Summary
Mange proteiner i cellen fornemme og fremkalde membran krumning. Vi beskriver en metode til at trække membran nanorør fra lipid vesikler til at studere samspillet mellem proteiner eller eventuelle krumning-aktive molekyle med buede membraner in vitro.
Abstract
Omdannelsen af cellemembranen er en integreret del af mange cellulære fænomener, såsom endocytose, menneskehandel, dannelsen af filopodia, osv. Mange forskellige proteiner associere med buede membraner på grund af deres evne til at fornemme eller fremkalde membran krumning. Typisk, disse processer indebærer en lang række proteiner, hvilket gør dem alt for kompleks til at studere kvantitativt i cellen. Vi beskriver en protokol for at rekonstruere en buet membran i vitro, efterligne en buet cellestruktur, såsom endocytic halsen. En kæmpe unilamellar vesikel (GUV) bruges som en model af en cellemembran, hvis indre pres og overfladespænding styres med mikropipette aspiration. Anvende en punkt trækkraft på GUV ved hjælp af optiske tweezers skaber et nanorør høj krumningsradius tilsluttet en flad membran. Denne metode har traditionelt været brugt til at måle de grundlæggende mekaniske egenskaber af lipid membraner, såsom bøjning stivhed. I de seneste år, er det blevet udvidet for at studere, hvordan proteiner interagerer med membran krumning og den måde de påvirker figuren og mekanik af membraner. Et system, der kombinerer micromanipulation, mikroinjektion, Optisk pincet og konfokal mikroskopi tillader måling af membran krumning, membran spændinger og overflade tætheden af proteiner, samtidigt. Fra disse målinger, kan mange vigtige mekaniske og morfologiske egenskaber af protein-membran system udledes. Desuden lå vi ud en protokol for at skabe GUVs fysiologiske saltkoncentration, og en metode til kvantificering af den overflade tæthed af proteiner på en membran fra fluorescens intensiteter af mærket proteiner og lipider.
Introduction
Mange cellulære processer, såsom endocytose, menneskehandel, dannelsen af filopodia, infektion, osv., er ledsaget af en dramatisk ændring i form af cellemembraner1,2. I cellen deltager en række proteiner i disse processer ved at binde sig til membranen og ændre deres form. De mest bemærkelsesværdige eksempler er medlemmer af familien Bin/Amphiphysin/autocampere (BAR) protein, der indeholder en karakteristisk uløseligt buet BAR domæne3,4,5,6,7. Typisk, de interagerer med membranen ved at tilslutte domænet BAR til overfladen, og i mange tilfælde også grundt indsætte amphipathic helices i tolagede. Form, størrelse og beregning af domænet BAR sammen med antallet af amphipathic helices bestemmer: (1) i retning af membran krumning (dvs., om de vil fremkalde invaginations eller fremspring), og (2) omfanget af membran krumning5,8. Af note, er positiv krumning her defineret som den konvekse side af den buede membran, dvs, bule mod de interagerende partikel, og negative ellers. Desuden kvantitative undersøgelser af BAR proteiner afsløret, at deres virkning på membranen afhænger af en række fysiske parametre: overflade tæthed af proteiner, membran spændinger og membran form (flad versus rørformede versus sfæriske figur)7. Afhængigt af disse parametre BAR proteiner kan: (1) fungerer som sensorer af membran krumning, (2) bøje membraner, eller (3) fremkalde membran virksomhedsdeling7.
På grund af det store antal af involverede i membranen omformningen i cellen, at studere de kvantitative aspekter af fænomener, såsom endocytose komponenter, er i vivo ekstremt udfordrende. In vitro rekonstituering af minimal komponenter efterligne buede membraner i cellen giver mulighed for at få en mekanistisk forståelse af hvordan membran-buede proteiner fungere. I denne artikel beskrives en protokol for at rekonstruere en membran nanorør in vitro- ved hjælp af micromanipulation, Fluorescens mikroskopi og optiske pincet. Metoden kan bruges til at studere i en kvantitativ måde, hvordan proteiner, lipider, eller små molekyler interagere med buede membraner. Lipid GUVs bruges som modeller af en cellemembran, hvis krumning er ubetydelig i forhold til størrelsen af interagerende membran-buede molekyler. De er tilberedt ved hjælp af electroformation metoden9 hvor vesikler er dannet af hydrating en lipid film og hævelse i GUVs under en vekselstrøm (AC)10. Mest almindelige substrater som GUVs dyrkes er enten semi-ledende plader overtrukket med indium tin oxid (ITO) eller platinum ledninger (Pt-ledninger)11. I dette arbejde dyrkes GUVs på Pt-ledninger, som denne metode har vist sig at fungere meget bedre end alternativet med at gøre GUVs i nærværelse af salte i buffer12. Selvom electroformation protokol er beskrevet her i tilstrækkelige detaljer til at gengive det, henvise vi læseren til tidligere artikler hvori lignende og andre metoder til at gøre GUVs er beskrevet detaljeret13,14. I vores hænder, har electroformation på Pt-ledninger med held givet GUVs fra en blanding af syntetiske lipider eller naturlige lipid ekstrakter i en buffer, som indeholder ~ 100 mM NaCl. Derudover blev det også muligt at indkapsle proteiner inde i GUVs under væksten. Et eksempel electroformation kammer er vist i figur 1A; Det består af to ~ 10 cm lange Pt-ledninger sat ind i en holder, der er fremstillet af polytetrafluorethylen (PTFE) der kan forseglet på begge sider med glas coverslips ~ 1-2 cm fra hinanden (figur 1A).
