Obs: Minsta ingång för detta protokoll är 10 000 celler per enskild immuno-nederbörd (IP) reaktion. Skriva ut kalkylbladet medföljande experimentella och använda som riktlinje att planera ut experimentet. Inkubationer rumstemperatur antas vara vid ~ 22 ° C. Alla buffert recept finns i tabell 1. Alla buffertar bör lagras vid 4 ° C och hålls på is under förfarandet, om inte annat anges. 1. cell förberedelse Odlade celler Tvätta cellerna med 1 mL av fosfat buffert saltlösning (PBS) och noggrant bestämma cellkoncentrationen använder en hemocytometer. Om det finns mer än en miljon celler, öka volymen av PBS. Baserat på celltalet, alikvotens en motsvarighet till 70,000-100,000 celler i en steril 1,5 mL tub, och varva ner på 500 x g under 6 minuter vid 4 ° C. Med pipett långsamt bort och kasta bort supernatanten (utan störande cellpelleten) och återsuspendera pelleten i iskall lyseringsbuffert + 1 x cocktail proteashämmare (PIC) till en koncentration av 1 000 celler / µL. Blanda väl genom pipettering upp och ner 20-30 gånger. Det är viktigt att cellen klumpar störs. Försök inte att skapa bubblor. Gå direkt till dag 1 (avsnitt 2) i protokollet om ndChIP-seq eller flash frysa cellpelleten i flytande kväve och förvaras vid-80 ° C. Sorterade celler Samla in 70,000-100,000 sorterade16 celler i ett 1,5 mL rör med 350 µL av Hanks buffrad saltlösning (HBSS), eller PBS + 2% fetalt bovint serum (FBS). Snurra ner varje cell delmängd vid 500 x g under 6 minuter vid 4 ° C. Med pipett långsamt bort supernatanten (utan störande cellpelleten) och återsuspendera i iskall lyseringsbuffert + 1 x PIC till en slutlig koncentration på 1 000 celler / µL. Blanda väl i lyseringsbuffert genom pipettering upp och ner 20 – 30 gånger. Se till att cell klumpar störs. Försök inte att skapa bubblor. Gå direkt till dag 1 (avsnitt 2) i protokollet om ndChIP-seq eller flash frysa cellpelleten i flytande kväve och förvaras vid-80 ° C. 2. dag 1: ndChIP-seq Beredning av antikropp-pärla anläggningen Förbered ett vattenbad på 37 ° C och en ishink. Arbetar på is, förbereda 1 x IP buffert/1 x PIC och 1 x antikropp (Ab) förtunningsbuffert, och hålla dem på isen. Hämta Protein A (eller G) magnetiska pärlor (se diskussion för urvalskriterier) från 4 ° C lagring och blanda mycket väl med mild puls-vortexa. Håll det på is.Obs: Puls-vortexa innebär vortexa stoppas varje gång en full vortex bildas i röret. Över 24 µL av Protein A (eller G) magnetiska pärlor per IP reaktion till en ny 2 mL tub. Spela in volymen av pärlor och hålla röret på is. För exempel, för 7 IPs, Använd 24 µL x 7 = 168 µL. Placera röret på tube magneten och vänta för att lösningen skall bli tydligt indikerande pärla separation. Utan att störa pärlorna, noggrant avlägsna supernatanten med pipett och kassera. Ta tunnelbanan utanför tube magneten och placera den på is. Lägg till en lika stor volym (dvs, Ursprunglig volym av pärlor) iskall IP buffert + 1 x PIC mix. Blanda genom pipettering upp och ner. Gör inte vortex. Placera den IP buffert + 1 x PIC + pärlor rygg onto tube magneten och vänta för att lösningen skall bli tydligt indikerande pärla separation. Utan att störa pärlorna, noggrant avlägsna supernatanten med pipett och kassera. Upprepa kalla IP buffert + 1 X PIC tvätta två gånger för totalt 3 tvättar. Efter den sista tvättningen, resuspendera pärlor i en lika stor volym (dvs, Ursprunglig volym av pärlor) iskall IP buffert + 1 x PIC mix. Blanda genom pipettering upp och ner. Gör inte vortex. Håll röret på is. Häll 10 mL av IP-buffert + PIC i en 25 mL V-formade reservoar på is. Med hjälp av en flerkanalspipett, Lägg till 130 µL av iskall IP buffert + 1 x PIC mix i enskilda brunnar i en blandningskopp V-botten 96-plattan. Fyll en väl per IP. Etikett på plattan som ”Ab-pärla komplex”. Lägg 12 µL av den tvättade Protein A (eller G) magnetiska pärlor i varje brunn innehållande IP buffert + PIC och blanda genom pipettering upp och ner. Håll återstående tvättade pärlorna på is. Få validerade antikroppar från deras kyllagring och Tina på is, om det behövs. Arbetar på is, späd antikroppar med 1 x Ab förtunningsbuffert till de koncentrationer som anges i tabell 2. Till varje brunn Ab-pärla komplexa plattan, tillsätt 1 µL av lämpliga, utspädda antikroppen (tabell 1). Spela in brunnen för att nyckeln antikropp. Med hjälp av flerkanalspipett, blanda varje rad genom pipettering upp och ner 20 gånger. Ändra tips mellan raderna. Försegla Ab-pärla komplexa plattan mycket väl med en aluminium plattan täcker och inkubera vid 4 ° C på en roterande plattform för minst 2 h.Obs: Denna inkubation kan fortsätta tills det att starta steg 2,4. Cell lysis och kromatin matsmältningen Arbetar på is, förbereda 1 x lyseringsbuffert + 1 x PIC och 1 mL MNase jag utspädning buffert (tabell 3) och hålla dem på isen. Hämta cell pellets från-80 ° C lagring (eller is, om nyberedd). Tina varje cellpelleten i 37 ° C vattenbad för en 10 s, då överföring till is. Till varje cellpelleten omedelbart lägga iskall 1 x lyseringsbuffert + 1 x PIC till en slutlig koncentration på 10 000 celler/20 µL och mix 10 gånger av pipettering upp och ned, utan att skapa bubblor. För 70.000 celler är exempelvis den slutliga volymen 140 µL. Arbetar på is, alikvotens 20 µL per brunn av den resulterande lysates till en plattan med 96 brunnar. Täcka plattan med en plast tätning och inkubera på is för 20 min. etikett plattan ”MNase matsmältningen” och registrera brunnarna till en mall. För att säkerställa en exakt tidpunkt för kromatin matsmältningen reaktionen, Fortsätt inte att rötning med mer än 2 rader av prover på en gång. Strax innan 20 min Lys är komplett, späd MNase jag enzym med MNase jag utspädning buffert, till en slutlig koncentration av 20 U/µL, och hålla det på is. Arbetar på is, förbereda MNase jag matsmältningen master mix enligt tabell 4 och alikvotens 20 µL av blandningen per varje rad prover plus 5 µL död volym i en rad av en platta med 96 brunnar reservoar och hålla det på is. För två rader, volymen bör vara: (20 µL x 2) + 5 µL = 45 µL. Efter lysates avsluta ruvning, avlägsna MNase matsmältningen plattan från isen. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 20 µL av MNase jag matsmältningen master mix i varje rad av prover och blanda 10 gånger genom pipettering upp och ner. Ändra tips mellan raderna. Odla i rumstemperatur för exakt 5 min. Efter 5 min, stoppa reaktionen, Använd en flerkanalspipett att lägga till 6 µL av 250 µM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) i varje rad av prover och mixa upp och ner några gånger. Ändra tips mellan raderna. Efter EDTA dessutom växla inställningen av pipetten till 20 µL och mix 10 gånger genom pipettering upp och ner för att säkerställa ett fullständigt stopp för matsmältningen reaktion. Ändra tips mellan raderna. Med hjälp av en flerkanalspipett, till varje rad i MNase rötas proverna, tillsätt 6 µL 10 x lyseringsbuffert och blanda väl genom pipettering upp och ner 10 gånger. Täcka med plast sigill och inkubera på is i 15 min. Ingående separation och före röjning