NOTE : L’entrée minimum pour que ce protocole est de 10 000 cellules par réaction unique immuno-précipitation (IP). Imprimer la feuille de calcul expérimental fourni et d’utiliser comme guide pour planifier l’expérience. Incubation à température ambiante est censées pour être à ~ 22 ° C. Toutes les recettes de tampon sont fournis dans le tableau 1. Tous les tampons devraient être conservés à 4 ° C et gardé sur glace au cours de la procédure, sauf indication contraire. 1. préparation de la cellule Cellules cultivées Laver les cellules avec 1 mL de solution saline de tampon au phosphate (PBS) et déterminer avec précision la concentration de cellules utilisant un hémocytomètre. S’il y a plus de 1 million de cellules, augmenter le volume de PBS. Basé sur le nombre d’éléments, aliquot l’équivalent de 70 000-100 000 cellules dans un tube stérile de 1,5 mL et centrifuger à 500 x g pendant 6 min à 4 ° C. À l’aide d’une pipette, retirer doucement et jeter le surnageant (sans déranger le culot cellulaire) et Resuspendre le culot dans le tampon de lyse glacée + 1 x inhibiteur de protéase cocktail (PIC) à une concentration de 1 000 cellules / µL. mélanger bien en pipettant également monter et descendre de 20-30 fois. Il est essentiel que les amas de cellules soient perturbés. Essayez de ne pas créer de bulles. Passer directement au jour 1 (Section 2) du protocole ndChIP-seq ou flash geler le culot cellulaire dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C. Cellules triées Prélever des 70 000-100 000 triés16 cellules dans un tube de 1,5 mL 350 µl de la solution saline tamponnée (HBSS), de Hank ou PBS + 2 % sérum fœtal (SVF). Tournez en bas de chaque cellule aliquote à 500 x g pendant 6 min à 4 ° C. À l’aide d’une pipette, lentement retirer le surnageant (sans déranger le culot cellulaire) et remettre en suspension dans le tampon de lyse glacée + 1 x PIC à une concentration finale de 1 000 cellules / µL. Mélangez bien dans le tampon de lyse en pipettant également en haut et en bas 20 à 30 fois. Ce que l’amas de cellules soient perturbés. Essayez de ne pas créer de bulles. Passer directement au jour 1 (Section 2) du protocole ndChIP-seq ou flash geler le culot cellulaire dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C. 2. jour 1 : ndChIP-seq Préparation du complexe anticorps-perle Préparer un bain-marie à 37 ° C et un seau à glace. Travaillant sur la glace, préparer 1 x IP tampon/1 x PIC et 1 x tampon de dilution des anticorps (AC) et les conserver sur la glace. Récupérer des billes magnétiques protéine A (ou G) (voir la Discussion pour les critères de sélection) de l’entreposage à 4 ° C et mélanger très bien en doux pulsation-Vortex. Gardez-le sur la glace.NOTE : Pulse-Vortex signifie Vortex est arrêté chaque fois qu’un vortex complet est formé dans le tube. Transférer 24 billes magnétiques µL de protéine A (ou G) par réaction de l’IP dans un nouveau tube de 2 mL. Noter le volume de billes et maintenir le tube sur la glace. Par exemple, pour 7 IPs, utilisez µL 24 x 7 = 168 µL. Placer le tube sur l’aimant de tube et attendez que la solution devienne la séparation nette entre la perle de l’indicateur. Sans déranger les perles, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette doucement et jetez-le. Prenez le tuyau au large de l’aimant de tube et placez-le sur la glace. Ajouter un volume égal (c.-à-d., un volume initial de perles) de mémoire tampon d’IP glacée + 1 x PIC mélanger. La composition de pipetage de haut en bas. Ne pas vortexer. Placez le tampon IP + 1 x PIC + perles sur l’aimant de tube et attendre la solution devenir la séparation nette entre la perle de l’indicateur. Sans déranger les perles, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette doucement et jetez-le. Répétez tampon IP froid + 1 X lavage PIC deux fois plus pour un total de 3 lavages. Après le lavage final, remettre en suspension les perles dans un volume égal (c.-à-d., un volume initial de perles) de mémoire tampon d’IP glacée + 1 x PIC mélanger. La composition de pipetage de haut en bas. Ne pas vortexer. Maintenir le tube sur la glace. Sur la glace, verser 10 mL de tampon d’IP + PIC dans un réservoir en forme de V de 25 mL. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 130 µL de tampon IP glacée + 1 x mélange PIC dans des puits individuels d’un fond en V 96 puits propre plaque. Remplir un puits par IP. La plaque sous l’étiquette « Ab-perle complexe ». Ajouter 12 billes magnétiques µL de la protéine A lavé (ou G) dans chaque cupule contenant la mémoire tampon d’IP + PIC et mélanger par pipetage de haut en bas. Garder les perles lavés restants sur la glace. Obtenir des anticorps validés de leur entreposage au froid et au dégel sur la glace, si nécessaire. Travaillant sur la glace, diluer l’anticorps avec tampon de dilution 1 x Ab aux concentrations indiquées au tableau 2. Dans chaque puits de la plaque complexe Ab-perle, ajouter 1 µL de l’anticorps appropriés, dilué (tableau 1). Compte rendu du puits à la clé de l’anticorps. Utilisez la pipette multicanaux, mélanger chaque ligne en pipettant également monter et descendre de 20 fois. Changer de conseils entre les rangs. Flasque de l’Ab-perle complexe très bien avec un couvercle de plaque en aluminium et incuber à 4 ° C sur une plate-forme tournante pendant au moins 2 h.Remarque : Cette incubation peut aller de l’avant jusqu’au moment de commencer l’étape 2.4. Digestion de la lyse et la chromatine cellulaire Travaillant sur la glace, préparer 1 x tampon de lyse + 1 x PIC et 1 mL de MNase j’ai dilution de la mémoire tampon (tableau 3) et les garder sur la glace. Récupérer les plombs de la cellule de leur stockage à-80 ° C (ou de la glace, si fraîchement préparé). Décongeler chaque culot cellulaire dans un bain-marie à 37 ° C pendant une 10 s, puis transfert à la glace. À chaque culot ajouter immédiatement glacée 1 x tampon de lyse + 1 x PIC à une concentration finale de 10 000 cellules/20 µL et mélanger 10 fois en pipettant également, haut et bas, sans créer de bulles. Par exemple, pour 70 000 cellules le volume final est 140 µL. Travail sur la glace, aliquote 20 µL/puits des lysats résultantes dans une plaque de 96 puits. Couvrir la plaque avec un sceau en plastique et incuber sur glace pendant 20 min. étiquette la plaque « MNase digestion » et d’enregistrer les puits à une touche de modèle. Afin d’assurer un moment exact de la réaction de digestion de la chromatine, ne passez pas à la digestion avec plus de 2 rangées d’échantillons à la fois. Juste avant la lyse de 20 min est terminée, diluer la MNase j’ai enzyme avec MNase j’ai dilution tampon, à une concentration finale de 20 U/µL et le garder sur la glace. Travaillant sur la glace, préparer la MNase j’ai digestion master mix selon le tableau 4 et aliquote 20 µL du mélange par chaque ligne d’échantillons plus volume mort de 5 µL dans une ligne d’une plaque 96 puits réservoir et gardez-le sur la glace. Pour les deux lignes, le volume doit être : (20 µL x 2) + 5 µL = 45 µL. Après que les lysats terminé en incubation, retirez la plaque de digestion de MNase de glace. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 20 µL de MNase j’ai digestion master mix dans chaque ligne d’échantillons et mélanger 10 fois par pipetage de haut en bas. Changer de conseils entre les rangs. Incuber à température ambiante pendant exactement 5 minutes. Après 5 min, pour arrêter la réaction, utilisez une pipette multicanaux pour ajouter 6 µL de l’acide éthylènediaminetétraacétique 250 µM (EDTA) dans chaque ligne d’échantillons et mélanger en haut et en bas à quelques reprises. Changer de conseils entre les rangs. Après addition de l’EDTA, basculez sur le réglage de la pipette à 20 µL et mélanger 10 fois par pipetage de haut en bas afin d’assurer un arrêt complet de la réaction de la digestion. Changer de conseils entre les rangs. À l’aide d’une pipette multicanaux, dans chaque ligne des échantillons MNase digéré, ajouter 6 µL de 10 x tampon de lyse et mélanger bien en pipettant également monter et descendre de 10 fois. Couvrir avec un sceau en plastique et laisser incuber sur la glace pendant 15 minutes. Pré-défrichage et séparation d’entrée Après l’incubation de 15 min, travaillant sur la glace, piscine tous les puits pour la