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Biology

खींच झिल्ली नैनोट्यूब से विशाल Unilamellar बुलबुले

Published: December 7, 2017 doi: 10.3791/56086
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,4, 1,5
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR168, 2Department of Genetics and Complex Diseases, T. H. Chan School of Public Health, Harvard Medical School, 3Department of Cell Biology, Harvard Medical School, 4Sorbonne Universités, UPMC University Paris 06, 5Center for Studies in Physics and Biology, The Rockefeller University
* These authors contributed equally

Summary

कोशिका भाव में कई प्रोटीन और झिल्ली वक्रता प्रेरित । हम एक विधि का वर्णन करने के लिए लिपिड बुलबुले से झिल्ली नैनोट्यूब खींचने के लिए प्रोटीन या किसी भी वक्रता में घुमावदार झिल्ली के साथ सक्रिय अणु की बातचीत का अध्ययन इन विट्रो।

Abstract

कोशिका झिल्ली का आकार कई सेलुलर घटनाएं, जैसे endocytosis, तस्करी, filopodia के गठन के एक अभिंन अंग है, आदि। कई अलग प्रोटीन क्योंकि उनके भावना या झिल्ली वक्रता को प्रेरित करने की क्षमता के घुमावदार झिल्ली के साथ संबद्ध । आमतौर पर, इन प्रक्रियाओं उंहें भी सेल में मात्रात्मक अध्ययन करने के लिए जटिल बनाने प्रोटीन की एक भीड़ शामिल है । हम इन विट्रो मेंएक घुमावदार झिल्ली का पुनर्गठन, एक घुमावदार सेलुलर संरचना, जैसे endocytic गर्दन नकल उतार के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । एक विशालकाय unilamellar पुटिका (गुव) एक कोशिका झिल्ली, जिसका आंतरिक दबाव और सतह तनाव micropipette आकांक्षा के साथ नियंत्रित कर रहे है के एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है । ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग कर गुव पर एक बिंदु खींच बल लगाने उच्च वक्रता एक समतल झिल्ली से जुड़ा के एक नैनोट्यूब बनाता है । इस विधि परंपरागत रूप से इस तरह के झुकने कठोरता के रूप में लिपिड झिल्ली के मौलिक यांत्रिक गुणों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हाल के वर्षों में, यह अध्ययन कैसे प्रोटीन झिल्ली वक्रता और जिस तरह से वे आकार और झिल्ली के यांत्रिकी को प्रभावित करने के साथ बातचीत का विस्तार किया गया है । एक micromanipulation, microinjection, ऑप्टिकल चिमटी, और फोकल माइक्रोस्कोपी के संयोजन प्रणाली झिल्ली वक्रता, झिल्ली तनाव, और प्रोटीन की सतह घनत्व, समवर्ती की माप की अनुमति देता है । इन मापनों से प्रोटीन-झिल्ली प्रणाली के कई महत्वपूर्ण यांत्रिक और रूपात्मक गुण अनुमानित किए जा सकते हैं. इसके अलावा, हम शारीरिक नमक एकाग्रता की उपस्थिति में GUVs बनाने का एक प्रोटोकॉल बाहर करना, और लेबल प्रोटीन और लिपिड के प्रतिदीप्ति तीव्रता से झिल्ली पर प्रोटीन की सतह घनत्व को बढ़ाता है की एक विधि ।

Introduction

कई सेलुलर प्रक्रियाओं, जैसे endocytosis, तस्करी, filopodia के गठन, संक्रमण, आदि, कोशिका झिल्ली1,2के आकार में एक नाटकीय परिवर्तन के साथ कर रहे हैं । कोशिका में, प्रोटीन की एक संख्या झिल्ली के लिए बाध्य और उनके आकार में फेरबदल करके इन प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं । सबसे उल्लेखनीय उदाहरण बिन/Amphiphysin/Rvs (बार) प्रोटीन परिवार के सदस्य हैं, एक विशेषता आंतरिक रूप से घुमावदार बार डोमेन3,4,5,6,7। आमतौर पर, वे सतह के लिए बार डोमेन का पालन करके झिल्ली के साथ बातचीत और, कई मामलों में, यह भी उथले bilayer में amphipathic helices डालने । आकार, आकार, और amphipathic helices की संख्या के साथ बार डोमेन के प्रभारी निर्धारित करता है: (1) झिल्ली वक्रता की दिशा (यानी, चाहे वे invaginations या दखलंदाजी प्रेरित करेंगे), और (2) झिल्ली की भयावहता वक्री५,८. नोट की, यहां सकारात्मक वक्रता घुमावदार झिल्ली के उत्तल पक्ष के रूप में परिभाषित किया गया है, यानी, बातचीत कण की ओर उभार, और अंयथा नकारात्मक । इसके अलावा, बार प्रोटीन के मात्रात्मक अध्ययन से पता चला कि झिल्ली पर उनके प्रभाव शारीरिक मापदंडों का एक सेट पर निर्भर करता है: प्रोटीन की सतह घनत्व, झिल्ली तनाव, और झिल्ली आकार (फ्लैट बनाम ट्यूबलर बनाम गोलाकार आकृति)7। इन मापदंडों पर निर्भर करता है बार प्रोटीन कर सकते हैं: (1) झिल्ली वक्रता के सेंसर के रूप में अधिनियम, (2) मोड़ झिल्ली, या (3) scission7प्रेरित ।