Figur 1: eksperimentel opsætning. (A) GUV electroformation kammer med elektriske forbindelsesdele knyttet til Pt-ledninger. (B) venstre: eksperimenterende systemet viser mikroskop, den eksperimentelle kammer over målet og to Mikropipetter (venstre og højre) knyttet til micromanipulators og indsættes i den eksperimentelle kammer for tube trække og protein injektion. Højre: et nærbillede af den eksperimentelle kammer monteret over målet viser tips af aspiration og injektion Mikropipetter indsat. (C) en sprøjten udstyret med en tynd dispenser indsat i en mikropipette på sin back-end. Bunden er et nærbillede af dispenser inde mikropipette med den blå prikkede linje skitserer mikropipette. Dette system bruges til at udfylde mikropipette med kasein passivering glasoverfladen og tilbage fyld med mineralsk olie efter behov. (D) A system anvendes til Aspirér µL mængder af protein løsning. Nålen er tilsluttet en sprøjte og slanger, som er forbundet til injektion mikropipette. Mikropipette tip er omhyggeligt nedsænket i protein løsning og indsugning så for at udfylde den mikropipette spids. Mikropipette udfyldes derefter tilbage med mineralsk olie ved hjælp af det system, der er vist i panelet C. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
En membran nanorør, spænder i radius fra 7 nm til flere hundrede nm, kan trækkes fra en GUV af en ekstern kraft. Denne metode blev oprindeligt designet til at måle de elastiske egenskaber af cellemembraner og vesikler, såsom bøjning stivhed15,16. I de seneste værker, blev metoden udvidet til at studere samspillet mellem proteiner med buede membraner af microinjecting proteiner nær trak nanorør7,17. Andre metoder er blevet udviklet for at studere membran-buede proteiner. I én metode inkuberes proteiner med forskellige størrelser Liposomer tøjret til en passivated overflade. Konfokal mikroskopi anvendes til at måle protein bindingen som en funktion af Liposom diameter, hvilket kan indikere krumning-induceret sortering18,19. I en anden metode, er proteiner indsprøjtet i nærheden af en mikro-indsugning GUV at måle deres evne til at fremkalde spontant tubuli20,21. De i denne protokol beskrevne metode er unikt tilpasset til at studere membran-buede proteiner involveret i endocytose, hvor de fleste proteiner typisk støder på præfabrikerede membran nanorør forbinder cargo-holdige membran invagination med den underliggende flad plasma membran. Desuden i denne metode, er i modsætning til i analysen med tøjret lille Liposomer, membran nanorør konstant tilsluttet membran; Derfor er det i mekanisk ligevægt med GUV, en situation forventes i vivo. Derfor grundlæggende membran fysik gælder, og vi kan udlede et væld af mekaniske egenskaber af vores målinger22,23,24.
For en fuldstændig gennemførelse af denne metode omfatter det nødvendige udstyr en Konfokal mikroskop, Optisk pincet, og en eller to Mikropipetter tilsluttet en vandtank (figur 1B). Ved at kombinere alle tre, er det muligt at samtidig måle membran spændinger, membran krumning, overflade tæthed af proteiner, og tube kraft25. Mikropipette aspiration er afgørende og det opbygges nemt ved at indsætte et glas mikropipette i indehaveren tilsluttet en vandtank, der via hydrostatisk tryk, styrer aspiration pres26. Mikropipette og indehaveren styres af en micromanipulator og ideelt set i én retning ved en piezo-aktuator til præcision bevægelse. For at trække en nanorør, microaspirated GUV kortvarigt fast til en micron mellemstore perle derefter trukket væk skaber et nanorør. I denne implementering holdes perlen af optisk pincet, der kan konstrueres ved at følge en offentliggjort protokol27. Det er muligt at give afkald af optisk pincet og pull nanorør på forskellige måder, selv på bekostning af præcise kraft målinger. Hvis det er for udfordrende at bygge en optisk fælde eller hvis force målinger er ikke afgørende, som hvis man blot ønsker at kontrollere proteiner forkærlighed for buede membraner, kan en slange trækkes ved hjælp af en perle indsugning på spidsen af en anden mikropipette28. Det er også muligt at trække rørene ved hjælp gravitationel kraft29 eller flow30,31. Derudover heller konfokalmikroskopi ikke er væsentlige; dog foretrækkes det så til at måle overflade tætheden af proteiner. Det giver også mulighed for måling af nanorør radius fra fluorescens intensiteten af lipider i røret, således uafhængigt af membran kraft og spændinger. Udlede tube radius fra fluorescens er især vigtigt, hvis forholdet mellem disse mængder afviger fra veletablerede ligninger på grund af tilstedeværelsen af membran-overholdt proteiner25. Vigtigere, man kan ikke give afkald af både optisk fælde og konfokal mikroskopi, da det ikke vil være muligt at måle tube krumning.
Metoden som beskrevet i denne protokol er blevet brugt til at studere krumning-induceret sortering af forskellige perifere Membranproteiner på nanorør, for det meste dem fra de BAR familie25,32,33,34 . Det viste sig også at conically formet transmembrane kalium kanal KvAP er beriget på buet nanorør på samme måde som BAR proteiner35. Ved at optimere metoden for at indkapsle proteiner inde i GUVs, er samspillet mellem proteiner og negativ krumning for nylig undersøgt som godt36. Desuden, denne metode har været brugt til at belyse dannelsen af protein stilladser25,37 og studere mekanismen af membran virksomhedsdeling enten linje spænding38, protein dynamin39, eller BAR proteiner40,41. Ud over proteiner, kan små molekyler eller ioner også fremkalde krumning. Du bruger denne metode, blev calciumioner vist sig at fremkalde positive krumning under salt-fri betingelser42. Interessant, har det også vist at lipider kan gennemgå krumning sortering, selvom kun til kompositioner, der er i nærheden af et demixing punkt43,44. I sum, metoden, der kan bruges af forskere interesseret i at undersøge hvordan enten integreret membran komponenter (fx, lipider eller transmembrane proteiner) eller perifert bindende molekyler (enten indenfor eller udenfor GUVs) interagere med cylindrically buet membraner, fra mekanisk og kvantitativ synspunkter. Det er også beregnet til dem interesseret i at måle de mekaniske egenskaber af membranen selv22,23,45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af GUVs af Electroformation på Pt-ledninger
- Ren electroformation-kammer (Se Introduktion og figur 1A) og Pt-ledningerne med et organisk opløsningsmiddel som ethanol eller acetone at vaske væk lipider og vand til at vaske væk salte.
Bemærk: Foreslår vi grundigt tørre væk rester med ethanol-gennemblødt væv og derefter sonicating i acetone, ethanol, så vandet, hver i 5 min. - Forberede en lipid blanding af en ønskede lipid sammensætning på 1 mg/mL i chloroform. Blandingen bør indeholde ~ 0,05% kindtand brøkdel af en lipid konjugeret med biotin (fx, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]) og ~ 0,5% kindtand brøkdel af en lipid konjugeret med et fluorophore ( f.eks.BODIPY-TR-C5-ceramid).
