Merk: Minimum inndataene for denne protokollen er 10 000 celler per enkelt immuno-nedbør (IP) reaksjon. Skrive ut angitte eksperimentelle regnearket og bruke som en retningslinje å planlegge ut eksperimentet. Incubations ved romtemperatur antas for å være på ~ 22 ° C. Alle buffer oppskrifter finnes i tabell 1. Alle bufferne bør lagres på 4 ° C og holdt på is under prosedyren ikke annet er angitt. 1. celle forberedelse Kultivert celler Vask cellene med 1 mL av fosfat buffer saltvann (PBS) og nøyaktig bestemme cellen konsentrasjonen med en hemocytometer. Hvis det er mer enn en million celler, øke volumet på PBS. Basert på celle greven, aliquot en tilsvarende 70 000-100.000 celler i en bakteriefri 1.5 mL tube, og rotere ned på 500 x g for 6 min på 4 ° C. Bruker en pipette, sakte fjerne og forkaste nedbryting (uten å forstyrre den cellen pellet) og resuspend pellets i iskalde lyseringsbuffer + 1 x protease hemmer cocktail (bilde) til en konsentrasjon av 1000 celler / µL. Bland godt av pipettering opp og ned 20-30 ganger. Det er viktig at cellen klumper er avbrutt. Prøv ikke å skape bobler. Gå direkte til dag 1 (del 2) av ndChIP-seq-protokollen eller flash fryse celle pellet i flytende nitrogen og store på-80 ° C. Sorterte celler Samle 70 000-100.000 sorterte16 celler i en 1,5 mL tube med 350 µL av Hanks bufrede salt løsning (HBSS), eller PBS + 2% fosterets bovin serum (FBS). Nedspinning hver celle aliquot på 500 x g for 6 min på 4 ° C. Bruker en pipette, sakte fjerne nedbryting (uten å forstyrre den cellen pellet) og resuspend i iskalde lyseringsbuffer + 1 x PIC å en final konsentrasjon av 1000 celler / µL. Bland godt i lyseringsbuffer av pipettering opp og ned 20 – 30 ganger. Kontroller at celle klumper er avbrutt. Prøv ikke å skape bobler. Gå direkte til dag 1 (del 2) av ndChIP-seq-protokollen, eller flash fryse celle pellet i flytende nitrogen og store på-80 ° C. 2. dag 1: ndChIP-seq Utarbeidelse av antistoff-perle komplekset Forbered en 37 ° C vannbad og en is bøtte. Arbeider på is, forberede 1 x IP buffer/1 x PIC og 1 x antistoff (Ab) fortynning buffer, og holde dem på isen. Hente Protein A (eller G) magnetiske perler (se diskusjon for valgkriterier) fra 4 ° C lagring og bland godt ved svak puls-vortexing. Hold det på is.Merk: Puls-vortexing betyr vortexing stoppes hver gang en full spiral er dannet i røret. Overføre 24 µL av Protein A (eller G) magnetiske perler per IP reaksjon til en ny 2 mL tube. Registrere volumet av perler og holde røret på is. For eksempel 7 IPs, bruke 24 µL x 7 = 168 µL. Sett røret på røret magneten og vente på løsningen å bli klart indikerer perle separasjon. Uten å forstyrre perler, nøye fjerne nedbryting bruker en pipette og kast. Ta tuben av rør magneten og plassere den på is. Legge til en like volum (dvs., første volum av perler) iskald IP bufferen + 1 x PIC blande. Bland ved pipettering opp og ned. Gjør ikke vortex. Plasser den IP buffer + 1 x bilde + perler tilbake på røret magneten og vente på løsningen å bli klart indikerer perle separasjon. Uten å forstyrre perler, nøye fjerne nedbryting bruker en pipette og kast. Gjenta kaldt IP buffer + 1 X PIC vask to ganger for totalt 3 vasker. Etter siste vask, resuspend perler i en like volum (dvs., første volum av perler) iskald IP bufferen + 1 x PIC blande. Bland ved pipettering opp og ned. Gjør