कोशिका में आकार देने वाली झिल्ली में शामिल घटकों की सरासर संख्या के कारण, इस तरह के endocytosis के रूप में घटना के मात्रात्मक पहलुओं का अध्ययन, vivo में बेहद चुनौतीपूर्ण है. इन विट्रो में न्यूनतम घटकों के पुनर्गठन के सेल में घुमावदार झिल्ली नकल उतारने के लिए कैसे झिल्ली-curving प्रोटीन संचालित की एक यंत्रवत समझ हासिल करने के लिए साधन प्रदान करता है । यह आलेख micromanipulation, फोकल माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग करके इन विट्रो में एक झिल्ली नैनोट्यूब का पुनर्गठन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक मात्रात्मक तरीके से, कैसे प्रोटीन, लिपिड, या छोटे अणुओं घुमावदार झिल्ली के साथ बातचीत. लिपिड GUVs एक कोशिका झिल्ली के मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है, जिसका वक्रता झिल्ली-curving अणुओं के आदान-प्रदान के आकार की तुलना में नगण्य है । वे electroformation विधि9 जिसमें बुलबुले एक लिपिड फिल्म जलयोजन द्वारा गठित कर रहे है और यह GUVs में एक बारी वर्तमान (एसी)10के तहत सूजन का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं । सबसे आम सब्सट्रेट जिस पर GUVs हो रहे हैं या तो अर्द्ध प्रवाहकीय इंडियम टिन ऑक्साइड (इतो) या प्लैटिनम तारों (पीटी-तारों)11के साथ लेपित प्लेटें हैं । इस काम में, GUVs पीटी तारों पर बड़े हो रहे है के रूप में इस पद्धति के लिए अधिक बफर में लवण की उपस्थिति में GUVs बनाने में विकल्प से बेहतर काम दिखाया गया है12। हालांकि electroformation प्रोटोकॉल यहां पर्याप्त विस्तार में वर्णित करने के लिए इसे पुन: पेश है, हम पिछले लेख जिसमें समान और GUVs बनाने के अंय तरीकों को विस्तार से वर्णन किया गया है13,14के लिए पाठक का उल्लेख । हमारे हाथ में, पीटी-तारों पर electroformation सफलतापूर्वक सिंथेटिक लिपिड के मिश्रण से या प्राकृतिक लिपिड अर्क से एक बफर युक्त में GUVs प्राप्त किया गया है ~ १०० mM NaCl. इसके अलावा, यह भी विकास के दौरान GUVs अंदर प्रोटीन encapsulate संभव था । एक उदाहरण electroformation कक्ष चित्र 1aमें दिखाया गया है; यह शामिल है दो ~ 10 सेमी लंबी पीटी-तारों polytetrafluoroethylene (PTFE) है कि ग्लास coverslips ~ 1-2 सेमी के अलावा(चित्र 1a) के साथ दोनों पक्षों पर सील किया जा सकता से बने धारक में डाला ।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक सेटअप. (क) पीटी-तारों से जुड़ी विद्युत connectors के साथ गुव electroformation चैम्बर. (ख) बाएं: प्रयोगात्मक प्रणाली माइक्रोस्कोप दिखा रहा है, उद्देश्य और दो micropipettes ऊपर प्रयोगात्मक चैंबर (बाएं और दाएं) micromanipulators से जुड़ी और ट्यूब पुलिंग और प्रोटीन के लिए प्रयोगात्मक चैंबर में डाला इंजेक्शन. ठीक है: आकांक्षा और इंजेक्शन micropipettes के सुझावों को दर्शाते हुए वस्तुस्थिति के ऊपर मुहिम चलाने वाले प्रयोगात्मक चैंबर का एक क्लोज-अप देखने को मिले । (ग) एक पतली मशीन के साथ सुसज्जित सिरिंज अपनी पीठ के अंत में एक micropipette में डाला । नीचे एक बंद-micropipette के अंदर मशीन के नीले बिंदीदार रेखा के साथ micropipette रूपरेखा को देखने के ऊपर है । इस प्रणाली के लिए कैसिइन के साथ micropipette भरने के लिए कांच की सतह passivate और भी खनिज तेल के साथ वापस भरने की जरूरत है जब प्रयोग किया जाता है । (D) प्रोटीन सॉल्यूशन की µ l मात्राओं को महाप्राण करने के लिए एक प्रणाली का प्रयोग किया जाता है । सुई एक सिरिंज से जुड़ा है और टयूबिंग जो इंजेक्शन micropipette से जुड़ा है करने के लिए । micropipette टिप ध्यान से प्रोटीन समाधान और aspirated में डूबे तो micropipette टिप को भरने के लिए है । micropipette तो वापस खनिज तेल से भरा पैनल सी में दिखाया प्रणाली का उपयोग कर रहा है कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक झिल्ली नैनोट्यूब, 7 एनएम से कई सौ एनएम के लिए त्रिज्या में लेकर, एक बाहरी बल द्वारा एक गुव से खींचा जा सकता है । इस विधि शुरू में ऐसे झुकने कठोरता15,16के रूप में कोशिका झिल्ली और बुलबुले, के लोचदार गुणों को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया था । सबसे हाल ही में काम करता है, विधि खींचा नैनोट्यूब7,17के पास प्रोटीन microinjecting द्वारा घुमावदार झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया गया था । झिल्ली-curving प्रोटीन के अध्ययन के लिए अन्य तरीकों को विकसित किया गया है । एक विधि में, प्रोटीन अलग आकार liposomes एक passivated सतह के लिए सीमित के साथ मशीन हैं । फोकल माइक्रोस्कोपी liposome व्यास के एक समारोह के रूप में प्रोटीन बाइंडिंग को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो वक्री प्रेरित18,19छँटाई संकेत कर सकते हैं । एक अंय विधि में, प्रोटीन एक सूक्ष्म aspirated गुव के पास इंजेक्शन के लिए उनके सहज नलिकाओं20,21प्रेरित करने की क्षमता को मापने के लिए कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि विशिष्ट endocytosis में शामिल झिल्ली-curving प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है, जहां आम तौर पर सबसे अधिक प्रोटीन के साथ माल युक्त झिल्ली invagination जोड़ने नैनोट्यूब के अनुरूप झिल्ली मुठभेड़ अंतर्निहित फ्लैट प्लाज्मा झिल्ली । इसके अलावा, इस विधि में, सीमित छोटे liposomes के साथ परख में विपरीत, झिल्ली नैनोट्यूब लगातार झिल्ली से जुड़ा हुआ है; इसलिए, यह गुव, एक स्थिति vivo मेंकी उंमीद के साथ यांत्रिक संतुलन में है । इसलिए, मौलिक झिल्ली भौतिकी लागू होता है और हम हमारे माप22,23,24से यांत्रिक गुणों के ढेर सारे अनुमान कर सकते हैं ।