Bemærk: Vores erfaring, at det var vanskeligt at producere GUVs på et højt udbytte, der indeholder mere end 30% opkrævet lipider.
Forsigtig: Chloroform bør håndteres inde en kemisk hætte iført passende handsker. - Indsæt et par af Pt-ledninger i electroformation kammer. Deponere lipid mix på Pt-ledninger i dråber adskilt af ~ 2-3 mm (samlede ~ 4 µL mix).
- Tørre ledninger under vakuum i 30-60 min. ved stuetemperatur.
- Forsegle bunden af kammeret ved at tilslutte coverslip over kammeret ved hjælp af silicium fedt. Fyld salen med en bufferopløsning indeholdende NaCl, saccharose og en bufferkapacitet agent (f.eks., 70 mM NaCl, 100 mM saccharose og 10 mM Tris, pH-værdi på 7,4). Dette medie vil blive inde GUVs i eksperimentet. Det er vigtigt, at dette medium osmolaritet matche osmolaritet af den eksperimentelle medium inden for ~ 10%. Bruge saccharose for at justere osmolaritet. Tilføje proteiner til løsningen på en ønskede koncentration, hvis målet er at indkapsle dem i GUVs.
Forsigtig: Forskellige salte og sukker i bufferen kan påvirke bøjning stivhed og spontane krumning af membraner24,42,46,47. - Forsegle toppen af kammeret ved at tilslutte et coverslip med silikone fedt at sikre minimum luften inde i salen. Anvende en sinus AC strøm gennem Pt-ledninger på 500 Hz og 280 mV.
Bemærk: Vækst tid og temperatur skal være optimeret afhængig af lipid sammensætning og følsomhed af protein. Når du bruger naturlige lipid ekstrakter, og også når indkapsling proteiner i GUVs, det bedste udbytte blev opnået ved at dyrke GUVs ved 4 ° C natten over. I mangel af proteiner og for syntetiske lipid kompositioner, vækst ved stuetemperatur til ~ 2 h var tilstrækkelig.
2. forberedelse af den eksperimentelle kammer og Mikropipetter
- For at forberede Mikropipetter, trække en glas kapillarrør ved hjælp af en pipette puller. Det foreslås for at bruge et glas kapillær med interne og eksterne radier, henholdsvis, 0,7 mm og 1 mm. Derefter forfine spidsen af mikropipette, således at dens indvendige diameter er 5-7 µm, ved hjælp af en microforge. Hvis proteiner eller andre molekyler vil blive injiceret i eksperimentet, trække en anden mikropipette og forfine sine tip til en indre diameter på 8-15 µm.
- Konstruere en eksperimentel kammer ved at placere to rektangulære mikroskopi coverslips på en metallisk base, som vist i figur 1. Coverslips skal adskilles af ~ 1 mm. Lokalet bør være åbninger langs de lange kanter (Se figur 1). De åbne sider skal passe spidsen af mikropipette hvor spidsen bør nå mindst midten af salen.
- Forberede den eksperimentelle buffer hvis osmolaritet ikke bør afvige med mere end 10% fra den buffer, der bruges til at dyrke GUVs. Justere osmolaritet med glukose. Et eksempel på en eksperimentel buffer, der blev brugt i at studere samspillet mellem endophilin og nanorør er 100 mM NaCl, 40 mM glukose, bufferet med Tris til pH 7,4. En kombination af saccharose inde / glucose udenfor sikrer: a tilstrækkeligt fasekontrast at observere GUVs med lysfelt mikroskopi, og (b) højere tæthed inde i GUVs, som får dem til at slå sig ned på bunden af salen. Justere saltkoncentration baseret på eksperimentel krav.
Bemærk: Ud over at påvirke den membran mekaniske egenskaber, vores erfaring, høje glukose koncentration (> 300 mM) negativt påvirker etablering af streptavidin-biotin obligationer, forpligtet til at trække et nanorør. Desuden for lidt salt hæmmer streptavidin-biotin obligationer, mens for højt af en koncentration skærme protein-membran interaktioner. I tilfælde af protein indkapsling, ved hjælp af meget høj saltkoncentration i den eksterne buffer (f.eks.> 200 mM NaCl) kan bruges som et trick til at frigøre proteinerne fra de ydre indlægsseddel36. Det er nødvendigt at eksperimentere med en vifte af saltkoncentration at finde de optimale bindende betingelser molekyle af interesse. -
30-60 min før indsamling GUVs for eksperimentet, passivering glasoverflader ved at udfylde både den eksperimentelle kammer og aspiration mikropipette med en 5 mg/mL opløsning af en meget ren β-kaseiner (fxopløst i den eksperimentelle buffer). Β-kaseiner skaber et beskyttende lag på glasoverflader, forebyggelse af GUVs for at overholde kraftigt, som ville få dem til at briste. Inkuber med β-kaseiner for 30-60 min.
Bemærk: Der skal ingen bobler inde den mikropipette, der ville forstyrre kontrollerende membran spændinger.- For at opbygge en dispenser til påfyldning Mikropipetter, bryde en sprøjte nål tæt på plastic-stik og lim ind i det en tynd silica kapillær (som dem der bruges til højpræstationsvæskekromatografi) (figur 1 c).
- Under inkubation med β-kaseiner, montere salen på mikroskopet og centrere det over målet. Indsæt spidsen af aspiration mikropipette gennem åbningen langs den lange kant og bringe aflæsse ovenfor mikroskop mål. Justere vand tank niveau, så presset for aspiration er nær nul (der bør være nogen tunge flow i eller ud af pipetten, som kan ses under mikroskop).
-
I tilfælde af proteiner eller andre molekyler vil blive injiceret under eksperimentet, fyld injektion mikropipette med den ønskede molekyle opløst i den eksperimentelle buffer på en koncentration af valg, montere mikropipette inde i en micromanipulator, og indsætte gennem den modsatte side af den eksperimentelle kammer.
- Hvis du vil bruge et minimum af proteiner, fyld kun mikropipette spidsen med protein ved aspiration. For at gøre det, wrap i slutningen af en nål, der er knyttet til en sprøjte med plastslanger. Indsæt slangen ind i bagsiden af injektion mikropipette.
