खत्म करने के बाद, बर्फ से MNase पाचन थाली निकालें । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, MNase के 20 µ एल जोड़ें मैं पाचन मास्टर मिश्रण नमूनों की प्रत्येक पंक्ति में, और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 10 बार मिश्रण. पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । ठीक 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । 5 मिनट के बाद, प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए नमूने की प्रत्येक पंक्ति में २५० µ एम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 6 µ एल जोड़ने के लिए और ऊपर और नीचे कुछ समय मिश्रण । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । इसके अलावा EDTA के बाद, पिपेट की सेटिंग स्विच करने के लिए 20 µ l और मिश्रण 10 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा पाचन प्रतिक्रिया का एक पूरा रोकने के आश्वासन देने के लिए. पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, MNase पचा नमूनों की प्रत्येक पंक्ति के लिए, 10x lysis बफर के 6 µ एल जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से ऊपर और नीचे 10 बार मिश्रण । एक प्लास्टिक सील के साथ कवर और 15 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी । इनपुट पृथक्करण और पूर्व समाशोधन 15 मिनट की मशीन के बाद, बर्फ पर काम कर रहे, एक ही सेल गोली के लिए सभी कुओं पूल/एक बाँझ, पूर्व में बर्फ पर ठंडा, १.५ मिलीलीटर ट्यूब (पूर्व टेंपलेट आईडी के साथ लेबल) और अच्छी तरह से मिश्रण है, लेकिन धीरे से एक पिपेट का उपयोग कर डिटर्जेंट फोम से बचने के लिए । प्रत्येक सेल गोली के लिए/टेंपलेट, एक नया बाँझ, ०.५ मिलीलीटर ट्यूब में पच क्रोमेटिन के 8 µ एल हस्तांतरण (पूर्व-टेम्पलेट आईडी के साथ लेबल), और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की दुकान. यह इनपुट नियंत्रण के रूप में कार्य करेगा । ४८ µ l aliquots में डाइजेस्टेड क्रोमेटिन की शेष मात्रा को एक नए ९६-वेल प्लेट में वितरित करें । सेल गोली/1 कुओं में चला जाता है A01-A06, सेल गोली/2 कुओं A07-A12, आदिमें चला जाता है । एक टेंपलेट कुंजी को कुओं रिकॉर्ड । प्लेट लेबल “पूर्व समाशोधन” । एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, कदम 2.3.3 से पूर्व समाशोधन प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से धोया प्रोटीन एक (या जी) चुंबकीय मोती के १२० µ एल 1x आईपी बफर + 1x तस्वीर और 12 µ एल जोड़ें । प्रत्येक पंक्ति को ऊपर और नीचे 10 बार pipetting करके मिलाएं । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । प्लेट सील बहुत अच्छी तरह से एक एल्यूमीनियम प्लेट कवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन मंच पर 2 ज की एक ंयूनतम के लिए मशीन । Immunoprecipitation प्रतिक्रिया इस चरण को शुरू करने से पहले सुनिश्चित करें कि अटल-मनका जटिल प्लेट (step 2.1.10) और प्री क्लियरिंग प्लेट (step 2.3.4) में कम से 2 h. क्विक स्पिन दोनों प्लेटों के लिए २०० x पर 10 एस के लिए मशीन है । एक प्लेट चुंबक पर अटल-मनका जटिल प्लेट (कदम 2.1.10 से) प्लेस और समाधान स्पष्ट हो के लिए 15 एस प्रतीक्षा करें । ध्यान से हटाने और मोतियों को परेशान किए बिना एक पिपेट का उपयोग कर supernatant त्यागें । प्लेट चुंबक से प्लेट निकालकर बर्फ पर रखें । एक प्लेट चुंबक पर (कदम 