Efter 15 min ruvning, arbetar på isen, pool alla brunnar för samma cell pellets/mall i en steril, pre kyld på is, 1,5 mL tub (pre märkt med mall-ID) och blanda grundligt men långsamt med pipett till Undvik tvättmedel. För varje cell pellets/mall, över 8 µL av smält kromatin i en ny steril, 0,5 mL rör (pre märkt med mall-ID) och förvaras vid 4 ° C över natten. Detta kommer att fungera som ingående kontroll. Fördela den resterande volymen av smält kromatinet i 48 µL portioner i en nya plattan med 96 brunnar. Cell pellets/mall 1 går i brunnar A01-A06, cell pellets/mall 2 går in i brunnar A07-A12, etc. Spela in brunnarna till en mall. Etikett på plattan ”före röjning”. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 120 µL 1 x IP buffert + 1 x PIC och 12 µL av tvättade Protein A (eller G) magnetiska pärlor i varje brunn före röjningen plattan från steg 2.3.3. Blanda varje rad genom pipettering upp och ner 10 gånger. Ändra tips mellan raderna. Försegla plattan mycket väl med en aluminium plattan täcker och inkubera i en roterande plattform vid 4 ° C i minst 2 h. Immunoprecipitation reaktion Innan du börjar detta steg se till att den Ab-pärla komplexa (steg 2.1.10) och den före röjningen plåten (steg 2.3.4) har inkuberas för minst 2 h. Quick snurra båda plattorna genom centrifugering för 10 s vid 200 x g. Placera Ab-pärla komplexa plattan (från steg 2.1.10) på en tallrik magnet och vänta 15 s för att lösningen skall bli klart. Försiktigt bort och kasta bort supernatanten med pipett utan att störa pärlorna. Avlägsna plattan från plattan magneten och hålla det på is. Placera före röjningen reaktion plattan (från steg 2.3.4) på en tallrik magnet och vänta 15 s för pärlor för att separera och för att lösningen skall bli klart. Utan att störa pärlorna, noggrant överför supernatanten med pipett till de motsvarande brunnarna i Ab-pärla komplexa plattan förvaras på is och blanda försiktigt 15 gånger av pipettering upp och ner. Seal plattan väl med en aluminium pläterar locket och inkubera över natten (12-18 h) vid 4 ° C på en roterande plattform. Märka plattan ”IP reaktion”. 3. dag 2: ndCHIP-seq Tvättar och eluering Ställ in värme mixern till 65 ° C. På isen, förbereda en låg salthalt tvättbuffert och hög salthalt tvättbuffert. Snabb snurra IP reaktion plattan från steg 2.4.3 för 10 s vid 200 x g. Placera IP reaktion plattan på en tallrik magnet och vänta 15 s för att lösningen skall bli klart. Med hjälp av en flerkanalspipett, utan att störa pärlorna, noggrant avlägsna och Kassera supernatanten. Ta plattan utanför plattan magneten och placera den på is. Varje rad av prover i IP-reaktion plattan, tillsätt 150 µL av iskall låg salthalt tvätta buffert och blanda långsamt 10 gånger upp och ner för att fullt Omsuspendera pärlorna. Placera IP reaktion plattan tillbaka på plattan magneten, vänta på pärlor för att separera och med hjälp av en flerkanalspipett, utan att störa pärlorna avlägsna och Kassera supernatanten. Placera plattan tillbaka på isen och upprepa steg 3.1.3 och 3.1.4 för sammanlagt 2 tvättar. På isen, till varje rad av prover i IP-reaktion plattan, lägga 150 µL av hög salt tvätta buffert och blanda långsamt 10 gånger genom pipettering upp och ner för att fullt Omsuspendera pärlorna. Placera IP reaktion plattan tillbaka på plattan magneten, vänta på pärlor för att separera och med hjälp av en flerkanalspipett, utan att störa pärlorna avlägsna och Kassera supernatanten. Placera plattan IP reaktion på is och pre chill en nya plattan med 96 brunnar bredvid