- Meget omhyggeligt fordybe spidsen af mikropipette oploesningen protein og Opsug den for at fylde spidsen af mikropipette.
Bemærk: Denne simple opsætning er vist i figur 1 d , og vores erfaring, det giver mulighed for sugning fra så lidt som et par µL af opløsningen protein. - Opfyldning resten af injektion mikropipette med mineralsk olie til at forebygge sammenblanding af løsningen, protein og vand fra vandbeholderen (ved hjælp af setup i figur 1 c).
- Passe på ikke for at indføre luftbobler i injektion pipette, som det vil fremkalde ustabile indsprøjtning pres. Alternativt, hvis protein mængde er tilstrækkelig stor, udfylde mikropipette med proteiner på samme måde som fyldning med β-kaseiner som beskrevet i trin 2.4. Justere vand tank for at minimere aspiration trykket i injektion pipette.
Bemærk: Koncentrationen af den injicerede molekyle eller ion nær nanorør er gonna være lavere på grund af fortynding og det kan vurderes ved at måle fluorescens intensitet nedgang som funktion af afstanden fra pipette afkørsel42. Det er imidlertid vigtigere at vide tolagede-bundet tætheden af den injicerede molekyle, der kan måles nøjagtigt (Se afsnit 4).
- Efter inkubering med β-kaseiner, fjerne løsningen fra salen, og skyl med den eksperimentelle buffer flere gange. Fyld med den eksperimentelle buffer.
- Stop electroformation af GUVs og indsamle dem direkte fra Pt-ledninger. Tilføje et par µL af opløsningen GUV til den eksperimentelle kammer. Brug kun frisk tilberedte GUVs.
- Tilføje et par µL af streptavidin-belagte perler til eksperimentelle salen til en endelig koncentration på perler i salen på omkring 0,1 x 10−3% (w/v) eller mindre. Polystyren perler ~ 3 µm i diameter anbefales (polystyren perler i vand har en nær-optimale brydningsindeks kontrast med hensyn til maksimering af gradient kraft for spredning kraft i den optiske fælde). Perle koncentration kan blive justeret baseret på eksperimentet: en meget lav koncentration gør det svært at finde dem i salen, og en for høj koncentration risikerer flere perler falder i den optiske pincet.
3. trække en membran nanorør fra en GUV
- Lad GUVs og perlerne bilægge til bunden af salen. Deflatere GUVs ved at lade lidt af den eksperimentelle buffer fordampe, for cirka ~ 15 min. deflatere GUVs er afgørende for at producere nogle overskydende område, der kan være indsugning med en mikropipette. GUVs bør synligt bølger (dvs., vises floppy) under den lysmikroskop. Hvis de vises anspændt, giver mulighed for mere fordampning tid.
Bemærk: Osmolaritet ændring sats afhænger den fordampende areal, temperatur m.m., og bør overvåges nøje. I princippet osmolaritet forskellen kunne indstilles fra start ved at justere saccharoseindhold/glucose koncentration, men pleje bør tages ikke at fremkalde en osmotisk chok. - Find en floppy GUV og Opsug den til en pipette. Længden af aspiration tungen (del af membranen inde pipetten) skal være lig med eller større end pipette radiussen for den teoretiske analyse gælder15,16,22,()23 Figur 2). Prøv flere GUVs. Hvis ingen af GUVs kan være indsugning for at producere en tilstrækkelig lang tunge, vent et par minutter. Hvis GUVs er floppy nok, skal du fortsætte til næste trin.
- Forsegle kammer med mineralsk olie, for at forhindre yderligere fordampning af bufferen. Gøre det ved omhyggeligt pipettering olie langs åbne kanterne af den eksperimentelle kammer.
- Du indstiller nulstillingen af aspiration pres, først, kigge efter en perle i salen og placere aspiration pipette exit nær perle. Juster højden af vandbeholderen, så perlen er hverken suget blæst væk af aspiration pipette. Selv om mineralsk olie forhindrer fordampning og derfor yderligere trykændringer inde i salen, nul aspiration pres før måling hver GUV.
- Find en GUV og Opsug den. Flyt mikropipette op og ud af fokus (for at holde GUV væk fra overfladen, hvor det kan trækkes ud af pipetten af shear stress når salen er flyttet).
- Kigge efter en perle af omhyggeligt bevæger sig rundt i salen. Pludselige bevægelser kan skubbe GUV. Fælde det med en optisk pincet i en afstand ~ 20 µm fra salen bunden. Sikre, at det pågældende område, er ren med ingen andre perler eller membraner i syne. Noget falder i den optiske pincet end perle vil forstyrre målingen.
- Bringe GUV tilbage i fokus, og fra perle med mikropipette justeret med den optiske fælde (figur 2).
- Registrere bevægelse af perle for 1-2 min til at måle positionen ligevægt (kræves til kraft målinger).
- Reducere trykket inde mikropipette så meget som muligt uden at miste GUV for at mindske membran spændinger. Omhyggeligt bringe GUV kontakt med perle for omkring et sekund, oprettelse af streptavidin-biotin obligationer, derefter forsigtigt trække tilbage, at skabe et nanorør. Bevægelse af GUV mod eller væk fra perle bør ideelt gøres med et piezo-aktuator til minimalt forstyrre perle i den optiske pincet.
Bemærk: Hvis nanorør ikke er, kunne det være på grund af dårlig streptavidin belægning perle, utilstrækkelig mængde af biotinylated lipider i GUV, utilstrækkelig koncentration af salt eller overdreven koncentration af glukose i den eksperimentelle buffer eller membranen spænding i GUV er for høj48. - Øge aspiration pres for at genskabe aspiration tungen. Juster røret for at ligge i aksen aspiration pipette og maksimalt fokus på røret (figur 2).
- Sikre, at GUV ækvator og røret er i fokus. Registrere bevægelse af perle med lysfelt mikroskopi i et par min. (her, kamera erhvervelse hastighed er 30 Hz). Post højden h, af vandtank med hensyn til nulstillingen. Tage et par Konfokal billeder af systemet (figur 2).
- Gentag det forrige trin på forskellige aspiration pres, implicit membran spændinger. Typiske spænding vifte er 0,015-0,2 mN/m, med en trin størrelse på omkring 0,02 mN/m.