इस विधि के एक पूर्ण कार्यांवयन के लिए, आवश्यक उपकरण एक फोकल माइक्रोस्कोप, ऑप्टिकल चिमटी, और एक या दो micropipettes एक पानी की टंकी (चित्र 1b) से जुड़ा शामिल है । सभी तीन के संयोजन से, यह एक साथ झिल्ली तनाव, झिल्ली वक्रता, प्रोटीन की सतह घनत्व, और ट्यूब बल25को मापने के लिए संभव है । Micropipette आकांक्षा आवश्यक है और यह आसानी से एक पानी की टंकी से जुड़े एक धारक में एक गिलास Micropipette डालने के द्वारा निर्माण किया है, जो, हीड्रास्टाटिक दबाव के माध्यम से, आकांक्षा दबाव26नियंत्रित करता है । micropipette और धारक एक micromanipulator द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं और, आदर्श रूप में, एक पीजो द्वारा एक दिशा में सटीक आंदोलन के लिए गति देनेवाला. एक नैनोट्यूब खींचने के लिए, microaspirated गुव संक्षेप में एक माइक्रोन के लिए अटक-मनका आकार तो दूर एक नैनोट्यूब बनाने खींच लिया है । इस कार्यान्वयन में, मनका ऑप्टिकल चिमटी द्वारा आयोजित किया जाता है, जो एक प्रकाशित प्रोटोकॉल का पालन करके बनाया जा सकता है27. यह ऑप्टिकल चिमटी का वितरण और विभिन्न तरीकों से नैनोट्यूब खींचने के लिए संभव है, सटीक बल माप की कीमत पर हालांकि. यदि यह भी एक ऑप्टिकल जाल का निर्माण या यदि बल माप आवश्यक नहीं हैं, जैसे कि अगर एक बस घुमावदार झिल्ली के लिए प्रोटीन की वरीयता की जांच करना चाहता है चुनौतीपूर्ण है, एक ट्यूब एक दूसरी micropipette की नोक पर एक मनका aspirated का उपयोग कर निकाला जा सकता है28। यह भी गुरुत्वाकर्षण बल29 या प्रवाह30,31का उपयोग कर ट्यूबों खींचने के लिए संभव है । इसके अलावा, फोकल माइक्रोस्कोपी आवश्यक भी नहीं है; हालांकि, यह प्रोटीन की सतह घनत्व को मापने के लिए तो पसंद है । यह भी ट्यूब में लिपिड के प्रतिदीप्ति तीव्रता से नैनोट्यूब त्रिज्या को मापने की अनुमति देता है, इस प्रकार झिल्ली बल और तनाव के स्वतंत्र रूप से. प्रतिदीप्ति से ट्यूब त्रिज्या को ठीक करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि इन मात्राओं के बीच संबंध झिल्ली-पालन प्रोटीन की उपस्थिति के कारण अच्छी तरह से स्थापित समीकरणों से विचलित25। महत्वपूर्ण बात, एक दोनों ऑप्टिकल जाल और फोकल माइक्रोस्कोपी के वितरण नहीं कर सकते, क्योंकि यह ट्यूब वक्रता को मापने के लिए संभव नहीं होगा ।