den. Varje rad av prover i IP-reaktion plattan, tillsätt 150 µL av hög salt tvätta buffert och blanda långsamt 10 gånger genom pipettering upp och ner för att fullt Omsuspendera pärlorna. Efter resuspension, överföra varje rad av prover till motsvarande rad av nya, pre kylda, 96 brunnar plattan. Etikett på plattan ”IP reaktion”. Kassera den gamla plattan. Placera den nya IP-reaktion plattan på plattan magneten och vänta på pärlor för att separera. Med hjälp av en flerkanalspipett, utan att störa pärlorna, noggrant avlägsna och Kassera supernatanten. Förvara plattan i rumstemperatur. Till varje rad av prover i IP-reaktion plattan, tillsätt 30 µL av ChIP eluering bufferten (EB) och blanda långsamt 10 gånger genom pipettering upp och ner. Se till att förhindra bubbla bildandet. Försegla plattan väl med en PCR-cover och inkubera i en värme mixer vid 65 ° C för 1,5 h med en blandande fart av 1 350 rpm. Efter 1,5 h inkubation, snurra ner IP reaktion plattan vid 200 x g för 1 min vid 4 ° C. Ändra inställningen för uppvärmning mixern till 50 ° C. Efter spin, placera IP reaktion plattan på en tallrik magnet och vänta på lösningen att rensa. Med hjälp av en flerkanalspipett, utan att störa pärlorna, noggrant över 30 µL av supernatanten till en nya plattan med 96 brunnar. Använd färska tips för varje rad. Etikett på plattan ”IP reaktion” och förvara det i rumstemperatur. Protein matsmältningen Hämta 30% PEG/1 M NaCl magnetiska pärla17 (buffert sammansättning tabell) lösning från 4 ° C kylskåpet och förvara det i rumstemperatur i minst 30 min. kritisk: se till att pärla lösningen fullt når rumstemperatur innan du fortsätter. Hämta Inspelningsvolym prover från 4 ° C lagring (steg 2.3.2) och snabb spinn. Mäta volymen med hjälp av en pipett och tillsätt ultrarent vatten till varje Inspelningsvolym för en slutlig volym av 30 µL. överföra Inspelningsvolym proverna till förvalda ingående brunnarna (tomma brunnar) i IP-reaktion plattan (steg 3.1.12). Spela in brunnen till prov nyckel. På isen, förbereda Protein matsmältningen Master Mix som visas i tabell 5 och alikvotens lika volym i en rad av en platta med 96 brunnar reservoar. Med hjälp av en flerkanalspipett, till varje rad av prover i IP-reaktion plattan, tillsätt 40 µL av Protein matsmältningen Master Mix och blanda långsamt 10 gånger upp och ner. Försegla plattan väl med en PCR-cover, snurra ner vid 200 x g i 1 min och inkubera i en värme mixer vid 50 ° C i 30 min på 650 rpm. Medan plattan ruvning, förbereda färska 70% etanol (EtOH) och förvara det i rumstemperatur. Efter 30 min ruvning är komplett, snurra IP reaktion plattan vid 200 x g i 1 min, 4 ° C. Förvara plattan i rumstemperatur.Obs: Den totala volymen bör nu ~ 70 µL per brunn. Bead ren-upp med 30% PEG/1 M NaCl magnetiska pärla lösning Alikvotens rumstemperatur 30% av PEG/1 M NaCl magnetiska bead lösning i en rad med en ren 96 brunnar reservoar tallrik (75 µL per prov x antal rader). Arbetar vid rumstemperatur, med hjälp av en flerkanalspipett, lägga till 70 µL (1:1 ratio) 30% PEG/1 M NaCl magnetiska pärla lösningen i varje rad av prover i IP-reaktion plattan och blanda 10 gånger genom pipettering upp och ner. Ändra tips mellan raderna. Inkubera plattan för 15 min i rumstemperatur. Placera plattan på plattan magneten och inkubera i 5 min att tillåta pärlor för att separera. Med pipett, utan att störa pärlorna försiktigt avlägsna och Kassera supernatanten. Förvara pärlorna. Medan IP-reaktion plattan är fortfarande på plattan magneten, med hjälp av en