même cellule pellet/template dans un stérile, préalablement réfrigérées sur glace, tube de 1,5 mL (préalablement marquées avec l’ID de modèle) et mélanger soigneusement, mais lentement à l’aide d’une pipette afin d’éviter le détergent moussant. Pour chaque cellule pellet/modèle, transfert 8 µL de chromatine digérée dans une nouvelle stérile, tube de 0,5 mL (préalablement marquées avec l’ID de modèle) et les conserver à 4 ° C durant la nuit. Cela servira de contrôle d’entrée. Distribuer le volume restant de la chromatine digérée dans 48 µL d’extraits, dans une nouvelle plaque de 96 puits. Pellet/modèle de cellule 1 va dans le puits A01-A06, cellule pellet/modèle 2 passe en puits A07-A12, etc.. Enregistrer les puits à une touche de modèle. Étiquette de la « Pré-défrichage ». À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 120 µL de 1 x IP Buffer + 1 x PIC et 12 µL de lavé billes magnétiques de protéine A (ou G) dans chaque puits de la plaque de compensation avant de l’étape 2.3.3. La composition de chaque ligne de pipetage et descendre de 10 fois. Changer de conseils entre les rangs. Sceller la plaque très bien avec un couvercle de plaque en aluminium et incuber sur une plate-forme tournante à 4 ° C pendant au moins 2 h. Réaction d’immunoprécipitation Avant de commencer cette étape Assurez-vous que les plaques de complexe Ab-perle (étape 2.1.10) et pré-défrichage (étape 2.3.4) ont incubé au moins 2 h. Quick spin deux plaques par centrifugation pendant 10 s à 200 x g. Placez la plaque complexe Ab-perle (de l’étape 2.1.10) sur un aimant plat et attendez 15 s pour la solution devienne claire. Soigneusement, enlever et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette sans déranger les perles. Retirez la plaque de l’aimant de la plaque et le garder sur la glace. Placez la plaque avant compensation (de l’étape 2.3.4) sur un aimant plat et attendez 15 s pour les perles séparer et pour la solution devienne claire. Sans déranger les perles, transvaser avec soin le surnageant à l’aide d’une pipette dans les puits correspondants du Ab-talon plaque complexe gardé sur glace et mélanger doucement 15 fois par pipetage de haut en bas. Joint de la plaque avec un aluminium plaque de couverture et incuber pendant la nuit (12-18 h) à 4 ° C sur une plate-forme tournante. Ré-étiqueter la plaque « Réaction de la propriété intellectuelle ». 3. jour 2 : ndCHIP-seq Lavages et élution La valeur de l’appareil de chauffage à 65 ° C. Sur la glace, préparer un tampon de lavage de faible teneur en sel et tampon de lavage de la forte teneur en sel. Rapide, faites tourner la plaque IP de réaction de l’étape 2.4.3 pour 10 s à 200 x g. Placer la plaque de réaction d’IP sur un aimant plat et attendre 15 s pour la solution devienne claire. À l’aide d’une pipette multicanaux, sans déranger les perles, soigneusement retirer et jeter le surnageant. Prenez la plaque de l’aimant de la plaque et placez-le sur la glace. Pour chaque ligne d’échantillons dans la plaque de réaction IP, ajouter 150 µL de faible teneur en sel glacee laver tampon et mélanger lentement 10 fois haut et bas pour complètement remettre en suspension les perles. Placer la plaque de réaction IP sur l’aimant de la plaque, attendez que les perles se séparer et à l’aide d’une pipette multicanaux, sans déranger les perles enlever et éliminer le surnageant. Replacez la plaque sur glace et répétez les étapes 3.1.3 et 3.1.4 pour un total de 2 lavages. Sur la glace, à chaque ligne d’échantillons dans la plaque de réaction IP, ajouter 150 µL du haut sel laver tampon et mélanger lentement 10 fois en pipettant également, haut et bas pour complètement remettre en suspension les perles. Placer la plaque de réaction IP sur l’aimant de la plaque, attendez que les perles se séparer et à l’aide d’une pipette multicanaux, sans déranger les perles enlever et éliminer le surnageant. Placer la plaque de réaction IP sur glace et réfrigérer avant une nouvelle plaque 96 puits à côté de lui. Pour chaque ligne d’échantillons dans la plaque de réaction IP, ajouter 150 µL du haut sel laver tampon et mélanger lentement 10 fois en pipettant