विधि के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित वक्रता अध्ययन नैनोट्यूब पर विभिंन परिधीय झिल्ली प्रोटीन की छंटाई प्रेरित किया गया है, ज्यादातर बार परिवार25,३२,३३,३४ . यह भी दिखाया गया है कि शंकु के आकार का transmembrane पोटेशियम चैनल KvAP पट्टी प्रोटीन के रूप में एक ही रास्ते में घुमावदार नैनोट्यूब पर समृद्ध है३५. GUVs के अंदर प्रोटीन encapsulate करने के लिए विधि का अनुकूलन करके, नकारात्मक वक्रता के साथ प्रोटीन की बातचीत हाल ही में अच्छी तरह से३६की जांच की गई है । इसके अलावा, इस विधि के लिए प्रोटीन पाड़25,३७ के गठन स्पष्ट और या तो लाइन तनाव३८, प्रोटीन dynamin३९, या पट्टी से झिल्ली scission के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रोटीन्स४०,४१. प्रोटीन के अलावा, छोटे अणुओं या आयनों भी वक्रता पैदा कर सकता है । इस विधि का प्रयोग, कैल्शियम आयनों के लिए नमक से सकारात्मक वक्रता प्रेरित दिखाया गया है४२। दिलचस्प है, यह भी दिखाया गया है कि लिपिड वक्रता छँटाई से गुजरना कर सकते हैं, हालांकि केवल रचनाओं है कि एक मिश्रण बिंदु के पास हैं के लिए४३,४४. संक्षेप में, विधि कैसे या तो अभिंन झिल्ली घटकों (जैसे, लिपिड या transmembrane प्रोटीन) या बाह्य रूप से बाध्यकारी अणुओं (या तो अंदर या बाहर GUVs) के साथ बातचीत की जांच में रुचि शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता बेलनाकार घुमावदार झिल्ली, देखने के यांत्रिक और मात्रात्मक बिंदुओं से । यह भी झिल्ली ही22,23,४५के यांत्रिक गुणों को मापने में रुचि रखने वालों के लिए करना है ।