- Hvis indsprøjte proteiner eller molekyler i nærheden af systemet, bringe injektion mikropipette nær nanorør, og sørg for, at perle i den optiske fælde ikke er rystet. Forsigtigt indsprøjtes ved et tryk på omkring 1-2 Pa.
-
Når protein bindende har ekvilibreres (Fluorescens-intensiteten af den injicerede protein på membranen forbliver konstante på GUV), skal du gentage trinvis målingerne som med den nøgne membran (trin 3.11 og 3.12).
Bemærk: Da målingerne udføres mens indsprøjtning proteiner nær GUV ved konstant tryk, bulk koncentrationen af proteinet er nogenlunde uændret nær GUV; således bør protein desorption ubetydelig under målingen.- Alternativt er det muligt at udruge GUVs sammen med proteiner inden du udfører tube-trækker eksperimenter for at sikre en konstant protein bulk koncentration. I betragtning af at relative membran brøkdel af proteiner på røret og på GUV måles, hvordan proteiner leveres ikke påvirke beregningen krumning-sortering (Se afsnit 4).
Figur 2: Tube-trækker eksperiment. (A) skemaer for eksperimentet. (B) en Konfokal billede af en trak rør som beskrevet i denne protokol. Skalalinjen = 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
4. målinger og analyse af Data
- Måling af membran spænding
- Beregn det hydrostatiske tryk for hvert trin på konstant aspiration pres:
Δp = pgh
hvor p er vand massefylden, g tyngdeaccelerationen og h højden af vandtank fra trin 3.11. - Fra Konfokal billeder, mål radius af GUV, rGUV, og radius af aspiration pipette, rpip (figur 2).
- Beregne membran spændinger, σ, ved hjælp af Laplaces ligning49:
- Beregn det hydrostatiske tryk for hvert trin på konstant aspiration pres:
- Måling af membran kraft
- Bestemme stivheden af den optiske pincet, k, ved hjælp af en af flere kalibrering metoder27. I denne opsætning, måle k ved hjælp af tyktflydende træk metode27.
- Beregne ligevægt stilling perle, 0,som gennemsnitligt fra en måling før trække rør (trin 3.8).
- For hver måling af konstant spænding, beregne ligevægt membran kraften, F, fra Hookes lov:
F = k(en - 0)
hvor en er den gennemsnitlige position af perle under denne måling.
- Måling tube radius
- For en nøgne membran (ingen ekstra membran-buede molekyler), Beregn tube radius, R, fra kraften som:
R = F/(4πσ)
(henvisninger22,23). - For at måle tube radius i overværelse af membran-buede molekyler og uafhængigt af trin 4.3.1, optage først, lipid fluorescens intensitet langs tube, jegkarret, og langs GUV kontur, jegGUV. Mål den gennemsnitlige fluorescens intensiteten af en fluorophore i eller bundet til membranen som en gennemsnitlig intensitet langs den lyseste af et rør eller en GUV kontur. Vælg en rektangulær kasse, der indeholder en vandret sektion af GUV kontur eller røret og beregne summen af fluorescens-intensiteten af hver vandret linje i boksen.
- Opdele hver summen af antallet pixel i den vandrette linje (dvs., i boksen bredde). Bemærk, at i den markerede boks, bør være ingen andre nuværende membraner. Fluorescens intensitet profil langs længden af den markerede boks er opnået.
- Efter fratrække baggrund intensitet, tage den gennemsnitlige pixel fluorescens intensitet fra den lyseste linje. Tube radius er lineært relateret til forholdet mellem fluorescens langs konturen af røret og GUV som:
R = Kbaljejegbalje/jegGUV
hvor Kkarret er en kalibrering faktor25.
Bemærk: Denne metode kan bruges til at måle tube radius i området 10-80 nm (når røret er smalle nok til at ligge inden for en Konfokal voxel bredde) og med en lidt større usikkerhed i de 80 nm og højere rækkevidde. Følsomheden af måling afhænger af opsætningen.
- Bestemme Ktub ved at udføre uafhængige radius målinger i trin 4.3.1 og 4.3.2 på en simpel membran sammensætning ved hjælp af tomt lipider. Sådanne enkle membran sammensætning sikrer, at radius og kraften, har den enkle forhold i trin 4.3.1. Gentag forsøget flere gange og plot Rasmussen, udledes kraft (trin 4.3.1) versus jegbalje/jegGUV (trin 4.3.2). Beregne Kkarret fra fit. I denne opsætning, Kbalje = 200 L-α-phosphatidylcholin (PC-æg) membran og en fluorescerende lipid hvis fluorescens minimalt afhænger polarisering25± 50 nm ved hjælp af æg.
Bemærk: Kkarret skal måles for forskellige målsætninger, på grund af deres forskellige Konfokal voxel diskenheder. Lipid-fluorophore bør ikke interagere med de injicerede proteiner/molekyler. Den fluorescerende lipid anbefales her, BODIPY TR ceramid, forventes ikke at have nogen interaktion med proteiner. Denne antagelse blev bekræftet med tidligere undersøgelser af BAR og -BAR domæner25,36,37, som har vist, at på højt proteinindhold overfladedækning, tube radius er fastsat af proteinerne, uanset de spænding i GUV. Hvis proteiner interagere med lipid-fluorophore, vil en udtynding eller berigelse af fluorophore observeres i røret på varieret højt proteinindhold overflade fraktioner.
- For en nøgne membran (ingen ekstra membran-buede molekyler), Beregn tube radius, R, fra kraften som:
- Måle overflade tætheden af proteiner
- Forberede lipid blander ved hjælp af en simpel tomt lipid (fx, æg-PC) suppleret med omkring fem forskellige muldvarp brøkdele af en fluorescerende lipid (af den samme bølgelængde som farvestof bruges til at mærke proteinet, f.eks. BODIPY-FLC5-hexadecanoyl-phosphatidylcholine (HPC *) for fx, Alexa488-mærket protein) i området: XHPC * = 0,01 – 1%. Forbered GUVs i 100 mM saccharose ved electroformation på ITO plader (Følg trin 1 i en tidligere publikation13).
- Indsamle GUVs og Overfør til et eksperimenterende kammer passivated med β-kaseiner. Brug fx100 mM glukose for den eksperimentelle løsning. Vent et par minutter for GUVs til at bilægge.