flerkanalspipett, till varje rad av prover, tillsätt 150 µL av rumstemperatur 70% EtOH och inkubera i 30 s. Efter 30 s, med hjälp av en flerkanalspipett, avlägsna och Kassera supernatanten. Upprepa detta en gång för sammanlagt 2 tvättar. Efter den andra EtOH tvättningen, inkubera plattan magneten ‘torra’ plattan för 3 min. okulärbesiktiga plattan att se till att alla EtOH indunstas. Om så inte är fallet, inkubera plattan för 1 min. uttorkning pärlor resultaten i en lägre avkastning. Ta plattan utanför plattan magneten och med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 35 µL EB (Tabell för material). Blanda väl genom pipettering 10 gånger upp och ner. Ändra tips mellan raderna. Odla i rumstemperatur i 3 min till eluera. Efter inkubation, placera IP reaktion plattan tillbaka på plattan magneten och inkubera i 2 min. Pärlorna ska separera och lösningen blir klart. Med hjälp av en flerkanalspipett, utan att störa pärlorna, noggrant över supernatanten i motsvarande brunnar av en nya plattan med 96 brunnar. Försegla plattan med en aluminium plattan täcker, etikett ”IPed + Input DNA” och förvaras vid 4 ° C över natten, eller vid-20 ° C för långsiktig (> 48 h) lagring. 4. dag 3: Bibliotek konstruktion Slutet reparation och fosforylering Ingång för slutet reparation/fosforylering reaktionen är IPed + ingång plattan från steg 3.3.10. Efter upptining, snurra plattan ner vid 200 x g för 1 minuter vid 4 ° C och hålla det på is. Hämta från-20 ° C frys alla reagenser (utom enzymer) krävs för slutet reparation/fosforylering reaktionen (tabell 6) och Tina dem i rumstemperatur och sedan omedelbart överföra för att is. Arbetar på is, följ tabell 6 ställa in slutet reparation/fosforylering Master Mix i ett sterilt, 1,5 mL mikrocentrifug rör. Efter tillägg av alla icke-enzym komponenter, blanda väl genom puls-vortexa och placera röret tillbaka på is. Hämta de relevanta enzymerna från deras kall förvaring och transport till bänken i ett kylt tube cool rack. Blanda varje enzym genom att snärta den tube, snabb spinn och placera den tillbaka i kylda tube cool rack. När pipettering enzymet, aspirera långsamt för att säkerställa en korrekt volym överföring. Efter tillägg, skölj spetsen i huvudmixen genom pipettering upp och ner. När enzymer tillsätts, tillbaka försiktigt puls-vortex master mix 5 gånger att garantera en jämn fördelning av alla komponenter och sedan snabb spinn och placera röret omedelbart på is. På isen, alikvot en lämplig volym av slutet reparation/fosforylering Master Mix till en rad nya platta som 96 brunnar reservoar; volymen ska vara aliquoted: (15 µL x # rader) + 5 µL dödvolym. Ett beräkningsexempel för två rader: (15 µL x 2) + 5 µL = 35 µL per brunn. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 15 µL slutet reparation/fosforylering Master Mix i varje rad av prover och blanda 10 gånger genom pipettering upp och ner. Ändra tips mellan raderna. Försegla plattan med en plastkåpa, snurra ner vid 200 x g för 1 minuter vid 4 ° C och odla i rumstemperatur i 30 min. Bead sanering efter slutet reparation och fosforylering Från 4 ° C kylskåp, Hämta 20% PEG/1 M NaCl magnetiska pärla lösning och 30% PEG/1 M NaCl-lösning och odla i rumstemperatur i minst 30 min.Obs: De 30% PEG/1 M NaCl-lösningen inte innehåller magnetiska pärlor. När båda lösningarna rumstemperatur, för varje prov förbereda 80 µL av 1:2 blandning av 30% PEG/1 M NaCl och 20% PEG/1 M NaCl magnetiska pärla lösningar. Ett exempel för 24 prov: 80 µL x 24 = 1,920 µL (640 µL av 30% PEG/1 M NaCl och 1 288 µL 20% PEG/1 M NaCl magnetiska pärla lösningar). Alikvotens pärla lösningen blanda, lika volym, i en rad av en platta med 96 brunnar reservoar och förvara det i rumstemperatur. Alikvotens EB buffert (40 µL per prov x # rader) i en rad med en ren 96 brunnar reservoar tallrik. Ett exempel på två rader: 40 µL x 2 = 80 µL per brunn. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 75 µL pärla mix beredd i Stig 4.2.2 in i varje rad av prover från steg 4.1.7 och blanda upp och ner 10 gånger. Ändra tips mellan raderna. Odla i rumstemperatur i 15 min. Fortsätt med pärla sanering förfarande som beskrivs i steg 3.3.3-3.3.10. Täcka plattan med en plast tätning, snabb spinn och placera den på is. Fortsätt till steg 4,3. A-Tailing reaktion Hämta från-20 ° C frysen alla reagenser (utom enzymer) som krävs för A-Tailing reaktionen (tabell 7), Tina dem i rumstemperatur och sedan omedelbart överföra för att is. Arbetar på is, följ tabell 7 att ställa in A-Tailing Master Mix i ett sterilt, 1,5 mL mikrocentrifug rör. Följ instruktionerna allmänna enzymatisk brew setup som beskrivs i steg 4.1.4-4.1.6. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 15 µL A-Tailing Master Mix i varje rad av prover och blanda 10 gånger genom pipettering upp och ner. Ändra tips mellan raderna. Försegla plattan med en PCR-cover, snurra ner vid 200 x g för 1 minuter vid 4 ° C och inkubera i en termocykler vid 37 ° C i 30 min. Efter inkubering, snurra plattan ner vid 200 x g i 1 min och förvara det i rumstemperatur. Bead sanering efter A-Tailing Utföra stegen som beskrivs i steg 4,2. Täcka plattan med en plast tätning, etikett ”A-tail + BC”, snabb spinn, och placera den på is. Fortsätt till steg 4,5. Adapter ligatur Hämta från-20 ° C frysen alla reagenser (utom enzymer) krävs för adapter ligering reaktionen (tabell 8), Tina dem i rumstemperatur och sedan omedelbart överföra för att is. Hämta 10 µM PE adaptern (kompletterande Tabell1) stamlösning och späd till 0,5 µM med EB. Blanda väl genom puls vortexa. Den volym som krävs är 3 µL x # av prover. Arbetar på is, alikvotens 0,5 µM PE adaptern, lika volym, i 12 brunnar ren 96 brunnar reservoar platta. Håll det på is. Arbetar på is, följ tabell 8 ställa in Adapter Ligation Master Mix i ett sterilt, 1,5 mL mikrocentrifug rör. Följ instruktionerna allmänna enzymatisk brew setup som beskrivs i steg 4.1.4-4.1.6. Kontrollera att 5 X snabb Ligation buffert är helt tinade och mycket väl blandas före användning. På isen, alikvot en lämplig volym av Adapter Ligation Master Mix till en rad nya platta som 96 brunnar reservoar. Exempelvis beräkning för två rader: (23 µL x 2) + 5 µL = 51 µL per brunn. Hålla plattan på is. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 2 µL av den 0,5 µM ihopkopplade slutet (PE) adaptern i varje rad av prover från steg 4.4.1 och mix. Ändra tips mellan raderna. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 23 µL Adapter Ligation Master Mix i varje rad av prover och blanda 15 gånger genom pipettering upp och ner. Ändra tips mellan raderna. Försegla plattan med en metall täcka, etikett ”Ligation”, varva ner på 200 x g för 1 min vid 4 ° C, och odla i rumstemperatur över natten. Dag 4: Bead sanering #1 efter adapter ligatur Från 4 ° C kylskåp, hämta den magnetiska pärla 20% PEG/1 M NaCl-lösningen och odla i rumstemperatur i minst 30 min. Medan lösningen equilibrating förbereda färska 70% EtOH. Alikvot 20% PEG/1 M NaCl magnetiska pärla lösningen, 55 µL per prov, i en rad av en 96 brunnar reservoar tallrik och förvara det i rumstemperatur. Ett exempel på två rader: 55 µL x 2 = 110 µL per brunn. Alikvotens EB buffert, 50 µL per prov, i en rad med en ren 96 brunnar reservoar tallrik. Ett exempel på två rader: 50 µL x 2 = 100 µL per brunn. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 48 µL av 20% PEG/1 M NaCl magnetiska pärla lösningen i varje rad av prover i ligatur plattan från steg 4.5.6 och blanda upp och ner 10 gånger. Ändra tips mellan raderna. Odla i rumstemperatur i 15 min. Fortsätt med pärla sanering förfarande som beskrivs i steg 3.3.3-3.3.7. Ta plattan utanför plattan magneten och med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 45 µL EB (Tabell för material). Blanda väl genom pipettering 10 gånger upp och ner. Ändra tips mellan raderna. Inkubera i rumstemperatur i 3 min till eluera. Efter inkubation, placera IP reaktion plattan tillbaka på plattan magneten och inkubera i 2 min. med hjälp av en flerkanalspipett, utan att störa pärlorna, noggrant överför supernatanten i motsvarande brunnar av en nya plattan med 96 brunnar. Etikett på plattan ”ligering + 1 BC”. Till varje brunn Tillsätt 5 µL 10 x PCR HiFi buffert och blanda väl genom pipettering upp och ner. Ändra tips mellan raderna. Täcka plattan med en plast tätning, snabb spinn, och förvara det i rumstemperatur. Bead sanering #2 efter adapter ligatur Utför sanering i pärla som beskrivs i avsnitt 4.6 med följande ändringar: Tillsätt 60 µL 20% PEG/1 M NaCl magnetiska pärla lösningen för varje aktiv brunn i ligering + 1 BC plattan (steg 4.6.7) och eluera från pärlorna med 35 µL av EB buffert. Etikett på plattan ”ligering + 2 f.Kr”. och hålla den på is. PCR-amplifiering Hämta från-20 ° C frysen alla reagenser (utom enzymer) krävs för PCR-reaktionen (tabell 9), Tina dem i rumstemperatur och sedan placera dem omedelbart på is. Arbetar på is, följ tabell 9 konfigurera PCR Master Mix i ett sterilt, 1,5 mL mikrocentrifug rör. Följ instruktionerna allmänna brygga set-up som beskrivs i steg 4.1.4-4.1.5. På isen, alikvot en lämplig volym av PCR-Master Mix till en rad nya platta som 96 brunnar reservoar. Håll det på is. Se punkt 4.5.4 för prov beräkningar. Arbetar på isen, med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 2 µL av varje unik 12,5 µM PCR omvänd indexering primer (kompletterande tabell2) till varje brunn i ligering + 2 f.kr plattan (steg 4.7.1) och blanda långsamt upp och ner. Ändra tips mellan raderna. Hålla plattan på is. Arbeta på isen, med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 23 µL av PCR huvudmixen i varje rad av prover från steg 4.8.3 och mix 10 gånger av pipettering upp och ner. Försegla plattan med en PCR-cover, snurra den ner vid 200 x g i 1 min och inkubera i en termocykler (se tabell 10 för PCR-cykling villkor). Bead sanering efter PCR-amplifiering Efter PCR-amplifiering snurra plattan vid 200 x g i 1 min, 4 ° C. Utför pärla saneringen som beskrivs i avsnitt 4.6 med följande ändringar: Lägg 51 µL 20% PEG/1 M NaCl magnetiska pärla lösning till varje PCR-reaktion och eluera från pärlorna med 25 µL av EB buffert. Försegla plattan med en aluminium locket och snurra ner vid 200 x g för 1 min. Store proverna vid-20 ° C. För att validera Byggyta bibliotek, utföra DNA kvantifiering med en fluorescens-baserad analys, visualisera den slutliga produkten med hjälp av ett chip-baserade kapillärelektrofores analyzer (hög känslighet analys) och köra anrikning kvantitativ PCR (qPCR) (se Representativa resultat, validering av ndChIP-seq bibliotek kvalitet av qPCR).