également, haut et bas pour complètement remettre en suspension les perles. Après la remise en suspension, transfert chaque ligne des échantillons à la ligne correspondante de la plaque 96 puits, récente, préalablement réfrigérée. Étiquette de la « Réaction de la propriété intellectuelle ». Jeter la vieille plaque. Placez la nouvelle plaque de réaction IP sur l’aimant de la plaque et attendre les perles séparer. À l’aide d’une pipette multicanaux, sans déranger les perles, soigneusement retirer et jeter le surnageant. Maintenir la plaque à température ambiante. À chaque ligne d’échantillons dans la plaque de réaction IP, ajoutez 30 µL du tampon d’élution ChIP (EB) et mélangez lentement 10 fois par pipetage de haut en bas. Veillez à éviter la formation de bulles. Sceller la plaque avec une couverture PCR et incuber dans un mélangeur de chauffage à 65 ° C pendant 1,5 h avec une vitesse de mélange de 1 350 tr/min. Après une incubation de 1,5 h, faites tourner la plaque de réaction IP à 200 x g pendant 1 min à 4 ° C. Modifier le paramétrage de l’appareil de chauffage à 50 ° C. Le spin, placer la plaque de réaction d’IP sur un aimant plat et attendez que la solution effacer. À l’aide d’une pipette multicanaux, sans déranger les perles, Transvasez soigneusement 30 µL du liquide surnageant dans une nouvelle plaque de 96 puits. Utiliser des embouts de frais pour chaque ligne. Étiquette de la « Réaction de la propriété intellectuelle » et gardez-le à température ambiante. Digestion des protéines D’extraire 30 % PEG/1 M NaCl billes magnétiques17 (table de composition tampon) solution du réfrigérateur à 4 ° C et gardez-le à température ambiante pendant au moins 30 min. critique : s’assurer que la solution de perle atteigne pleinement la température ambiante avant de procéder. Récupérer des échantillons de contrôle d’entrée de 4 ° C, stockage (étape 2.3.2) et un essorage rapide. Mesurer le volume à l’aide d’une pipette et ajouter l’eau ultrapure à chaque contrôle d’entrée pour un volume final de 30 µL. transférer les échantillons de contrôle d’entrée dans les puits d’entrée présélectionnés (puits vides) dans la plaque de réaction de l’IP (étape 3.1.12). Le puits à l’exemple de clé d’enregistrement. Sur la glace, préparer le mélange de protéine Digestion Master comme indiqué dans le tableau 5 et volume égal aliquote dans une ligne d’une plaque 96 puits réservoir. À l’aide d’une pipette multicanaux, à chaque ligne d’échantillons dans la plaque de réaction IP, ajouter 40 µL de la protéine Digestion Master Mix et mélanger lentement 10 fois de haut en bas. Sceller la plaque avec une couverture PCR, tournez en bas à 200 x g pendant 1 min et incuber dans un mélangeur de chauffage à 50 ° C pendant 30 min à 650 tr/mn. Alors que la plaque est en incubation, préparer les frais 70 % éthanol (EtOH) et gardez-le à température ambiante. Après que l’incubation de 30 min est terminée, tourner la plaque de réaction IP à 200 x g pendant 1 min, 4 ° C. Maintenir la plaque à température ambiante.Remarque : Le volume total doit être maintenant ~ 70 µL/puits. Nettoyage perle à l’aide de la solution de billes magnétiques pour le PEG/1 M NaCl 30 % Perle de la température ambiante 30 % de PEG/1 M NaCl magnétique aliquote solution dans une ligne d’une plaque 96 puits propre réservoir (75 µL par exemple x Nbre de lignes). Travailler à température ambiante, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 70 µL (ratio 1:1) de la solution de billes magnétiques de PEG/1 M NaCl de 30 % à chaque ligne d’échantillons dans la plaque de réaction IP et mélanger 10 fois par pipetage de haut en bas. Changer de conseils entre les rangs. Incuber les plaques à température ambiante pendant 15 minutes. Placer la plaque sur l’aimant plat et incuber pendant 5 min permettre les perles se séparer. À l’aide d’une pipette, sans déranger les perles, soigneusement retirer et jeter le surnageant. Garder les perles. Alors que la plaque de réaction IP est toujours sur l’aimant de la plaque, à l’aide d’une pipette multicanaux, à chaque ligne d’échantillons, ajouter 150 µL de température ambiante 70 % EtOH et incuber