2.3.4 से) पूर्व समाशोधन प्रतिक्रिया प्लेट प्लेस और अलग करने के लिए और समाधान के लिए स्पष्ट हो मोतियों के लिए 15 एस प्रतीक्षा करें । मोतियों को परेशान किए बिना, ध्यान से एक पिपेट का उपयोग कर supernatant स्थानांतरण एबी के इसी कुएँ-मनका जटिल प्लेट बर्फ पर रखा और धीरे से मिश्रण 15 बार ऊपर और नीचे pipetting. प्लेट अच्छी तरह से सील एक एल्यूमीनियम प्लेट कवर के साथ और एक घूर्णन मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (12-18 ज) गर्मी । प्लेट “आईपी रिएक्शन” फिर से लेबल । 3. DAY 2: ndCHIP-seq बहाकर और रेफरेंस ६५ ° c के लिए हीटिंग मिक्सर सेट करें । बर्फ पर, एक कम नमक धोने बफर और उच्च नमक धोने बफर तैयार करते हैं । त्वरित २०० एक्स जी पर 10 एस के लिए कदम 2.4.3 से आईपी रिएक्शन प्लेट स्पिन एक प्लेट चुंबक पर आईपी रिएक्शन प्लेट प्लेस और समाधान के लिए 15 एस प्रतीक्षा स्पष्ट हो जाते हैं । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, मोतियों को परेशान किए बिना, ध्यान से हटाने और supernatant को त्यागें । थाली चुंबक से थाली ले लो और यह बर्फ पर जगह है । आईपी रिएक्शन प्लेट में नमूनों की प्रत्येक पंक्ति के लिए, बर्फ ठंड कम नमक धोने बफर के १५० µ एल जोड़ें और धीरे से 10 बार ऊपर और नीचे करने के लिए पूरी तरह से reसस्पेंड मोतियों का मिश्रण । आईपी रिएक्शन प्लेट वापस प्लेट चुंबक पर रखें, मोतियों को अलग करने के लिए प्रतीक्षा करें, और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, मोतियों को हटाने और supernatant त्यागने के बिना । प्लेट बर्फ पर वापस प्लेस और दोहराएं कदम 3.1.3 और 3.1.4 के कुल के लिए 2 बहाकर । बर्फ पर, आईपी रिएक्शन प्लेट में नमूनों की प्रत्येक पंक्ति के लिए, उच्च नमक धोने बफर के १५० µ एल जोड़ने के लिए और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे से 10 बार मिश्रण को पूरी तरह से reसस्पेंड । आईपी रिएक्शन प्लेट वापस प्लेट चुंबक पर रखें, मोतियों को अलग करने के लिए प्रतीक्षा करें, और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, मोतियों को हटाने और supernatant त्यागने के बिना । बर्फ पर आईपी रिएक्शन प्लेट प्लेस और पूर्व ठंडा एक नया ९६ यह बगल में अच्छी तरह से थाली । आईपी रिएक्शन प्लेट में नमूनों की प्रत्येक पंक्ति के लिए, उच्च नमक धोने बफर के १५० µ एल जोड़ने के लिए और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे से 10 बार मिश्रण को पूरी तरह से reसस्पेंड । resuspension के बाद, नमूनों की प्रत्येक पंक्ति नए, पूर्व ठंडा, ९६-अच्छी तरह से प्लेट की इसी पंक्ति में स्थानांतरण । लेबल प्लेट “आईपी रिएक्शन” । पुरानी थाली को त्याग दें । प्लेट चुंबक पर नए आईपी रिएक्शन प्लेट प्लेस और मोतियों के लिए अलग करने के लिए प्रतीक्षा करें । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, मोतियों को परेशान किए बिना, ध्यान से हटाने और supernatant को त्यागें । प्लेट को कमरे के तापमान पर रखें । आईपी रिएक्शन प्लेट में नमूनों की प्रत्येक पंक्ति के लिए, चिप रेफरेंस बफर के 30 µ एल जोड़ें (EB) और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे से 10 बार मिश्रण । बुलबुला गठन को रोकने के लिए सुनिश्चित करें. प्लेट एक पीसीआर कवर के साथ अच्छी तरह से सील और १,३५० rpm की एक मिश्रण की गति के साथ १.५ एच के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग मिक्सर में गर्मी । १.