ikke vortex. Holde røret på is. På is, hell 10 mL av IP buffer + bilde i en 25 mL V-formet reservoaret. Bruke en flerkanals pipette, legge til 130 µL av iskalde IP buffer + 1 x bilde blanding i individuelle brønner i en ren V bunn 96-brønns plate. Fyll en brønn per IP. Etiketten tallerkenen som “Ab-perle kompleks”. Legg 12 µL av vasket Protein A (eller G) magnetiske perler i hvert godt som inneholder IP-buffer + bilde, og blande av pipettering opp og ned. Hold de resterende vasket perlene på is. Få godkjent antistoffer fra kald oppbevaring og tine på is, hvis nødvendig. Arbeider på is, fortynne antistoffer med 1 x Ab fortynning buffer til konsentrasjoner vist i tabell 2. Hver brønn av Ab-perle komplekse plate, Legg 1 µL av eventuelt utvannet antistoffer (tabell 1). Oppføring i brønnen nøkkelen antistoff. Bruker flerkanals pipette, bland hver rad ved pipettering opp og ned 20 ganger. Endre tips mellom rader. Seal Ab-perle komplekse platen godt med en aluminium plate cover og ruge på 4 ° C på en roterende plattform for minst 2 timer.Merk: Denne inkubasjon kan fortsette helt klar til å starte trinn 2.4. Cellen lyse og chromatin fordøyelsen Arbeider på is, forberede 1 x lyseringsbuffer + 1 x PIC og 1 mL av MNase jeg fortynning buffer (tabell 3) og holde dem på isen. Hente celle pellets fra deres-80 ° C lagring (eller is, hvis nylagde). Tine hver celle pellet i et vannbad 37 ° C i en 10 s, deretter overføre til is. Til hver celle pellet umiddelbart legge iskald 1 x lyseringsbuffer + 1 x PIC å en final konsentrasjon av 10.000 celler/20 µL, og bland 10 ganger av pipettering opp og ned, uten å skape bobler. For 70.000 cellene er for eksempel det siste bindet 140 µL. Arbeider på is, aliquot 20 µL/godt av den resulterende lysates inn i en 96-brønns plate. Dekk platen med en plast sel og ruge på is 20 min. etiketten plate “MNase fordøyelsen” og registrere brønnene til en mal nøkkel. For å sikre en eksakt tidspunkt for chromatin fordøyelsen reaksjonen, går ikke videre til fordøyelsen med mer enn 2 rader med prøver samtidig. Like før den 20 min lysis er fullført, fortynne MNase jeg enzymet med MNase jeg fortynning buffer, til en siste konsentrasjon av 20 U/µL, og holde det på is. Arbeider på is, forberede MNase jeg fordøyelsen master mix Tabell 4 og aliquot 20 µL av miksen per hver rad prøver pluss 5 µL døde volum i én rad med en 96-brønns reservoaret plate og holde det på is. To rader, volumet bør være: (20 µL x 2) + 5 µL = 45 µL. Når lysates ferdig rugende, Fjern MNase fordøyelsen platen fra isen. Bruke en flerkanals pipette, legge til 20 µL av MNase jeg fordøyelsen mestre blanding i hver rad av prøver, og bland 10 ganger av pipettering opp og ned. Endre tips mellom rader. Inkuber ved romtemperatur for nøyaktig 5 min. Etter 5 min, stoppe reaksjonen, bruker en flerkanals pipette til 6 µL av 250 µM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i hver rad av prøver og bland opp og ned et par ganger. Endre tips mellom rader. Etter EDTA, bytte innstillingen for Pipetter 20 µL og mix 10 ganger ved pipettering opp og ned for å sikre en fullstendig stopp av fordøyelsen reaksjonen. Endre tips mellom rader. Bruker en flerkanals pipette, i hver rad i MNase fordøyd utvalgene, legge til 6 µL av 10 x lyseringsbuffer og bland godt av pipettering opp og ned 10 ganger. Dekk med en plast