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Protocol

1. पीटी-तारों पर Electroformation द्वारा GUVs की तैयारी

  1. electroformation चैंबर को साफ ( परिचय और चित्र 1aदेखें) और एक कार्बनिक विलायक जैसे इथेनॉल या एसीटोन के साथ पीटी तारों को दूर करने के लिए लिपिड और पानी के साथ दूर नमक धोने के लिए ।
    नोट: हम अच्छी तरह से दूर इथेनॉल से लथपथ ऊतक के साथ अवशेष पोंछते सुझाव तो एसीटोन में sonicating, इथेनॉल, तो पानी, 5 मिनट के लिए प्रत्येक ।
  2. क्लोरोफॉर्म में 1 मिलीग्राम/एमएल में एक वांछित लिपिड संरचना के एक लिपिड मिश्रण तैयार करें । मिश्रण में बायोटिन के साथ एक लिपिड संयुग्मित के ~ ०.०५% दाढ़ अंश शामिल होना चाहिए (उदा, 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl (polyethyleneglycol)-२०००]) और ~ ०.५% दाढ़ अंश एक लिपिड संयुग्मित के साथ एक fluorophore ( उदा, BODIPY-TR-C5-ceramide).
    नोट: हमारे अनुभव में, यह एक उच्च 30% से अधिक से युक्त उपज में GUVs उत्पादन मुश्किल था लिपिड आरोप लगाया ।
    चेतावनी: क्लोरोफॉर्म एक रासायनिक उपयुक्त दस्ताने पहने हुए हुड के अंदर नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
  3. electroformation कक्ष में पीटी-तारों की एक जोड़ी डालें । में पीटी-तारों पर लिपिड मिश्रण जमा ~ 2-3 mm द्वारा अलग (कुल ~ 4 मिश्रण के µ एल) बूंदें ।
  4. कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए वैक्यूम के तहत तारों को सुखाएं ।
  5. चैंबर सिलिकॉन तेल का उपयोग कर पर coverslip का पालन करके चैंबर के नीचे सील । NaCl, सुक्रोज, और एक बफ़रिंग एजेंट (उदा, ७० mm NaCl, १०० mm सुक्रोज, और 10 mm Tris, pH ७.४) वाले बफ़र्ड समाधान के साथ चैंबर भरें । प्रयोग में GUVs के अंदर यह माध्यम होगा । यह आवश्यक है कि इस माध्यम के osmolarity का मिलान प्रयोगात्मक माध्यम के osmolarity के भीतर ~ 10% हो । osmolarity को एडजस्ट करने के लिए सुक्रोज का प्रयोग करें । एक वांछित एकाग्रता में समाधान के लिए प्रोटीन जोड़ें यदि लक्ष्य उंहें GUVs में encapsulate है ।
    चेतावनी: बफर में विभिन्न लवण और शर्करा झुकने कठोरता और झिल्ली की सहज वक्रता को प्रभावित कर सकते हैं24,४२,४६,४७.
  6. चैंबर के अंदर न्यूनतम हवा सुनिश्चित करने सिलिकॉन तेल के साथ एक coverslip का पालन करके चैंबर के शीर्ष सील । ५०० हर्ट्ज और २८० एमवी पर पीटी-तारों के माध्यम से एक साइन एसी वर्तमान लागू करें ।
    नोट: वृद्धि समय और तापमान लिपिड संरचना और प्रोटीन की संवेदनशीलता के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए । जब प्राकृतिक लिपिड निष्कर्षों का उपयोग कर, और भी जब GUVs में प्रोटीन encapsulating, सबसे अच्छी उपज 4 डिग्री सेल्सियस पर GUVs बढ़ती रातोंरात द्वारा प्राप्त किया गया था । प्रोटीन के अभाव में, और सिंथेटिक लिपिड रचनाओं के लिए, ~ 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर विकास पर्याप्त था ।

