我们提出了一个改良的本地染色质沉淀测序 (芯片-seq) 的方法, 以生成序列数据集适合核密度芯片-seq 分析框架集成 micrococcal 核酸 (MNase) 可及性组蛋白修饰测量。
我们提出了一个改进的本地染色质沉淀测序 (芯片-seq) 实验协议兼容的高斯混合分布的分析方法 (核密度芯片序列; ndChIP-seq), 使生成的micrococcal 核酸 (MNase) 可及性与组蛋白修饰的联合测量。核位置和局部密度, 以及对其组蛋白亚基的后修饰, 协同调节局部转录状态。组合测量的核可达性与组蛋白修饰产生的 ndChIP-seq 允许同时审讯这些功能。ndChIP-seq 方法适用于基于交联的芯片-seq 协议的小数目的原电池。在一起, ndChIP-seq 使测量组蛋白修饰结合局部核密度, 以获得新的洞察力的共享机制, 调节 RNA 转录在稀有的原细胞群体。
真核细胞基因组被包装成染色质通过重复核结构, 包括两个副本的四组蛋白 (例如, H2A, H2B, H3, 和 H4) 的限制由146基对的 DNA1,2。染色质重塑复合体在基因启动子边界内控制核位置, 并通过改变 DNA 对转录因子的可及性来参与基因表达的调控, 并对 RNA 聚合酶机械3, 4。
核内组蛋白的氨基末端尾端受到各种共价键的修饰, 包括乙酰化、甲基、磷酸、化、sumo、甲, 以及特定氨基酸的羟氨酸5,6,7,8. 这些修改的位置和程度决定了染色质的状态, 影响染色质结构和控制通路的分子配合物, 允许转录活化的7。考虑到核密度和组蛋白修饰在基因转录的局部控制中起着作用, 我们开发了一种本机芯片方法, 可以同时测量核密度和组蛋白修饰9, 10。
本机芯片-seq 利用切 micrococci 核酸 (MNase) 在细胞核内的原生状态中消化完整的染色质11,12, 该属性已被杠杆映射核定位13,14,15. 核密度芯片-seq (ndChIP) 利用 MNase 对染色质的开放区域的优先访问性的特性来生成将 MNase 可访问性与组蛋白修饰10相结合的测量。ndChIP-seq 适用于在罕见的原代细胞, 组织和培养细胞的组蛋白修饰的分析。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 使序列数据集的生成适合于先前描述的分析框架工作10 , 它集成了片段大小后沉淀, 由配对端读取边界确定, 以同时调查 MNase 的可访问性与组蛋白修饰测量。此前, 本议定书适用于1万个主要的人脐血衍生 CD34+细胞和人类胚胎干细胞揭示染色质结构和组蛋白修饰之间的独特关系在这些细胞类型中10.考虑到它能够同时测量核的可访问性和组蛋白修饰, ndChIP-seq 能够在单个核级别的单元格中揭示表特征, 并将异构签名解析为组成元素。通过 ndChIP-seq 研究异质细胞群的一个例子是对二价促进剂的调查, 其中两个 H3K4me3, 一个活跃标记, 和 H3K27me3, 一个镇压标记, 存在10。
考虑到染色质修饰和核定位在转录调控中的组合性质, 一种能够同时测量这些特性的方法可能会为表观遗传学的调控提供新的见解。这里介绍的 ndChIP-seq 协议是一种本地芯片-seq 协议, 用于在稀有的主单元中同时对组蛋白修饰和核密度进行审讯,9,10。ndChIP-seq 利用酶消化染色质, 当耦合到配对结束大规模并行排序和高斯混合分布模型, 允许调查组蛋白修饰在单一的核水平和由种群内异质性驱动的表剖面的反褶积。使用此协议, 我们以前报告了免疫沉淀片段大小的唯一分布, 由配对结束读取边界确定, 与 ChromHMM10,24定义的特定染色质状态相关。
ndChIP 序列库的质量取决于多种因素, 如抗体特异性和敏感性、最佳 MNase 消化条件和染色质质量。使用的抗体的特异性是关键的生产成功的 ndChIP-seq 库。一个理想的抗体显示高亲和性的表位的兴趣与小交叉反应性与其他抗原。同样重要的是选择磁性珠与最高亲和力的抗体选择。
MNase 消化是该协议中的一个关键和时间浓度敏感的反应。因此, 在处理多个样本时, 每个反应都必须在相当的时间内孵化 (参见步骤 2.2)。染色质的质量是另一个因素, 显着影响的结果 ndChIP-seq. 分裂染色质导致一个次优 MNase 消化剖面和结果在低信噪比的图书馆。本协议不推荐使用低细胞活性或降解染色质的初级样品, 如福尔马林固定石蜡 (FFPE) 组织。
在染色质提取过程中添加 PIC 可以减少不受欢迎的 (即, 随机) 染色质碎片, 并保留组蛋白尾部的完整性。因此, PIC 需要添加到裂解缓冲区和沉淀缓冲区, 才使用。在通过流式细胞仪选择细胞时, 选择可行的细胞, 并确保细胞以较低的流速排列, 以提高细胞数估计的准确性和生存能力。避免将单元格直接分类到裂解缓冲区。鞘缓冲液会稀释裂解缓冲液, 防止细胞膜的有效性 MNase。根据类型的细胞或生物体, 滴定 MNase 可能需要获得最佳的消化。
哺乳动物细胞的 ndChIP-seq 需要最小测序深度为5000万配对读 (2500万片段) 为狭窄的标记和1亿配对读 (5000万片断) 为宽广的标记和输入。高斯混合分布算法对已被测序到深度显著低于本建议的库, 将无法达到最佳性能。ndChIP-seq 将不分类促进者, 很少分离之间的加权分布值的单一和 di 核片段长度成单或 di 核主导的发起人。因此, 在随后的分析中必须删除这些启动子。可以生成生物复制, 以增加对预测分布的信心, 并确定 MNase 消化和图书馆建设中的技术变异性。
与本机芯片序列协议的以前的迭代不同, ndChIP 提供了通过利用片段大小后沉淀来整合核密度来研究染色质结构和组蛋白修饰的组合效应的方法,由 MNase 的可及性决定, 组蛋白修饰测量。ndChIP 在原发性细胞和组织中的应用, 将为表观遗传调控的综合性质提供新的见解, 并能识别由于群体内异质性而导致的后生特征。
The authors have nothing to disclose.