sel og ruge på isen i 15 min. Input separasjon og før avregning Etter 15 min incubation, arbeider på is, svømmebasseng alle brønner for samme celle pellet/mal til en steril, pre kjølt på isen, 1,5 mL tube (pre merket med mal-ID) og bland godt, men langsomt bruker en pipette for å unngå vaskemiddel skummende. For hver celle pellet/mal, overføring 8 µL av fordøyd chromatin inn i en ny sterilt, 0,5 mL tube (pre merket med mal-ID) og butikk på 4 ° C over natten. Dette vil fungere som input kontroll. Distribuere gjenværende mengden fordøyd chromatin i 48 µL dele, i en ny 96-brønns plate. Cellen pellet/mal 1 går i brønner A01-A06, celle pellet/mal 2 går inn brønner A07-A12, etc. Registrere brønnene til en mal nøkkel. Etiketten platen “Pre clearing”. Bruker en flerkanals pipette, sammenlegge 120 µL av 1 x IP Buffer + 1 x PIC og 12 µL av vasket Protein A (eller G) magnetiske perler i hver brønn av pre clearing plate fra trinn 2.3.3. Bland hver rad ved pipettering opp og ned 10 ganger. Endre tips mellom rader. Seal platen godt med en aluminium plate cover og ruge på en roterende plattform på 4 ° C i minst 2 timer. Immunoprecipitation reaksjon Før du starter denne trinn Sørg for at Ab-perle komplekse platen (trinn 2.1.10) og før clearing plate (trinn 2.3.4) har inkubert for minst 2 h. rask spinn begge platene av sentrifugering for 10 s 200 x g. Plasser Ab-perle komplekse platen (fra trinn 2.1.10) på en plate magnet og vente 15 s for løsningen å bli klare. Nøye fjerne og slette nedbryting bruker en pipette uten å forstyrre perler. Fjern plate fra platen magneten og holde det på is. Plasser pre clearing reaksjon platen (fra trinn 2.3.4) på en plate magnet og vente 15 s perler å skille og løsningen å bli klare. Uten å forstyrre perler, nøye overføre nedbryting bruker en pipette tilsvarende fordelt av Ab-perle komplekse plate holdt på isen og bland forsiktig 15 ganger av pipettering opp og ned. Seal platen med en aluminium plate cover og ruge over natten (12-18 h) på 4 ° C på en roterende plattform. Nytt merke platen “IP reaksjon”. 3. dag 2: ndCHIP-seq Vasker og elueringsrør Angi oppvarming blandebatteri til 65 ° C. På is, forberede en lav-salt vaskebuffer og høy-salt vaskebuffer. Rask spinn IP reaksjon platen fra trinn 2.4.3 for 10 s 200 x g. Plasser IP reaksjon platen på en plate magnet og vente 15 s for løsningen å bli klare. Bruker en flerkanals pipette, uten å forstyrre perler, nøye fjerne og kast nedbryting. Ta platen av platen magneten og plassere den på is. I hver rad i eksempler i IP reaksjon platen, kan du legge til 150 µL av iskalde lav-salt vaske bufferen og bland sakte 10 ganger opp og ned for fullt resuspend perler. Plasser IP reaksjon platen tilbake på plate magneten, venter perler å skille, og bruker en flerkanals pipette, uten å forstyrre perler fjerne og slette nedbryting. Plasser platen tilbake på isen og gjenta 3.1.3 og 3.1.4 totalt 2 vasker. På is, i hver rad i eksempler på IP reaksjon plate, Legg 150 µL av høy salt vaske bufferen og bland sakte 10 ganger av pipettering opp og ned for fullt resuspend perler. Plasser IP reaksjon platen tilbake på plate magneten, venter perler å skille, og bruker en flerkanals pipette, uten å forstyrre perler fjerne og slette nedbryting. Plasser IP reaksjon platen på is og chill før en ny 96-brønns plate ved siden av. I hver rad