५ ज की मशीन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए २०० x g पर आईपी रिएक्शन प्लेट नीचे स्पिन । ५० ° c करने के लिए हीटिंग मिक्सर की सेटिंग बदलें । स्पिन के बाद, एक प्लेट चुंबक पर आईपी रिएक्शन प्लेट जगह और समाधान के लिए स्पष्ट करने के लिए प्रतीक्षा करें । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, मोती परेशान बिना, ध्यान से एक नया ९६-अच्छी तरह से थाली में supernatant के 30 µ एल हस्तांतरण । प्रत्येक पंक्ति के लिए ताजा सुझावों का उपयोग करें । प्लेट लेबल “आईपी रिएक्शन” और यह कमरे के तापमान पर रहते हैं । प्रोटीन पाचन पुनः प्राप्त 30% खूंटी/1 एम NaCl चुंबकीय मनका17 (बफर संरचना तालिका) 4 ° c रेफ्रिजरेटर से समाधान और यह कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखने के लिए महत्वपूर्ण: सुनिश्चित करें कि मनका समाधान आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान तक पहुंचता है । 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण (कदम 2.3.2) और त्वरित स्पिन से इनपुट नियंत्रण नमूने प्राप्त करें । एक पिपेट का उपयोग कर मात्रा को मापने और 30 µ के एक अंतिम मात्रा के लिए प्रत्येक इनपुट नियंत्रण के लिए ultrapure पानी जोड़ने एल आईपी रिएक्शन प्लेट (चरण 3.1.12) में पूर्व चयनित इनपुट वेल्स (खाली कुओं) के लिए इनपुट नियंत्रण नमूने स्थानांतरित. नमूना कुंजी के लिए अच्छी तरह से रिकॉर्ड है । बर्फ पर, प्रोटीन पाचन मास्टर मिश्रण तैयार के रूप में तालिका 5 और एक ९६-अच्छी तरह से जलाशय प्लेट की एक पंक्ति में बराबर मात्रा aliquot में दिखाया गया है । एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, आईपी रिएक्शन प्लेट में नमूनों की प्रत्येक पंक्ति के लिए, प्रोटीन पाचन मास्टर मिश्रण के ४० µ एल जोड़ें और धीरे से 10 बार ऊपर और नीचे मिश्रण । प्लेट एक पीसीआर कवर के साथ अच्छी तरह से सील, 1 मिनट के लिए २०० एक्स जी में नीचे स्पिन, और ६५० rpm पर सेट 30 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग मिक्सर में गर्मी । जबकि थाली मशीन है, ताजा ७०% इथेनॉल (ेतोः) तैयार है और यह कमरे के तापमान पर रहते हैं । 30 मिनट की मशीन के बाद पूरा हो गया है, 1 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए २०० एक्स जी में आईपी रिएक्शन प्लेट स्पिन । प्लेट को कमरे के तापमान पर रखें ।नोट: कुल मात्रा अब होना चाहिए ~ ७० µ l/ मनका साफ-अप का उपयोग कर 30% खूंटी/1 एम NaCl चुंबकीय मनका समाधान Aliquot के कमरे का तापमान 30% खूंटी/1 एम NaCl चुंबकीय मनका समाधान की एक पंक्ति में एक साफ ९६-अच्छी तरह से जलाशय प्लेट (७५ µ एल प्रति नमूना x # पंक्तियों की) । कमरे के तापमान पर कार्य करना, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, ७० µ एल जोड़ें (1:1 अनुपात) 30% खूंटी/1 एम NaCl चुंबकीय मनका समाधान आईपी रिएक्शन प्लेट में नमूनों की प्रत्येक पंक्ति के लिए और मिश्रण 10 बार pipetting द्वारा ऊपर और नीचे । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए थाली मशीन । प्लेट चुंबक पर थाली प्लेस और 5 मिनट के लिए मशीन मोतियों की अनुमति के लिए अलग । एक पिपेट का उपयोग करना, मोतियों को परेशान किए बिना, ध्यान से निकालें और supernatant को त्यागें । मोतियों को रखो । जबकि आईपी रिएक्शन प्लेट अभी भी प्लेट चुंबक पर है, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, नमूनों की प्रत्येक पंक्ति के लिए, कमरे के तापमान ७०% ेतोः के १५० µ एल जोड़ने और 30 एस के लिए मशीन । 