a.1 得到加拿大卫生研究院的加拿大研究生奖学金的支持。这项工作得到了来自不列颠哥伦比亚省和加拿大卫生研究院 (CIHR-120589) 的赠款的支持, 这是加拿大的遗传学、环境和健康研究联合会倡议的一部分, 也是由特里福克斯研究所计划提供的。项目赠款 #TFF-122869 M.H. 和一个特里福克斯研究所新的研究员奖 (授予 1039) 到 M.H。
1M Tris-HCl –pH 7.5 | Thermo Scientific | 15567-027 | |
1M Tris-HCl –pH 8 | Thermo Scientific | 15568-025 | |
0.5M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
5M NaCl | Sigma | 1001385276 | |
Triton X-100 | Sigma | 1001412354 | |
Sodium-Deoxycholate | Sigma | 1001437582 | |
SDS | Thermo Scientific | 15525-017 | |
Sodium-Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
100% EtOH | NA | NA | |
V-bottom 96 well plate (AB 1400) | Thermo Scientific | AB-1400-L | |
Gilson P2 pipetman | Mandel | F144801 | |
Gilson P10 pipetman | Mandel | F144802 | |
Gilson P20 pipetman | Mandel | F123600 | |
Gilson P100 pipetman | Mandel | F123615 | |
Gilson P200 pipetman | Mandel | F123601 | |
Gilson P1000 pipetman | Mandel | F123603 | |
Micrococcal Nuclease | NEB | M0247S | |
Thermo Mixer C (Heating block mixer) | Eppendorf | 5382000023 | |
Multi 12-channel Pippet P20 | Rainin | 17013803 | |
Multi 12-channel Pippet P200 | Rainin | 17013805 | |
1.5 ml LoBind tube | Eppendorf | 22431021 | |
0.5 ml LoBind tube | Eppendorf | 22431005 | |
Plastic Plate Cover | Edge Bio | 48461 | |
PCR cover | Bio Rad | MSD-1001 | |
Aluminum Plate Cover | Bio Rad | MSF-1001 | |
Elution buffer (EB buffer) | Qiagen | 19086 | |
1M DTT | Sigma | 646563 | |
Eppendorf 5810R centrifuge | Eppendorf | 22625004 | |
Ultrapure water | Thermo Scientific | 10977-015 | |
Protein G dynabeads | Thermo Scientific | 10001D | |
Protein A dynabeads | Thermo Scientific | 10001D | |
Protease inhibitor Cocktail | Calbiochem | 539134 | |
Rotating platform | Mandel | 1b109-12052010 | |
Plate magnet | Alpaqua | 2523 | |
Domed 12-cap strip | Bio Rad | TCS1201 | |
Buffer G2 | Qiagen | 1014636 | |
Protease | Qiagen | 19155 | |
Tube Magnet (DynaMag-2) | Thermo Scientific | 12321D | |
Tube Magnet (DynaMag-2) | LabCore | 730-006 | |
V shape Plastic reservoir | Mandel | S0100A | |
Vortex | Mandel | C1801 | |
Mini Fuge | Mettler Toledo | XS2035 | |
Analytical scale | Mandel | LB109-12052010 | |
Quick Ligation Reaction Buffer, 5X | NEB | B6058S | |
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | M0210S | |
Klenow Fragment (3'-5' exo) | NEB | M0212S | |
T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | |
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
Deoxynucleotide Solution mix, 10mM | NEB | N0447S | |
dATP Solution 10mM | NEB | N0440S | |
Quick T4 DNA Ligase | NEB | M0202T | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP), 25mM | NEB | P0756S | |
DNA Polymerase | Thermo Scientific | F549L | |
NEBuffer 2 | NEB | B7002S | |
Hank's buffered salt solution | Thermo Scientific | 14025076 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | A3160702 | |
phosphate buffer saline | Thermo Scientific | 10010023 | |
H3K4me3 | Cell Signaling | 9751S | |
H3K4me1 | Diagenode | C15410037 | |
H3K27me3 | Diagenode | pAb-069-050 | |
H3K36me3 | Abcam | ab9050 | |
H3K9me3 | Diagenode | C15410056 | |
SeraMag super-paramagnetic beads |