i eksempler i IP reaksjon platen, kan du legge til 150 µL av høy salt vaske bufferen og bland langsomt 10 ganger av pipettering opp og ned for fullt resuspend perler. Etter rørets, overføre hver rad av prøver til den tilsvarende raden av nye, pre kjølt, 96-brønns plate. Etiketten platen “IP reaksjon”. Kast gamle platen. Plasser den nye IP reaksjon platen på plate magneten og venter perler å skille. Bruker en flerkanals pipette, uten å forstyrre perler, nøye fjerne og kast nedbryting. Holde platen ved romtemperatur. I hver rad i eksempler i IP reaksjon plate, Legg 30 µL av ChIP elueringsbufferen (EB) og bland sakte 10 ganger av pipettering opp og ned. Pass på å hindre boble formasjon. Seal platen godt med en PCR cover og ruge i en oppvarming mikser på 65 ° C for 1,5 t med en blande hastighet på 1350 rpm. Etter 1,5 t inkubasjon Nedspinning IP reaksjon platen på 200 x g for 1 min på 4 ° C. Endre innstillingen for oppvarming blandebatteri til 50 ° C. Etter spinn, plassere IP reaksjon platen på en plate magnet og vente på løsningen å fjerne. Bruker en flerkanals pipette, uten å forstyrre perler, nøye overføre 30 µL nedbryting av til en ny 96-brønns plate. Bruk ferske tips for hver rad. Merk platen “IP reaksjon”, og holde det ved romtemperatur. Protein fordøyelse Hente 30% PEG/1 M NaCl magnetiske perle17 (buffer komposisjon tabell) løsning fra 4 ° C kjøleskap og holde det ved romtemperatur for minst 30 min. kritisk: sikre at perle løsningen fullt når romtemperatur før du fortsetter. Hente inn kontroll prøver fra 4 ° C lagring (trinn 2.3.2) og rask spinn. Måler volum ved å bruke en pipette og legge ultrapure vann til hver input kontroll for et siste bind med 30 µL. overføre input kontroll eksemplene forhåndsvalgt input fordelt (tom wells) i IP reaksjon platen (trinn 3.1.12). Registrere brønnen prøve nøkkel. Klargjør Protein fordøyelse Master blandingen på is, som vist i tabell 5 og aliquot like volum i én rad med en 96-brønns reservoaret plate. Bruker en flerkanals pipette, i hver rad i eksempler på IP reaksjon plate, Legg 40 µL av Protein fordøyelse Master blandingen og bland sakte 10 ganger opp og ned. Forsegle platen godt med en PCR cover Nedspinning 200 x g for 1 min og ruge i en oppvarming blandebatteri ved 50 ° C i 30 min satt på 650 rpm. Mens platen er incubating, forberede frisk 70% etanol (EtOH) og holde det ved romtemperatur. Etter 30 min incubation er fullført, spin IP reaksjon platen på 200 x g for 1 min, 4 ° C. Holde platen ved romtemperatur.Merk: Det totale volumet bør være nå ~ 70 µL/godt. Perle oppryddingen bruker 30% PEG/1 M NaCl magnetiske perle løsning Aliquot på romtemperatur 30% av PEG/1 M NaCl magnetiske perle løsning i én rad med en ren 96-brønns reservoaret plate (75 µL per prøve x antall rader). Arbeider i romtemperatur, bruker en flerkanals pipette, Legg 70 µL (1:1 ratio) av 30% PEG/1 M NaCl magnetiske perle løsningen i hver rad i eksempler i IP reaksjon platen og bland 10 ganger av pipettering opp og ned. Endre tips mellom rader. Inkuber platen i 15 min ved romtemperatur. Plasser platen på plate magneten og ruge i 5 min å tillate perler å skille. Bruker en pipette, uten å forstyrre perler, nøye fjerne og kast nedbryting. Holde perler. Mens IP reaksjon platen er fortsatt på plate magneten, bruker en flerkanals pipette, i hver rad i prøvene, legge til 