2. प्रायोगिक चैंबर और Micropipettes की तैयारी

  1. micropipettes तैयार करने के लिए, एक पिपेट खींचने का उपयोग कर एक गिलास केशिका खींचो । यह क्रमशः, ०.७ मिमी और 1 मिमी के आंतरिक और बाह्य radii के साथ एक ग्लास केशिका का उपयोग करने के लिए सुझाव दिया है । फिर, micropipette की नोक को परिष्कृत करें ताकि उसके भीतरी व्यास 5–7 µm, एक microforge का उपयोग करके । यदि प्रोटीन या अंय अणुओं प्रयोग में इंजेक्ट किया जाएगा, एक और micropipette खींचो और 8 के एक भीतरी व्यास को अपनी टिप परिष्कृत-15 µm ।
  2. एक धातु के आधार पर दो आयताकार माइक्रोस्कोपी coverslips रखकर एक प्रयोगात्मक चैंबर का निर्माण चित्र 1में दिखाया गया है । coverslips ~ 1 मिमी से अलग किया जाना चाहिए । चैंबर के लंबे किनारों के साथ उद्घाटन होना चाहिए ( चित्रा 1देखें). खुले पक्षों micropipette की नोक जहां टिप तक पहुंचना चाहिए फिट कम चैंबर के केंद्र में होना चाहिए ।
  3. प्रायोगिक बफ़र जिसकी osmolarity से अधिक 10% से GUVs बढ़ने के लिए उपयोग किया गया बफ़र से अलग नहीं करना चाहिए तैयार करें । ग्लूकोज के साथ osmolarity समायोजित करें । नैनोट्यूब के साथ endophilin की बातचीत का अध्ययन करने में इस्तेमाल किया गया था कि एक प्रयोगात्मक बफर का एक उदाहरण १०० मिमी NaCl, ४० मिमी ग्लूकोज, ७.४ पीएच करने के लिए Tris के साथ बफर है. सुक्रोज अंदर/ग्लूकोज बाहर का एक संयोजन सुनिश्चित करता है: (एक) उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ GUVs का पालन करने के लिए पर्याप्त चरण कंट्रास्ट, और (ख) GUVs के अंदर उच्च घनत्व जो उन्हें चैंबर के तल पर बसने के लिए कारण बनता है. प्रयोगात्मक आवश्यकता के आधार पर नमक एकाग्रता समायोजित करें ।
    नोट: झिल्ली की यांत्रिक गुणों को प्रभावित करने के अलावा, हमारे अनुभव में, उच्च ग्लूकोज एकाग्रता (> ३०० मिमी) नकारात्मक streptavidin-बायोटिन बांड की स्थापना को प्रभावित करता है, एक नैनोट्यूब खींचने के लिए आवश्यक. इसके अलावा, बहुत कम नमक streptavidin-बायोटिन बांड को रोकता है, जबकि बहुत अधिक एकाग्रता स्क्रीन प्रोटीन-झिल्ली बातचीत । प्रोटीन encapsulation के मामले में, बाहरी बफर में बहुत उच्च नमक एकाग्रता का उपयोग (उदा., > 200 mM NaCl) बाहरी पत्रक३६से प्रोटीन अलग करने के लिए एक चाल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । यह नमक एकाग्रता की एक सीमा के साथ प्रयोग करने के लिए ब्याज की अणु की इष्टतम बाध्यकारी शर्तों को खोजने के लिए आवश्यक है ।
  4. 30-60 मिनट के प्रयोग के लिए GUVs इकट्ठा करने से पहले, passivate दोनों प्रयोगात्मक चैंबर और आकांक्षा micropipette भरने के द्वारा गिलास सतहों एक उच्च शुद्ध β-कैसिइन के एक 5 मिलीग्राम/एमएल समाधान (उदा, प्रयोगात्मक बफर में भंग) । β-कैसिइन कांच सतहों पर एक सुरक्षात्मक परत बनाता है, GUVs को रोकने के लिए भी दृढ़ता से, जो उन्हें फट करने के लिए कारण होता है । 30-60 मिनट के लिए β-कैसिइन के साथ मशीन ।
    नोट: झिल्ली तनाव को नियंत्रित करने के साथ हस्तक्षेप होता है कि micropipette के अंदर कोई बुलबुले होना चाहिए.
    1. micropipettes भरने के लिए एक मशीन का निर्माण करने के लिए, एक सिरिंज सुई बंद प्लास्टिक संबंधक और गोंद में यह एक पतली सिलिका केशिका (जैसे तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए इस्तेमाल किया उन के रूप में) (चित्रा 1C) तोड़ने.