30 एस के बाद, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, हटाने और supernatant त्यागें । इस चरण को एक बार में कुल 2 धुल के लिए दोहराएं । दूसरा ेतोः धोने के बाद, 3 मिनट के लिए प्लेट चुंबक पर ‘ सूखी ‘ थाली गर्मी. नेत्रहीन प्लेट का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी ेतोः काफूर है । यदि नहीं, तो 1 मिनट के लिए थाली मशीन पर-एक कम उपज में मोतियों का परिणाम सूख । प्लेट चुंबक से थाली ले लो और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, ३५ µ l EB (सामग्री की तालिका) जोड़ें । 10 बार ऊपर और नीचे pipetting करके अच्छी तरह मिलाएं । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । elute के लिए 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । मशीन के बाद, जगह आईपी प्रतिक्रिया प्लेट वापस प्लेट चुंबक पर और 2 मिनट के लिए मशीन । मोतियों को अलग करना चाहिए और समाधान साफ हो जाएगा । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, मोतियों को परेशान किए बिना, ध्यान से एक नया ९६-अच्छी तरह से थाली के इसी कुएं में supernatant हस्तांतरण । एक एल्यूमीनियम प्लेट कवर, लेबल “आयपेड + इनपुट डीएनए” के साथ प्लेट सील, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर, या लंबी अवधि (> 48 एच) भंडारण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । 4. DAY 3: पुस्तकालय निर्माण अंत मरंमत और फास्फारिलीकरण अंत मरंमत/फास्फारिलीकरण प्रतिक्रिया के लिए इनपुट चरण 3.3.10 से आयपेड + इनपुट प्लेट है । गल जाने के बाद, प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए २०० x g पर नीचे स्पिन करें और बर्फ पर रखें । से पुनर्प्राप्त करें-20 ° c फ्रीजर (एंजाइमों को छोड़कर) अंत मरंमत के लिए आवश्यक (तालिका 6) और कमरे के तापमान पर उन्हें गल, तो तुरंत बर्फ के लिए स्थानांतरण । बर्फ पर कार्य करना, तालिका 6 का पालन करें अंत मरंमत सेट करने के लिए/फास्फारिलीकरण मास्टर मिक्स एक बाँझ, १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में । गैर के सभी के अलावा-एंजाइम घटकों के बाद, अच्छी तरह से नाड़ी से मिश्रण-भंवर और ट्यूब वापस बर्फ पर जगह है । उनके ठंडे भंडारण और एक ठंडा ट्यूब शांत रैक में बेंच करने के लिए परिवहन से प्रासंगिक एंजाइमों निकालते हैं । ट्यूब, त्वरित स्पिन फ़्लिक करके प्रत्येक एंजाइम मिश्रण है, और यह ठंडा ट्यूब शांत रैक में वापस जगह है । जब एंजाइम pipetting, महाप्राण धीरे एक सटीक मात्रा हस्तांतरण आश्वासन देने के लिए । इसके अलावा, मास्टर मिश्रण में pipetting ऊपर और नीचे से टिप धो लो । एक बार एंजाइमों जोड़ रहे हैं, धीरे पल्स भंवर मास्टर मिश्रण 5 बार सभी घटकों के एक भी वितरण आश्वासन देने के लिए, तो जल्दी स्पिन और तुरंत बर्फ पर ट्यूब वापस जगह. बर्फ पर, एक नई ९६-अच्छी तरह से जलाशय प्लेट की एक पंक्ति में अंत मरंमत/फास्फारिलीकरण मास्टर मिश्रण का एक उचित मात्रा aliquot; aliquoted होने के लिए खंड: (15 µ l x # पंक्तियों की) + 5 µ l मृत मात्रा । दो पंक्तियों के लिए एक उदाहरण परिकलन: (15 µ l x 2) + 5 µ l = ३५ µ l/ठीक है । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, अंत की मरंमत के 15 µ एल जोड़ें/फास्फारिलीकरण मास्टर मिश्रण नमूनों की प्रत्येक पंक्ति के लिए और मिश्रण 10 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । एक प्लास्टिक कवर के साथ प्लेट सील, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए २०० एक्स जी में नीचे स्पिन, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । मनका साफ-अंत मरंमत और फास्फारिलीकरण के बाद 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से, 20% खूंटी/1 एम NaCl चुंबकीय मनका समाधान और 30% खूंटी/1 एम NaCl समाधान और कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए मशीन को पुनः प्राप्त करें ।नोट: 30% खूंटी/1 एम NaCl समाधान चुंबकीय मोतियों को शामिल नहीं करता है । के बाद दोनों समाधान तक पहुंचने के कमरे के तापमान, प्रत्येक नमूने के लिए तैयार ८० µ एल के 1:2 मिश्रण की 30% खूंटी/1 m NaCl और 20% खूंटी/1 एम NaCl चुंबकीय मनका समाधान । 24 नमूनों के लिए एक उदाहरण: ८० µ l x 24 = १,९२० µ l (६४० µ l की 30% खूंटी/1 एम NaCl और १,२८८ µ एल के 20% पेग/1 एम NaCl चुंबकीय मनका समाधान) । Aliquot मनका समाधान मिश्रण, बराबर मात्रा, एक ९६-अच्छी तरह से जलाशय प्लेट की एक पंक्ति में और यह कमरे के तापमान पर रखने के लिए । Aliquot EB बफर (४० µ एल प्रति नमूना x # पंक्तियों की) एक साफ ९६-अच्छी तरह से जलाशय प्लेट की एक पंक्ति में । दो पंक्तियों के लिए एक उदाहरण: ४० µ l x 2 = ८० µ l/ एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, कदम 4.1.7 से नमूनों की प्रत्येक पंक्ति में 4.2.2 चरण में तैयार मनका मिश्रण के ७५ µ एल जोड़ें और ऊपर और नीचे 10 बार मिश्रण । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन मनका साफ-अप प्रक्रिया के रूप में कदम 3.3.3-3.3.10 में उल्लिखित के साथ जारी रखें । एक प्लास्टिक सील, जल्दी स्पिन के साथ प्लेट को कवर और बर्फ पर जगह है । ४.३ चरण के लिए आगे बढ़ें । A-पुच्छ प्रतिक्रिया से पुनः प्राप्त-20 ° c फ्रीजर (एंजाइमों को छोड़कर) के सभी एक पूंछ प्रतिक्रिया (तालिका 7) के लिए आवश्यक), उन्हें कमरे के तापमान पर गल तो तुरंत बर्फ के लिए स्थानांतरण. बर्फ पर कार्य करना, तालिका 7 का पालन करें एक बाँझ, १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में एक पूंछ मास्टर मिश्रण स्थापित करने के लिए । सामान्य एंजाइमी काढ़ा सेटअप निर्देशों के रूप में चरणों 4.1.4-4.1.6 में उल्लिखित का पालन करें । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, एक-पूंछ मास्टर मिश्रण के 15 µ एल नमूने की प्रत्येक पंक्ति को जोड़ने और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 10 बार मिश्रण । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । एक पीसीआर कवर के साथ प्लेट सील, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए २०० एक्स जी में नीचे स्पिन, और 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक thermocycler में मशीन । मशीन के बाद, 1 मिनट के लिए २०० x g पर प्लेट नीचे स्पिन और यह कमरे के तापमान पर रहते हैं । मनका साफ-एक के बाद पूंछ चरण ४.२ में वर्णित चरणों को पूरा करें । एक प्लास्टिक सील के साथ प्लेट को कवर, लेबल “a-पूंछ + ई. पू.”, त्वरित स्पिन, और यह बर्फ पर जगह है । ४.