150 µL av romtemperatur 70% EtOH og Inkuber for 30 s. Etter 30 s, med en flerkanals pipette, fjerne og slette nedbryting. Gjenta dette trinnet en gang totalt 2 vasker. Etter andre EtOH vask, ruge plate magneten “tørre” plate for 3 min. visuelt inspisere plate å sørge for at alle EtOH er fordampet. Hvis ikke, ruge platen i 1 over tørking perler resultatene i en lavere avkastning. Ta platen av platen magneten og bruker en flerkanals pipette, legge til 35 µL EB (Tabell for materiale). Bland godt av pipettering 10 ganger opp og ned. Endre tips mellom rader. Inkuber ved romtemperatur for 3 min til elute. Etter inkubasjon plasser IP reaksjon platen tilbake på plate magneten og ruge i 2 minutter. Perlene skal skille og løsningen vil bli klart. Bruker en flerkanals pipette, uten å forstyrre perler, nøye overføre nedbryting til tilsvarende brønnene av en ny 96-brønns plate. Forsegle platen med en aluminium plate cover, etiketten “IPed + Input DNA” og lagre på 4 ° C over natten, eller på 20 ° C lang sikt (> 48t) lagring. 4. dag 3: Biblioteket konstruksjon Slutten reparasjon og fosforylering For enden reparasjon/fosforylering reaksjonen er IPed + Input plate fra trinn 3.3.10. Etter tining, Nedspinning platen på 200 x g for 1 min på 4 ° C og holde det på is. Hente fra 20 ° C fryser alle reagenser (unntatt enzymer) kreves for slutten reparasjon/fosforylering reaksjonen (tabell 6) og tiner dem ved romtemperatur, og deretter øyeblikkelig overføre til is. Arbeider på is, følg tabell 6 for å definere slutten reparasjon/fosforylering Master Mix i et sterilt, 1,5 mL microcentrifuge rør. Etter tillegg av alle ikke-enzymet komponenter, bland godt puls-vortexing og sett røret tilbake på isen. Hente de relevante enzymene fra kald oppbevaring og transport til benken i en kjølt tube kule rack. Bland hver enzym ved å sveipe rør, rask spinn, og sett den tilbake i kjølt tube kule stativet. Når pipettering enzymet, Sug opp sakte for å sikre en nøyaktig volum overføring. Tillegg, vaskes spissen i master blanding av pipettering opp og ned. Når enzymer er lagt, tilbake forsiktig puls-vortex master blande 5 ganger å sikre en jevn distribusjon av alle komponenter, og rask spinn og umiddelbart sett røret på isen. På is, aliquot en passende mengde slutten reparasjon/fosforylering Master Mix i én rad med en ny 96-brønns reservoaret plate; volum som skal aliquoted: (15 µL x antall rader) + 5 µL døde volum. En eksempel beregning for to rader: (15 µL x 2) + 5 µL = 35 µL/godt. Bruker en flerkanals pipette, Legg 15 µL av slutten reparasjon/fosforylering Master Mix i hver rad av prøver og bland 10 ganger av pipettering opp og ned. Endre tips mellom rader. Forsegle platen med et plastdeksel Nedspinning 200 x g for 1 min på 4 ° C og ruge ved romtemperatur for 30 min. Perle rydde opp etter slutten reparasjon og fosforylering 4 ° C kjøleskapet, hente 20% PEG/1 M NaCl magnetiske perle løsning og 30% PEG/1 M NaCl løsning og ruge ved romtemperatur for minst 30 min.Merk: 30% PEG/1 M NaCl løsningen ikke inneholde magnetiske perler. Når begge løsninger når romtemperatur, for hvert utvalg forberede 80 µL av 1:2 blanding av 30% PEG/1 M NaCl og 20% PEG/1 M NaCl magnetiske perle løsninger. Et eksempel på 24 eksempler: 80 µL x 24 = 1,920 µL (640 µL av 30% PEG/1 M NaCl og 1,288 µL av 20% PEG/1 M NaCl magnetiske perle