  5. β-कैसिइन के साथ मशीन के दौरान, माइक्रोस्कोप पर चैंबर माउंट और यह उद्देश्य से ऊपर केंद्र. लंबी धार के साथ खोलने के माध्यम से आकांक्षा micropipette की नोक डालें और माइक्रोस्कोप उद्देश्य के ऊपर टिप ले आओ । ताकि आकांक्षा दबाव शूंय के पास है पानी की टंकी के स्तर को समायोजित करें (वहां में या बाहर पिपेट, जो खुर्दबीन के नीचे देखा जा सकता है में कोई भारी प्रवाह होना चाहिए) ।
  6. मामले में प्रोटीन या अंय अणुओं प्रयोग के दौरान इंजेक्ट किया जाएगा, पसंद की एकाग्रता पर प्रयोगात्मक बफर में भंग वांछित अणु के साथ इंजेक्शन micropipette भरने, एक micromanipulator के अंदर micropipette माउंट, और प्रयोगात्मक कक्ष के विपरीत पक्ष के माध्यम से डालें ।
    1. प्रोटीन की एक ंयूनतम राशि का उपयोग करने के लिए, आकांक्षा द्वारा प्रोटीन के साथ केवल micropipette टिप भरें । ऐसा करने के लिए, प्लास्टिक टयूबिंग के साथ एक सिरिंज से जुड़ी एक सुई के अंत लपेटो. इंजेक्शन micropipette के पीछे में टयूबिंग डालें ।
    2. बहुत ध्यान से प्रोटीन समाधान में micropipette की नोक विसर्जित कर दिया और यह micropipette की नोक को भरने के लिए महाप्राण ।
      नोट: यह सरल सेटअप चित्र 1 d में दिखाया गया है और, हमारे अनुभव में, यह प्रोटीन समाधान के कुछ µ एल के रूप में के रूप में छोटे से aspirating की अनुमति देता है ।
    3. प्रोटीन सॉल्यूशन के मिश्रण और पानी की टंकी से पानी को रोकने के लिए मिनरल ऑइल के साथ इंजेक्शन micropipette के बाकी Backfill ( फिगर 1Cमें सेटअप का प्रयोग करना) ।
    4. यह अस्थिर इंजेक्शन दबाव पैदा करेगा के रूप में, इंजेक्शन पिपेट में हवा के बुलबुले परिचय नहीं करने के लिए ध्यान रखना । वैकल्पिक रूप से, यदि प्रोटीन मात्रा पर्याप्त है, प्रोटीन के साथ micropipette भरने के रूप में β-कैसिइन चरण २.४ में वर्णित के रूप में भरने के रूप में उसी तरह । इंजेक्शन पिपेट में आकांक्षा दबाव को कम करने के लिए पानी के टैंक स्तर को समायोजित करें ।
      नोट: नैनोट्यूब के पास इंजेक्ट किए गए अणु या आयन की एकाग्रता कमजोर पड़ने के कारण कम हो रही है और यह पिपेट निकास४२से दूरी के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता घटने को मापने से अनुमान लगाया जा सकता है. यह है लेकिन अधिक महत्वपूर्ण है bilayer को पता है, इंजेक्शन अणु का घनत्व, जो ठीक मापा जा सकता है (4 अनुभाग देखें) ।
  7. β-कैसिइन के साथ मशीन के बाद, चैंबर से समाधान निकालें, और प्रयोगात्मक बफर कई बार के साथ कुल्ला । प्रयोगात्मक बफर के साथ भरें ।
  8. GUVs की electroformation रोकें और उन्हें सीधे पीटी-तारों से इकट्ठा करें. प्रयोगात्मक कक्ष के लिए गुव समाधान के कुछ µ एल जोड़ें । केवल हौसले से तैयार GUVs का ही प्रयोग करें ।
  9. लगभग ०.१ x 10− 3 % (w/v) या उससे कम पर कक्ष में मोतियों की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रयोगात्मक कक्ष के लिए streptavidin-लेपित मोतियों की कुछ µ एल जोड़ें । Polystyrene मोती ~ व्यास में 3 µm (पानी में Polystyrene मोतियों की सिफारिश कर रहे है के साथ एक निकट इष्टतम अपवर्तन सूचकांक विपरीत है ऑप्टिकल जाल में तितर बितर बल के संबंध में ढाल बल अधिकतम करने का संबंध है) । मनका एकाग्रता प्रयोग के आधार पर समायोजित किया जा सकता है: एक बहुत कम एकाग्रता यह मुश्किल उन्हें चैंबर में खोजने के लिए बनाता है, और एक बहुत उच्च एकाग्रता ऑप्टिकल चिमटी में गिरने कई मोतियों के जोखिम को चलाता है.