- Tage Konfokal fluorescens billeder af GUVs og optage gennemsnitlige fluorescens-intensiteten langs GUV konturer som en funktion af muldvarp fraktion af lysstofrør lipid (Se trin 4.3.2). For hver sammensætning, beregne område tætheden af de fluorescerende lipid, φHPC*. For eksempel, ved at antage, at areal pr. lipid er 0,7 nm2, φHPC* = 1,43 x 106 XHPC * pr. brochure. Plot HPC * fluorescens intensitet i GUV, jegHPC *, GUV, versus φHPC*. Pasform giver kalibrering-konstant, A, givet ved φHPC* = AIHPC *, GUV. A afhænger mikroskopi indstillinger, såsom laser power og detektor følsomhed (dvs., gevinst), derfor optage A for forskellige anvendte mikroskopi indstillinger (se eksemplet i figur 3).
- Forbered flere løsninger af HPC * opløst i vaskemiddel, fx, sodium dodecyl-sulfat (SDS), ved forskellige koncentrationer i intervallet fra ~ 1 til 10-50 µM. optage fluorescens intensiteten af hver opløsning i bulk og beregne hældningen af intensitet versus koncentration (figur 3). Gentag målingen med den fluorophore, der vil være konjugeret med protein i et lignende koncentrationsområde (se eksemplet med Alexa488 i figur 3). Denne måling er forpligtet til at relatere fluorescens-intensiteten af etiketten protein og lipid etiket, jegA488, bulk / jegHPC *, bulk, som de ikke kan nødvendigvis udleder på samme måde på den samme bulk koncentration.
- Mål antallet af fluorophores pr. protein molekyle ved hjælp af en fluorospectrometer. For eksempel, kan i tilfælde af Alexa488, antallet af Alexa488 molekyler per protein, nA488, beregnes ved hjælp af følgende forhold:
n A488 = (A494/εA488) / ((A280 - 0,11en494) / εprot)
hvor A494 og A280 er absorbans værdier pr. enhed længde på 494 nm og 280 nm, henholdsvis, og εA488 og εprot er de molekylære absorption koefficienter af Alexa488 og protein, henholdsvis. - Beregne overflade tætheden af protein på GUV, φprot, GUV, efter følgende formel:
Husk på tilstanden polymerisering af protein. For eksempel BAR proteiner dimerize, derfor den beregnede tæthed vil være der af BAR monomer pr. område hvis bruger extinction koefficient af monomere form.
Figur 3: et eksempel på protein overflade tæthed kalibrering. Målt er HPC * lipid fluorescens intensiteten i bulk (venstre) og GUVs (center). Også målt er bulk fluorescens intensiteten af Alexa488 (bundet til en BAR domæne) (højre). Fluorescens intensitet skalaer lineært med koncentration. Målinger vist er for specifik registrerings vinding og laser power output. Parceller genereres baseret på data fra reference37. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tube-trækker eksperimentet kan give vigtige mekaniske oplysninger om membranen. I mangel af proteiner eller andre molekyler, der parret med membran krumning, membranen kraft og tube radius kan være relateret til membran spændinger ved at anvende Canham-Helfrich Hamiltonske ligning til en tube trukket fra en GUV50,51
(Ligning 1)
hvor 
er membran gratis energi af røret, K membran bøjning stivhed, r og R0 er henholdsvis middelværdien og spontane krumningsradierne, σ membran spændinger, A område af røret, L længden af røret og f punkt kraft udøvedes af røret på Perlen. Ved ligevægt, r er tube radius, betegnet som R, og f bliver tube-retraktion kraft, F, dvs, den ligevægt kraft som røret trækker perlen i det optiske fælde. For at beregne F og R, vi minimere L og r, fremstilling af22,23
(Ligning 2)
(Ligning 3)
Rasmussen 0 er forsømt, hvis begge foldere af membranen har samme sammensætning, selv om det er spekuleret at andre faktorer, såsom afgift frastødninger kan fremkalde nogle spontane krumning42. Kraft og radius målinger på rør trukket fra 100% DOPC GUVs er fremragende enige med teoretiske forudsigelser i ligning 2 og ligning 3 (figur 4). De to målinger er uafhængige, kraften er målt fra fordrivelse af perle i den optiske fælde og radius fra fluorescens intensitet, derfor giver to måder at beregne membranen bøjning stivhed. Montering af ligning 2 og ligning 3 til de viste data udbytter: K = (25.1 ± 1.4) (gennemsnit ± SD) kBT og (22,1 ± 1,5) kBT, henholdsvis som tidligere målt42 .
Hvis eksperimentere med krumning-kobling proteiner, det foreslås at bruge mere sofistikerede Hamiltonskes ligning end den ene i ligningen 1, som ligning 1 kun tegner sig for en effektiv spontan krumning og tager ikke højde for de effekt af proteiner på en membran mekaniske egenskaber eller muligt protein-protein interaktioner. Se fx,25,35,36,52,53. Selv om avancerede teoretiske modeller er afgørende for en dybdegående forståelse af et bestemt protein-membran system, uden at ty til dem, er det stadig muligt at opnå meget nyttige oplysninger fra metoden tube-trækker.
For eksempel, for at teste hvis proteiner fornemmer krumning, måles den relative intensitet af proteiner på røret i forhold til GUV, som anses for at være flad. Interaktion med positiv krumning er undersøgt ved at indsprøjte proteiner i nærheden af røret med den anden mikropipette25. Interaktion med negativ krumning eller funktionsmåden for transmembrane proteiner er studeret af indkapsling eller retablere proteiner under GUV dannelse35,36. Den relative berigelse af BAR og KvAP proteiner på membran rør over de underliggende GUVs angiver, at de foretrækker buede membraner (figur 5). For at være mere kvantitative, denne berigelse kan beregnes som en Sortering koefficient, S, i henhold til:
(Ligning 4)
hvor jegprot, balje og jegprot, GUV er fluorescens-intensiteten af proteiner på røret og på GUV, henholdsvis, og jeglæbe, balje og jeglæbe, GUV er fluorescens-intensiteten af lipider på røret og på GUV, henholdsvis.