løsninger). Aliquot perle løsningen bland, like volum, i én rad med en 96-brønns reservoaret plate og holde det ved romtemperatur. Aliquot EB buffer (40 µL per prøve x antall rader) i én rad med en ren 96-brønns reservoaret plate. Et eksempel på to rader: 40 µL x 2 = 80 µL/godt. Bruker en flerkanals pipette, legge til 75 µL av perle blandingen i trinn 4.2.2 i hver rad av prøver fra trinn 4.1.7 og bland opp og ned 10 ganger. Endre tips mellom rader. Inkuber ved romtemperatur i 15 min. Fortsett med perle opprydding prosedyren som beskrevet i trinn 3.3.3-3.3.10. Dekk platen med en plast sel, rask spinn og plassere den på is. Fortsett med trinn 4.3. A Tailing reaksjon Hente fra 20 ° C fryseren alle reagenser (unntatt enzymer) kreves for A Tailing reaksjonen (Tabell 7), tine dem ved romtemperatur og øyeblikkelig overføre til is. Arbeider på is, følg Tabell 7 sette opp A Tailing Master Mix i et sterilt, 1,5 mL microcentrifuge rør. Følg installasjonsveiledningen generelle enzymatisk brygg som beskrevet i trinn 4.1.4-4.1.6. Bruker en flerkanals pipette, Legg 15 µL av A Tailing Master blandingen i hver rad av prøver og bland 10 ganger av pipettering opp og ned. Endre tips mellom rader. Forsegle platen med en PCR cover Nedspinning 200 x g for 1 min på 4 ° C og ruge i en thermocycler på 37 ° C i 30 min. Etter inkubasjon, Nedspinning platen på 200 x g for 1 min og holde det ved romtemperatur. Perle rydde opp etter A Tailing Utfør trinnene beskrevet i trinn 4.2. Dekk platen med en plast sel, etikett “A-tail + BC”, rask spinn, og plassere den på is. Fortsett med trinn 4.5. Adapter hemorroider Hente fra 20 ° C fryseren alle reagenser (unntatt enzymer) kreves for kortet ligation reaksjonen (tabell 8), tine dem ved romtemperatur og øyeblikkelig overføre til is. Hente 10 µM PE kortet (ekstra tabell 1) lagerløsning og fortynne til 0,5 µM ved hjelp av EB. Bland godt puls vortexing. Volumet kreves er 3 µL x antall eksempler. Arbeider på is, aliquot 0,5 µM PE kortet, like volum, i 12 brønner på en ren 96-brønns reservoaret plate. Hold det på is. Arbeider på is, følg tabell 8 å konfigurere kortet Ligation Master Mix i et sterilt, 1,5 mL microcentrifuge rør. Følg installasjonsveiledningen generelle enzymatisk brygg som beskrevet i trinn 4.1.4-4.1.6. Kontroller at 5 X rask Ligation Buffer er fullt tinte og godt blandet før bruk. På is, aliquot en passende mengde Adapter Ligation Master Mix i én rad med en ny 96-brønns reservoaret plate. For eksempel beregning for to rader: (23 µL x 2) + 5 µL = 51 µL/godt. Holde platen på is. Bruke en flerkanals pipette, legge til 2 µL på 0,5 µM sammen slutten (PE) kortet i hver rad med prøver fra trinn 4.4.1 og bland. Endre tips mellom rader. Bruker en flerkanals pipette, Legg 23 µL av kortet Ligation Master Mix i hver rad av prøver og bland 15 ganger av pipettering opp og ned. Endre tips mellom rader. Seal platen med et metall cover, etiketten “Hemorroider”, Nedspinning 200 x g for 1 min på 4 ° C, og ruge ved romtemperatur over natten. Dag 4: Perle oppryddingen #1 etter kort hemorroider 4 ° C kjøleskapet, hente 20% PEG/1 M NaCl magnetiske perle løsningen og ruge ved romtemperatur for minst 30 min. Mens løsningen er equilibrating forberede frisk 70% EtOH. Aliquot 20% PEG/1 M NaCl magnetiske perle løsningen, 55 µL per prøve, i én rad med en 96-brønns reservoaret plate