pendant 30 s. Après 30 s, à l’aide d’une pipette multicanaux, retirer et jeter le surnageant. Répétez cette étape une fois de plus pour un total de 2 lavages. Après le deuxième lavage EtOH, incuber la plaque « à sec » sur l’aimant de la plaque pour 3 min. inspecter visuellement la plaque pour s’assurer que tous le EtOH se soit évaporée. Si ce n’est pas le cas, incuber la plaque pendant 1 min. séchage trop les résultats de perles à un rendement inférieur. Prendre la plaque de l’aimant de la plaque et à l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 35 µL EB (Table des matières). Mélangez bien en pipettant également 10 fois de haut en bas. Changer de conseils entre les rangs. Incuber à température ambiante pendant 3 min éluer. Après incubation, placer la plaque de réaction IP sur l’aimant de la plaque et incuber pendant 2 min. Les perles doivent séparer et la solution s’éclaircira. À l’aide d’une pipette multicanaux, sans déranger les perles, transvaser avec soin le surnageant dans les puits correspondants d’une nouvelle plaque de 96 puits. Sceller la plaque avec un couvercle de plaque en aluminium, étiqueter « IPed + entrée ADN » et stocker à 4 ° C durant la nuit, ou à-20 ° C à long terme (> 48 h) stockage. 4. jour 3 : Construction de la bibliothèque La phosphorylation et la réparation de la fin L’entrée pour la réaction de fin réparation/Phosphorylation est l’IPed + entrée plaque de l’étape 3.3.10. Après décongélation, tourner la plaque vers le bas à 200 x g pendant 1 min à 4 ° C et le maintenir sur la glace. Récupérer du congélateur-20 ° C tous les réactifs (à l’exception des enzymes) nécessaire pour la réaction de fin réparation/Phosphorylation (tableau 6) et les décongeler à température ambiante, puis transférer immédiatement à la glace. Travaillant sur la glace, suivre le tableau 6 de mettre en place la fin réparation/Phosphorylation Master Mix dans un tube de microtubes de 1,5 mL stérile. Après l’addition de tous les composants non-enzyme, mélanger bien au pouls-vortex et placer le tube de retour sur la glace. Récupérer les enzymes pertinentes de leur entreposage frigorifique et le transport sur le banc dans un portoir cool réfrigérée. Mélanger chaque enzyme en effleurant le tube, l’essorage rapide et placez-le dans le portoir cool réfrigérée. Lors du pipetage l’enzyme, aspirez lentement pour assurer un transfert de volume précis. Après l’addition, laver le bout en master mix de pipetage de haut en bas. Une fois que les enzymes sont ajoutées, doucement impulsion-vortex le master mix 5 fois afin d’assurer une répartition égale de tous les composants, puis essorage rapide et placez immédiatement le tube retour sur la glace. Sur la glace, partie aliquote un volume approprié de la fin réparation/Phosphorylation Master Mix dans une ligne d’une nouvelle plaque de 96 puits réservoir ; volume d’aliquotés : (15 µL x Nbre de lignes) + 5 µL volume mort. Un exemple de calcul pour deux rangées : (15 µL x 2) + 5 µL = 35 µL/puits. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 15 µL du mélange maître de réparation/Phosphorylation de fin pour chaque ligne d’échantillons et mélanger 10 fois par pipetage de haut en bas. Changer de conseils entre les rangs. Sceller la plaque avec un couvercle en plastique, tourner vers le bas à 200 x g pendant 1 min à 4 ° C et laisser incuber à température ambiante pendant 30 min. Perle nettoyage après réparation de la fin et la phosphorylation Du réfrigérateur à 4 ° C, récupérer la solution de billes magnétiques PEG/1 M NaCl à 20 % et 30 % PEG/1 M NaCl solution et laisser incuber à température ambiante pendant au moins 30 min.Remarque : La solution de NaCl M PEG/1 30 % n’est pas contiennent des billes magnétiques. Après que les deux solutions atteignent la température ambiante, pour chaque échantillon préparer 80 µL du mélange de 1:2 de 30 % de PEG/1 M NaCl et solutions de billes magnétiques pour le PEG/1 M NaCl 20 %. Un exemple pour 24 échantillons : 80 µL x 24 = 1 920 µL (640 µL de 30 % PEG/1 M NaCl et 1 288 µL des solutions de billes magnétiques pour le PEG/1 M NaCl 20 %). Aliquote la solution perle mélanger, volume égal, dans une ligne d’une plaque 96 puits réservoir et gardez-le à température ambiante. Tampon EB aliquote (40 µL par exemple x Nbre de lignes) dans une ligne d’une plaque 96 puits propre réservoir. Un exemple pour les deux lignes : 40 µL x 2 = 80 µL/puits. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 75 µL du mélange perle préparé dans l’étape 4.2.2 dans chaque ligne d’échantillons de l’étape 4.1.7 et mélanger et descendre de 10 fois. Changer de conseils entre les rangs. Incuber à température ambiante pendant 15 min. continuer avec la procédure de nettoyage des perles comme indiqué dans les étapes 3.3.3-3.3.10. Couvrir la plaque avec un sceau en plastique, essorage rapide et placez-le sur la glace. Passer au point 4.3. A-Tailing réaction Récupérer du congélateur-20 ° C tous les réactifs (à l’exception des enzymes) nécessaire pour la réaction de l’A-Tailing (tableau 7), les décongeler à température ambiante, puis transférer immédiatement à la glace. Travaillant sur la glace, suivre le tableau 7 de mettre en place le A-Tailing Master Mix dans un tube de microtubes de 1,5 mL stérile. Suivez les instructions de configuration de Broue enzymatique générales énoncées dans des mesures 4.1.4-4.1.6. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 15 µL de l’A-Tailing Master Mix à chaque ligne des échantillons et mélanger 10 fois par pipetage de haut en bas. Changer de conseils entre les rangs. Sceller la plaque avec une couverture PCR, tournez en bas à 200 x g pendant 1 min à 4 ° C et incuber dans un thermocycleur à 37 ° C pendant 30 min. Après l’incubation, tourner la plaque vers le bas à 200 x g pendant 1 min et gardez-le à température ambiante. Perle nettoyage après A-Tailing Suivez la procédure décrite à l’étape 4.2. Couvrir la plaque avec un sceau en plastique, essorage rapide étiquette « queue-A + BC, » et placez-le sur la glace. Passer au point 4.5. Ligature de l’adaptateur Récupérer du congélateur-20 ° C tous les réactifs (à l’exception des enzymes) nécessaires à la réaction de ligature de l’adaptateur (tableau 8), les décongeler à température ambiante, puis transférer immédiatement à la glace. Récupérer 10 µM PE adaptateur (Supplemental tableau1) solution-mère et diluer à 0,5 µM en EB. Mélangez bien au vortex de l’impulsion. Le volume nécessaire est 3 µL x Nbre d’échantillons. Travail sur la glace, aliquote l’adaptateur de 0,5 µM PE, à volume égal, dans 12 puits d’une plaque 96 puits propre réservoir. Gardez-le sur la glace. Travaillant sur la glace, suivre le tableau 8 pour configurer l’adaptateur ligature Master Mix dans un tube de microtubes de 1,5 mL stérile. Suivez les instructions de configuration de Broue enzymatique générales énoncées dans des mesures 4.1.4-4.1.6. Assurez-vous que le 5 X rapide ligature tampon est complètement décongelés et très bien mélangés avant utilisation. Sur la glace, partie aliquote un volume approprié de l’adaptateur ligature Master Mix dans une ligne d’une nouvelle plaque de 96 puits réservoir. Par exemple, le calcul pour deux rangées : (23 µL x 2) + 5 µL = 51 µL/puits. Maintenir la plaque sur la glace. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 2 µL de la 0,5 µM jumelé fin (PE) adaptateur dans chaque ligne des échantillons à l’étape 4.4.1 et mix. Changer de conseils entre les rangs. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 23 µL de l’adaptateur ligature Master Mix à chaque ligne des échantillons et mélanger 15 fois par pipetage de haut en bas. Changer de conseils entre les rangs. Sceller la plaque avec un couvercle en métal, étiquette « Ligature », centrifuger à 200 x g pendant 1 min à 4 ° C et incuber à température ambiante jusqu’au lendemain. Jour 4 : Perle nettoyage #1 après une ligature adaptateur Du réfrigérateur à 4 ° C, d’extraire la solution de billes magnétiques de PEG/1 M NaCl de 20 % et incuber à température ambiante pendant au moins 30 min. Alors que la solution est équilibration préparer fraîches 70 % EtOH. Partie aliquote de la solution de billes magnétiques de PEG/1 M NaCl de 20 %, 55 µL par exemple, dans une ligne d’un réservoir de 96 puits sur plaque et gardez-le à température ambiante. Un exemple pour les deux lignes : 55 µL x 2 = 110 µL/puits. Tampon EB aliquote, 50 µL par exemple, dans une ligne d’une plaque 96 puits propre réservoir. Un exemple pour les deux lignes : 50 µL x 2 = 100 µL/puits. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 48 µL de la solution de billes magnétiques de PEG/1 M NaCl de 20 % dans chaque ligne d’échantillons dans la plaque de la ligature de l’étape 4.5.6 et mélanger et descendre de 10 fois. Changer de conseils entre les rangs. Incuber à température ambiante pendant 15 min. continuer avec la procédure de nettoyage des perles comme indiqué dans les étapes 3.3.3-3.3.7. Prendre la plaque de l’aimant de la plaque et à l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 45 µL EB (Table des matières). Mélangez bien en pipettant également 10 fois de haut en bas. Changer de conseils entre les rangs. Incuber à température ambiante pendant 3 min éluer. Après incubation, placer la plaque de réaction IP sur l’aimant plat et incuber pendant 2 min. à l’aide d’une pipette multicanaux, sans déranger les perles, transvaser avec soin le surnageant dans les puits correspondants d’une nouvelle plaque de 96 puits. L’étiquette de la plaque « Ligature + 1 BC ». Dans chaque puits ajouter 5 µL de tampon de haute fidélité x PCR 10 et bien mélanger en pipetage de haut en bas. Changer de conseils entre les rangs. Couvrir la plaque avec un sceau en plastique, essorage rapide et gardez-le à température ambiante. Perle nettoyage #2 après une ligature adaptateur Exécuter un nettoyage perle comme décrit dans section 4.6, avec les modifications suivantes : ajouter 60 µL de solution de billes magnétiques de PEG/1 M NaCl de 20 % dans chaque puits active dans la ligature + 13:00 plaque (étape 4.6.7) et éluer depuis les perles avec 35 µL de tampon EB. Étiquette de la « Ligature + 2 BC » et le maintenir sur la glace. Amplification par PCR Récupérer du congélateur-20 ° C tous les réactifs (à l’exception des enzymes) nécessaires pour la réaction PCR (tableau 9), les décongeler à température ambiante puis les placer immédiatement sur la glace. Travaillant sur la glace, suivre le tableau 9 de mettre en place le Master PCR Mix dans un tube de microtubes de 1,5 mL stérile. Suivez les instructions d’installation de brassage général comme indiqué dans les étapes 4.1.4-4.1.5. Sur la glace, partie aliquote un volume approprié de PCR Master Mix dans une ligne d’une nouvelle plaque de 96 puits réservoir. Gardez-le sur la glace. Voir l’étape 4.5.4 pour exemples de calcul. Travail sur la glace, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 2 µL de chaque unique 12,5 µM PCR inverse indexation apprêt (2 Table supplémentaire) dans chaque puits dans la ligature + plaque 2 BC (étape 4.7.1) et mélanger doucement de haut en bas. Changer de conseils entre les rangs. Maintenir la plaque sur la glace. Travail sur la glace, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 23 µL du mélange maître PCR dans chaque ligne des échantillons à l’étape 4.8.3 et mix 10 fois par pipetage de haut en bas. Sceller la plaque avec une couverture PCR, pivoter vers le bas à 200 x g pendant 1 min et incuber dans un thermocycleur (voir tableau 10 pour vélo conditions d’amplification). Perle nettoyage après amplification par PCR Après amplification par PCR, tourner la plaque à 200 x g pendant 1 min, 4 ° C. Effectuer le nettoyage perle comme décrit dans section 4.6, avec les modifications suivantes : Ajouter 51 µL de solution de billes magnétiques PEG/1 M NaCl à 20 % à chaque réaction de PCR et éluer depuis les perles avec 25 µL de tampon EB. Sceller la plaque avec un couvercle en aluminium et tournez en bas à x 200 g pour 1 min. magasin les échantillons à-20 ° C. Pour valider les bibliothèques construites, effectuer la quantification de l’ADN à l’aide d’un test d’amplification par fluorescence, visualiser le produit final avec un analyseur de puce l’électrophorèse capillaire (essai de sensibilité élevée) et exécutez enrichissement PCR quantitative (qPCR) (voir Représentant des résultats, Validation de la qualité de bibliothèque ndChIP-seq par qPCR).