५ चरण के लिए आगे बढ़ें । एडेप्टर बंधाव -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से पुनः प्राप्त (एंजाइमों को छोड़कर) एडाप्टर बंधाव प्रतिक्रिया (तालिका 8) के लिए आवश्यक) के सभी, उन्हें कमरे के तापमान पर गल तो तुरंत बर्फ के लिए स्थानांतरण. पुनर्प्राप्त 10 µ एम पीई अनुकूलक (पूरक तालिका 1) स्टॉक समाधान और पतला करने के लिए ०.५ µ m का उपयोग कर EB. नाड़ी भंवर से अच्छी तरह मिलाएं । आवश्यक मात्रा 3 µ l x # नमूनों की है । बर्फ पर काम करना, aliquot ०.५ µ एम पीई अनुकूलक, बराबर मात्रा, एक साफ ९६ के 12 कुओं में अच्छी तरह से जलाशय प्लेट । इसे बर्फ पर रखें । बर्फ पर कार्य करना, एक बाँझ, १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में एडाप्टर बंधाव मास्टर मिश्रण सेट करने के लिए तालिका 8 का पालन करें । सामान्य एंजाइमी काढ़ा सेटअप निर्देशों के रूप में चरणों 4.1.4-4.1.6 में उल्लिखित का पालन करें । सुनिश्चित करें कि 5x त्वरित बंधाव बफर पूरी तरह से गल गया है और बहुत अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले मिलाया । बर्फ पर, एक नया ९६-अच्छी तरह से जलाशय प्लेट की एक पंक्ति में अनुकूलक बंधाव मास्टर मिश्रण का एक उचित मात्रा aliquot । उदाहरण के लिए, दो पंक्तियों के लिए परिकलन: (23 µ l x 2) + 5 µ l = ५१ µ l/ बर्फ पर प्लेट रखें । एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, चरण निमा और मिश्रण से नमूनों की प्रत्येक पंक्ति में ०.५ µ मीटर युग्मित अंत (पीई) एडाप्टर के 2 µ एल जोड़ें । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, एडाप्टर बंधाव मास्टर मिश्रण के 23 µ एल नमूने की प्रत्येक पंक्ति को जोड़ने और 15 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । एक धातु कवर के साथ प्लेट सील, लेबल “बंधाव”, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए २०० x g पर नीचे स्पिन, और कमरे के तापमान पर रात भर में गर्मी । 4 दिन: मनका साफ #1 एडेप्टर बंधाव के बाद 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से, 20% खूंटी/1 एम NaCl चुंबकीय मनका समाधान और कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन पुनः प्राप्त । जबकि समाधान ताजा ७०% ेतोः तैयार equilibrating है । Aliquot 20% खूंटी/1 एम NaCl चुंबकीय मनका समाधान, नमूना प्रति ५५ µ एल, एक ९६ अच्छी तरह से जलाशय प्लेट की एक पंक्ति में और यह कमरे के तापमान पर रहते हैं । दो पंक्तियों के लिए एक उदाहरण: ५५ µ l x 2 = ११० µ l/ Aliquot EB बफर, नमूना प्रति ५० µ एल, एक साफ ९६ की एक पंक्ति में अच्छी तरह से जलाशय प्लेट । दो पंक्तियों के लिए एक उदाहरण: ५० µ l x 2 = १०० µ l/ एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, 20% खूंटी के ४८ µ एल जोड़ें/1 एम NaCl चुंबकीय मनका समाधान बंधाव प्लेट में नमूनों की प्रत्येक पंक्ति में कदम 4.5.6 से और ऊपर और नीचे 10 बार मिश्रण । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन मनका साफ-अप प्रक्रिया के रूप में कदम 3.3.3-3.3.7 में उल्लिखित के साथ जारी रखें । प्लेट चुंबक से थाली ले लो और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, ४५ µ l EB (सामग्री की तालिका) जोड़ें । 10 बार ऊपर और नीचे pipetting करके अच्छी तरह मिलाएं । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । elute के लिए 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर के लिए मशीन । मशीन के बाद, आईपी रिएक्शन प्लेट पर वापस प्लेट चुंबक और 2 मिनट के लिए गर्मी की जगह. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, मोतियों को परेशान किए बिना, ध्यान से एक नया ९६-अच्छी तरह से प्लेट के इसी कुएं में supernatant हस्तांतरण । प्लेट लेबल “बंधाव + 1 BC” । प्रत्येक अच्छी तरह से 10x पीसीआर उच्च निष्ठा बफर के 5 µ एल जोड़ने के लिए और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । एक प्लास्टिक सील, जल्दी स्पिन के साथ थाली को कवर, और यह कमरे के तापमान पर रहते हैं । मनका साफ #2 एडेप्टर बंधाव के बाद के रूप में निंनलिखित परिवर्तन के साथ धारा ४.६ में वर्णित मनका साफ-अप करें: जोड़ें ६० 20% खूंटी के µ एल/1 एम NaCl चुंबकीय मनका समाधान बंधाव में प्रत्येक सक्रिय अच्छी तरह से + 1 ईसा पूर्व प्लेट (कदम 4.6.7) और मोतियों से elute का उपयोग µ बफर के ३५ EB एल । थाली लेबल “बंधाव + 2 BC” और यह बर्फ पर रखो । पीसीआर प्रवर्धन -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से पुनर्प्राप्त करें सभी रिएजेंट (एंजाइमों को छोड़कर) पीसीआर प्रतिक्रिया (तालिका 9) के लिए आवश्यक है, उन्हें कमरे के तापमान पर गल तो तुरंत बर्फ पर उन्हें जगह. बर्फ पर कार्य करना, तालिका 9 का पालन करें एक बाँझ, १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में पीसीआर मास्टर मिश्रण स्थापित करने के लिए । सामान्य काढ़ा सेट-अप निर्देशों के रूप में चरणों 4.1.4-4.1.5 में उल्लिखित का पालन करें । बर्फ पर, एक नया ९६-अच्छी तरह से जलाशय प्लेट की एक पंक्ति में पीसीआर मास्टर मिश्रण की एक उपयुक्त मात्रा aliquot । इसे बर्फ पर रखें । नमूना परिकलन के लिए चरण 4.5.4 देखें । बर्फ पर काम करना, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, प्रत्येक अद्वितीय १२.५ µ मीटर पीसीआर रिवर्स अनुक्रमण प्राइमर (पूरक तालिका 2) में से 2 µ एल जोड़ें) बंधाव + 2 बीसी प्लेट (स्टेप 4.7.1) में एक अच्छी तरह से और धीरे ऊपर और नीचे मिश्रण. पंक्तियों के बीच युक्तियां परिवर्तित करें । बर्फ पर प्लेट रखें । बर्फ पर काम करना, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, चरण 4.8.3 से नमूनों की प्रत्येक पंक्ति में पीसीआर मास्टर मिश्रण के 23 µ एल जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 10 बार मिश्रण । एक पीसीआर कवर के साथ प्लेट सील, यह 1 मिनट के लिए २०० x g पर नीचे स्पिन, और एक thermocycler में मशीन (देखें पीसीआर सायक्लिंग शर्तों के लिए 10 तालिका ) । मनका साफ-के बाद पीसीआर प्रवर्धन पीसीआर प्रवर्धन के बाद 1 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए २०० x g पर थाली स्पिन । के रूप में निंनलिखित परिवर्तन के साथ धारा ४.६ में वर्णित मनका साफ-अप करें: जोड़ें ५१ 20% खूंटी के µ एल/1 एम NaCl चुंबकीय मनका समाधान प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया करने के लिए और EB बफर के 25 µ एल का उपयोग मोतियों से elute । एक एल्यूमीनियम कवर के साथ प्लेट सील और 1 मिनट के लिए २०० x g पर नीचे स्पिन-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान. निर्माण पुस्तकालयों को मान्य करने के लिए, एक प्रतिदीप्ति आधारित परख का उपयोग डीएनए ठहराव प्रदर्शन, एक चिप आधारित केशिका ट्रो विश्लेषक (उच्च संवेदनशीलता परख) का उपयोग कर अंतिम उत्पाद कल्पना, और चलाने के संवर्धन मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) (देखें प्रतिनिधि परिणाम, qPCR द्वारा ndChIP-seq पुस्तकालय गुणवत्ता की मांयता) ।