og holde det ved romtemperatur. Et eksempel på to rader: 55 µL x 2 = 110 µL/godt. Aliquot EB buffer, 50 µL per prøve, i én rad med en ren 96-brønns reservoaret plate. Et eksempel på to rader: 50 µL x 2 = 100 µL/godt. Bruker en flerkanals pipette, Legg 48 µL av 20% PEG/1 M NaCl magnetiske perle løsningen i hver rad av prøver i Ligation platen fra trinn 4.5.6 og bland opp og ned 10 ganger. Endre tips mellom rader. Inkuber ved romtemperatur i 15 min. Fortsett med perle opprydding prosedyren som beskrevet i trinn 3.3.3-3.3.7. Ta platen av platen magneten og bruker en flerkanals pipette, legge til 45 µL EB (Tabell for materiale). Bland godt av pipettering 10 ganger opp og ned. Endre tips mellom rader. Inkuber ved romtemperatur for 3 min til elute. Etter inkubasjon sted IP reaksjon platen tilbake på plate magneten og ruge for 2 min. med en flerkanals pipette, uten å forstyrre perler, nøye overføre nedbryting til tilsvarende brønnene av en ny 96-brønns plate. Etiketten platen “Ligation + 1 BC”. Hver brønn Legg 5 µL 10 x PCR Hi-Fi bufferen og bland godt pipettering opp og ned. Endre tips mellom rader. Dekk platen med en plast sel, rask spinn, og holde det ved romtemperatur. Perle rydde opp #2 etter kort hemorroider Utføre perle oppryddingen som beskrevet i delen 4.6 med følgende endringer: legge til 60 µL av 20% PEG/1 M NaCl magnetiske perle løsning hver aktive brønn i Ligation + 1 BC plate (trinn 4.6.7) og elute fra perler med 35 µL EB bufferen. Merk platen “Ligation + 2 BC” og holde det på is. PCR forsterkning Hente fra 20 ° C fryseren alle reagenser (unntatt enzymer) kreves for PCR reaksjonen (tabell 9), tine dem ved romtemperatur deretter umiddelbart plassere dem på isen. Arbeider på is, følg tabell 9 for å sette opp PCR Master Mix i et sterilt, 1,5 mL microcentrifuge rør. Følg de generelle brygge Oppsett instruksjonene som beskrevet i trinn 4.1.4-4.1.5. På is, aliquot en passende mengde PCR Master Mix i én rad med en ny 96-brønns reservoaret plate. Hold det på is. Se trinn 4.5.4 for eksempel beregninger. Arbeider på is, med en flerkanals pipette, Legg 2 µL av hver unike 12.5 µM PCR omvendt indeksering primer (ekstra tabell 2) i hver brønn i Ligation + 2 BC plate (trinn 4.7.1) og bland langsomt opp og ned. Endre tips mellom rader. Holde platen på is. Arbeider på is, med en flerkanals pipette, legge til 23 µL av PCR master blandingen i hver rad av prøver fra trinn 4.8.3 og bland 10 ganger av pipettering opp og ned. Forsegle platen med en PCR cover Nedspinning 200 x g for 1 min og ruge i en thermocycler (se Tabell 10 for PCR sykling forhold). Perle rydde opp etter PCR forsterkning Etter PCR forsterkning spinne platen på 200 x g for 1 min, 4 ° C. Utføre perle oppryddingen som beskrevet i delen 4.6 med følgende endringer: Legg 51 µL av 20% PEG/1 M NaCl magnetiske perle løsning til hver PCR reaksjon og elute fra perler med 25 µL EB bufferen. Seal platen med en aluminium dekke og spinne ned 200 x g for 1 min. Store eksemplene på 20 ° C. For å validere konstruert biblioteker, utføre DNA kvantifisering bruker en fluorescens-baserte analysen, visualisere det endelige produktet med en chip-baserte kapillært geleelektroforese analyzer (høy følsomhet analysen) og kjøre berikelse kvantitative PCR (qPCR) (se Representant resultater, validering av ndChIP-seq biblioteket kvalitet av qPCR).