Et andet eksempel måling tube kraft, som proteinet binder sig til membranen. Figur 5B, C viser at en N-BAR protein endophilin A2 gradvist reducerer tube kraft, faldende det til nul, angiver, at det har dannet en tredimensionel struktur, der holder røret stabil, som kaldes et stillads. Sådanne strukturer spiller en vigtig rolle i endocytose, ved fastsættelse af tube radius, men også i aktivering virksomhedsdeling7,41. Måling af S, samt effekterne mekaniske og morfologiske, som proteiner pålægger membraner giver vigtig indsigt i, hvordan de fungerer i de membran-bøjning fænomener i cellen.
Figur 4: repræsentative resultater af mekaniske målinger i mangel af proteiner. Vist er lineariseret kraft og tube radius afhængighed af membran spænding for en 100% DOPC membran, fra tre uafhængige målinger, offentliggjort tidligere42. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative resultater af krumning sensing og stillads dannelsen af BAR proteiner. (A) krumning sensing af-BAR protein IRSp53. Proteinet sanser negative membran krumning og er bundet på indersiden af GUV, med ubetydelig mængde protein til stede på ydre membran indlægsseddel. Skalalinjen = 5 µm. Reprinted fra36, under Creative Commons CC-BY licens, Copyright 2015, natur Publishing Group. (B) danner et protein stillads af N-BAR protein endophilin. Proteiner er indsprøjtet i nærheden af røret og er derfor forpligtet på den ydre membran folder. Som beskrevet i37, endophilin binder til tube's base og danner et stillads, der hele tiden vokser langs røret fra GUV mod den optiske fælde (OT, hvid cirkel). (C) en kymogram af endophilin stillads vækst fra GUV til perle med lipid og protein kanalerne overlejret. Plottet viser tube kraft, F, som funktion af tiden, t. Tidsfrister i kymogram og plottet er de samme (x-akse er delt). I B og C, skala bar = 2 µm. Reprinted med tilladelse fra reference37, Copyright (2016) National Academy of Sciences. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden med at trække rør fra GUVs giver rige oplysninger på membran-protein-system, så det er ikke kun et middel til at måle de grundlæggende mekaniske egenskaber af membranen, men det hjælper til at kaste lys over koblingen mellem proteiner og membran krumning. Som omtalt i indledningen, andre teknikker findes for at måle virkningerne af membran-buede proteiner, enten ved at inkubere proteiner med sub micron Liposomer tøjret til en passivated overflade18,19 eller ved at observere den spontane dannelse af tubuli i mikropipette-indsugning GUVs ved injektion af en protein20,21. Metoden beskrevet her giver direkte geometriske forbindelse til endocytose og er enestående i at levere de vigtige fysiske målinger af systemet på samme tid, som protein tæthed, membran spændinger og membran kraft.
En vigtig begrænsning af metoden er, at det ikke er trivielt at konstruere og kalibrerer alle de komponenter, der er involveret i analysen. Men mens en kombination af Konfokal mikroskopi, Optisk pincet, og micromanipulation giver maksimal information, nogle komponenter kan erstattes som omtalt i indledningen, afhængigt af de oplysninger, der skal læres om den system. De minimal komponenter, der kræves til korrekt sonde krumning kobling af et protein eller eventuelle andre potentielle krumning-kombineret molekyle, er en mikropipette indsugningsventil og en Konfokal mikroskop, med den optiske pincet er undværes. Vigtigere, skal mange af kalibreringer (såsom kalibrering for membran tube radius og til bestemmelse af protein overflade tæthed) typisk kun udføres én gang. En anden begrænsning af metoden er, at det kan måle kun én GUV på et tidspunkt, beløber sig til to til tre GUVs i timen (med praksis); men hver måling giver et væld af data.
For højere overførselshastighed målinger eller hvis det er vigtigt at studere samspillet mellem proteiner og sfæriske og ikke rørformede geometrier, vil andre assays skal være udforskede eller udvikles. Fremtidige bestræbelser vil blive afsat til: (1) designe en højere overførselshastighed system flere rør (fra flere GUVs) kunne trak og målt på samme tid, og (2) integrere super-resolution mikroskopi for at studere detaljer af protein stillads der danner på nanorør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur og Gil Toombes for deres afgørende bidrag til at etablere metoden nanorør i gruppen. P.B. gruppe tilhører CNRS konsortium CellTiss, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) og Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F. C. Tsai blev finansieret af EMBO langsigtede fellowship (ALTF 1527-2014) og Marie Curie aktioner (H2020-MSCA-IF-2014 og projekt membran-ezrin-actin). M.S. er en Junior Fellow af Simons samfund af medmennesker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti | 850375 | Example lipid used in data for Figure 3 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin] | Avanti | 880129 | biotinylated lipid |
| BODIPY-TR-C5-ceramide | Molecular Probes (ThermoFisher) | D7540 | fluorescent lipid |
| BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*) | Molecular Probes (ThermoFisher) | fluorescent lipid for protein density calibration | |
| egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC) | Avanti | 840051 | used for calibrating the tube radius constant |
| β-casein from bovine milk (>99%) | Sigma Aldrich | C6905 | used for passivating the micropipette and the experimental chamber |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| D(+) glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Tris | Sigma Aldrich | 10708976001 | |
| osmometer | Loser | n/a | |
| Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure | Goodfellow USA | PT005139 | used for GUV electroformation |
| function generator | n/a | used to create current for GUV electroformation | |
| putty sealant | Vitrex (from CML France) | CRIT 140013 | used to seal the electroformation chamber |
| bath sonicator | n/a | useful to clean the electroformation chamber, but not crucial | |
| Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany) | an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers | ||
| micromanipulators | n/a | ||
| borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively) | Harvard apparatus | 30-0036 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-2100 | |
| microforge | Narishige | MF-800 | |
| piezoelectric actuator | Physik Instrumente | n/a | |
| polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm) | Spherotech | SVP-30-5 |
References
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Johannes, L., Wunder, C., Bassereau, P. Bending "on the rocks"--a cocktail of biophysical modules to build endocytic pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Dawson, J. C., Legg, J. A., Machesky, L. M. Bar domain proteins: a role in tubulation, scission and actin assembly in clathrin-mediated endocytosis. Trends Cell Biol. 16 (10), 493-498 (2006).
- Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends Biochem Sci. 37 (12), 526-533 (2012).
- Qualmann, B., Koch, D., Kessels, M. M. Let's go bananas: revisiting the endocytic BAR code. EMBO J. 30 (17), 3501-3515 (2011).
- Rao, Y., Haucke, V. Membrane shaping by the Bin/amphiphysin/Rvs (BAR) domain protein superfamily. Cell Mol Life Sci. 68 (24), 3983-3993 (2011).
- Simunovic, M., Voth, G. A., Callan-Jones, A., Bassereau, P. When Physics Takes Over: BAR Proteins and Membrane Curvature. Trends Cell Biol. 25 (12), 780-792 (2015).
- Safari, F., Suetsugu, S. The BAR Domain Superfamily Proteins from Subcellular Structures to Human Diseases. Membranes (Basel). 2 (1), 91-117 (2012).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Progress in Colloid and Polymer Science Vol. 89: Trends in Colloid and Interface Science VI. Helm, C., Lösche, M., Möhwald, H. 89, Steinkopff. Ch. 29 127-131 (1992).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophys J. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J Vis Exp. (95), e52281 (2015).
- Hochmuth, R. M., Evans, E. A. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. I. Analysis. Biophys J. 39 (1), 71-81 (1982).
- Hochmuth, R. M., Wiles, H. C., Evans, E. A., McCown, J. T. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. II. Experiment. Biophys J. 39 (1), 83-89 (1982).
- Bassereau, P., Sorre, B., Levy, A. Bending lipid membranes: experiments after W. Helfrich's model. Adv Colloid Interface Sci. 208, 47-57 (2014).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature chemical biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO J. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Shi, Z., Baumgart, T. Membrane tension and peripheral protein density mediate membrane shape transitions. Nat Commun. 6, 5974 (2015).
- Chen, Z., Shi, Z., Baumgart, T. Regulation of membrane-shape transitions induced by I-BAR domains. Biophys J. 109 (2), 298-307 (2015).
- Cuvelier, D., Derenyi, I., Bassereau, P., Nassoy, P. Coalescence of membrane tethers: experiments, theory, and applications. Biophys J. 88 (4), 2714-2726 (2005).
- Derenyi, I., Julicher, F., Prost, J. Formation and interaction of membrane tubes. Phys Rev Lett. 88 (23), 238101 (2002).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Adv Colloid Interface Sci. 208, 225-234 (2014).
- Sorre, B., et al. Nature of curvature coupling of amphiphysin with membranes depends on its bound density. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 173-178 (2012).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Phys Rev Lett. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Capraro, B. R., Yoon, Y., Cho, W., Baumgart, T. Curvature sensing by the epsin N-terminal homology domain measured on cylindrical lipid membrane tethers. J Am Chem Soc. 132 (4), 1200-1201 (2010).
- Bo, L., Waugh, R. E. Determination of bilayer membrane bending stiffness by tether formation from giant, thin-walled vesicles. Biophys J. 55 (3), 509-517 (1989).
- Rossier, O., et al. Giant Vesicles under Flows: Extrusion and Retraction of Tubes. Langmuir. 19 (3), 575-584 (2003).
- Borghi, N., Rossier, O., Brochard-Wyart, F. Hydrodynamic extrusion of tubes from giant vesicles. EPL (Europhysics Letters). 64 (6), 837 (2003).
- Zhu, C., Das, S. L., Baumgart, T. Nonlinear sorting, curvature generation, and crowding of endophilin N-BAR on tubular membranes. Biophys J. 102 (8), 1837-1845 (2012).
- Ramesh, P., et al. FBAR syndapin 1 recognizes and stabilizes highly curved tubular membranes in a concentration dependent manner. Sci Rep. 3, 1565 (2013).
- Knorr, R. L., et al. Membrane morphology is actively transformed by covalent binding of the protein Atg8 to PE-lipids. PLoS One. 9 (12), e115357 (2014).
- Aimon, S., et al. Membrane shape modulates transmembrane protein distribution. Dev Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Prévost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. , (2015).
- Simunovic, M., et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), 11226-11231 (2016).
- Allain, J. M., Storm, C., Roux, A., Ben Amar, M., Joanny, J. F. Fission of a multiphase membrane tube. Phys Rev Lett. 93 (15), 158104 (2004).
- Morlot, S., et al. Membrane shape at the edge of the dynamin helix sets location and duration of the fission reaction. Cell. 151 (3), 619-629 (2012).
- Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).
- Simunovic, M., et al. Friction Mediates Scission of Tubular Membranes Scaffolded by BAR Proteins. Cell. 170 (1), 172-184 (2017).
- Simunovic, M., Lee, K. Y., Bassereau, P. Celebrating Soft Matter's 10th anniversary: screening of the calcium-induced spontaneous curvature of lipid membranes. Soft Matter. 11 (25), 5030-5036 (2015).
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Heinrich, M., Tian, A., Esposito, C., Baumgart, T. Dynamic sorting of lipids and proteins in membrane tubes with a moving phase boundary. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7208-7213 (2010).
- Dasgupta, R., Dimova, R. Inward and outward membrane tubes pulled from giant vesicles. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (28), 282001 (2014).
- Vitkova, V., Genova, J., Mitov, M. D., Bivas, I. Sugars in the aqueous phase change the mechanical properties of lipid mono- and bilayers. Molecular Crystals and Liquid Crystals. 449, 95-106 (2006).
- Bouvrais, H. Mechanical properties of giant vesicle membranes investigated by flickering technique. , University of Southern Denmark. (2011).
- Koster, G., Cacciuto, A., Derenyi, I., Frenkel, D., Dogterom, M. Force barriers for membrane tube formation. Phys Rev Lett. 94 (6), 068101 (2005).
- Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophys J. 35 (3), 637-652 (1981).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 28 (11), 693-703 (1973).
- Canham, P. B. The minimum energy of bending as a possible explanation of the biconcave shape of the human red blood cell. J Theor Biol. 26 (1), 61-81 (1970).
- Marcerou, J. P., Prost, J., Gruler, H. Elastic Model of Protein-Protein Interaction. Nuovo Cimento Della Societa Italiana Di Fisica D-Condensed Matter Atomic Molecular and Chemical Physics Fluids Plasmas Biophysics. 3 (1), 204-210 (1984).
- Leibler, S. Curvature Instability in Membranes. J Phys-Paris. 47 (3), 507-516 (1986).