3. एक गुव से एक झिल्ली नैनोट्यूब खींच

  1. GUVs और मोतियों को चैंबर के नीचे तक बसा दो. प्रयोगात्मक बफर के एक छोटे दे द्वारा GUVs खंडन करना लगभग ~ 15 मिनट के लिए, GUVs inflating कुछ अतिरिक्त क्षेत्र है कि micropipette के साथ aspirated किया जा सकता है उत्पादन के लिए आवश्यक है । GUVs दिख unलहरदार (यानी, फ्लॉपी दिखाई चाहिए) प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत । अगर वे तनाव दिखाई देते हैं, और वाष्पीकरण समय के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: osmolarity परिवर्तन दर वाष्पीकरण सतह क्षेत्र पर निर्भर करता है, तापमान, आदि, और बारीकी से नजर रखी जानी चाहिए । सिद्धांत रूप में, osmolarity अंतर सुक्रोज/ग्लूकोज एकाग्रता का समायोजन करके शुरू से ही सेट किया जा सकता है, तथापि, देखभाल के लिए एक परासरणी सदमे प्रेरित नहीं लिया जाना चाहिए ।
  2. एक फ्लॉपी गुव ढूंढें और यह पिपेट में महाप्राण । आकांक्षा जीभ की लंबाई (पिपेट के अंदर की झिल्ली का हिस्सा) सैद्धांतिक विश्लेषण के लिए पिपेट त्रिज्या से बराबर या बड़ा होना चाहिए पर लागू होने के लिए15,16,22,23 ( चित्र 2) । कई GUVs का प्रयास करें । यदि GUVs में से कोई भी एक लंबे समय तक पर्याप्त जीभ का उत्पादन aspirated जा सकता है, कुछ और मिनट रुको । यदि GUVs पर्याप्त फ्लॉपी हैं, अगले कदम के लिए आगे बढ़ें ।
  3. खनिज तेल के साथ चैंबर सील, बफर के आगे वाष्पीकरण को रोकने के लिए । ऐसा ध्यान से प्रयोगात्मक कक्ष के खुले किनारों के साथ तेल pipetting ।
  4. आकांक्षा दबाव की शूंय स्थिति सेट करने के लिए, पहले, चैंबर में एक मनका के लिए देखो और मनका के पास आकांक्षा पिपेट निकास की स्थिति । पानी की टंकी की ऊंचाई इतनी है कि मनका न तो में चूसा है और न ही दूर आकांक्षा पिपेट द्वारा उड़ा समायोजित करें । हालांकि खनिज तेल वाष्पीकरण रोकता है और इसलिए आगे के दबाव चैंबर के अंदर परिवर्तन, प्रत्येक गुव को मापने से पहले शूंय आकांक्षा दबाव ।
  5. एक गुव का पता लगाएं और इसे महाप्राण । micropipette ऊपर ले जाएं और ध्यान से बाहर (गुव रखने के लिए सतह से दूर जहां यह कतरनी तनाव से पिपेट से बाहर खींचा जा सकता है जब चैंबर ले जाया गया है) ।
  6. ध्यान से चैंबर के चारों ओर बढ़ द्वारा एक मनका के लिए देखो । अचानक चालें गुव बाहर निकाल सकते हैं । यह एक दूरी पर ऑप्टिकल चिमटी के साथ जाल ~ 20 µm दूर चैंबर तल से । सुनिश्चित करें कि ब्याज का क्षेत्र कोई अंय मोतियों या दृष्टि में झिल्ली के साथ साफ है । कुछ भी ऑप्टिकल चिमटी मनका के अलावा अंय में गिरने माप बाधित होगा ।
  7. गुव वापस ध्यान में लाने के लिए, और micropipette के साथ मनका से दूर ऑप्टिकल ट्रैप (चित्रा 2) के साथ गठबंधन.
  8. 1 के लिए मनका के आंदोलन रिकॉर्ड-2 मिनट के लिए संतुलन की स्थिति को मापने के लिए (बल माप के लिए आवश्यक) ।
  9. micropipette के अंदर दबाव को कम करने के लिए जितना संभव हो गुव खोने के लिए इतना झिल्ली तनाव में कमी के बिना । ध्यान से एक दूसरे के आसपास के लिए मनका के साथ संपर्क में गुव लाने के लिए, streptavidin-बायोटिन बांड की स्थापना, तो धीरे एक नैनोट्यूब बनाने वापस खींच । गुव की ओर या मनका से दूर की गति को आदर्श रूप में एक पीजो के साथ किया जाना चाहिए ंयूनतम ऑप्टिकल चिमटी में मनका बाधित करने के लिए ।
    नोट: यदि नैनोट्यूब फार्म नहीं है, यह मनका के गरीब streptavidin कोटिंग के कारण हो सकता है, गुव में biotinylated लिपिड की अपर्याप्त मात्रा, नमक या प्रयोगात्मक बफर में ग्लूकोज की अत्यधिक एकाग्रता की अपर्याप्त एकाग्रता, या झिल्ली गुव में तनाव बहुत अधिक है४८।
  10. आकांक्षा दबाव बढ़ाएं तो आकांक्षा जबान को बहलाना. आकांक्षा पिपेट की धुरी में झूठ करने के लिए ट्यूब संरेखित करें और अधिक से अधिक ट्यूब (चित्रा 2) पर ध्यान केंद्रित ।
  11. सुनिश्चित करें कि गुव भूमध्य रेखा और ट्यूब ध्यान में हैं । कुछ मिनट के लिए उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ मनका के आंदोलन रिकॉर्ड (यहाँ, कैमरा अधिग्रहण की गति 30 हर्ट्ज है). ऊंचाई रिकॉर्ड, शूंय स्थिति के संबंध में पानी की टंकी के एच। सिस्टम (चित्रा 2) के कुछ फोकल छवियों ले लो ।
  12. अलग आकांक्षा दबाव पर पिछले कदम दोहराएं, स्पष्टतः झिल्ली तनाव । ठेठ तनाव रेंज 0.015 है-0.2 mn/एम, चारों ओर एक कदम आकार के साथ ०.०२ mn/
  13. अगर प्रोटीन या सिस्टम के पास अणुओं इंजेक्शन, नैनोट्यूब के पास इंजेक्शन micropipette लाने के लिए सुनिश्चित करें कि ऑप्टिकल जाल में मनका परेशान नहीं है । धीरे 1 के आसपास के दबाव में इंजेक्षन-2 Pa.
  14. प्रोटीन बाइंडिंग के बाद equilibrated (झिल्ली पर इंजेक्शन प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता गुव पर स्थिर रहता है), नंगे झिल्ली (कदम ३.११ और ३.१२) के साथ के रूप में कदम वार माप दोहराएँ ।
    नोट: के बाद से माप प्रदर्शन कर रहे हैं, जबकि लगातार दबाव में गुव के पास प्रोटीन इंजेक्शन, प्रोटीन के थोक एकाग्रता गुव के पास मोटे तौर पर अपरिवर्तित रहता है; इस प्रकार माप के दौरान प्रोटीन desorption नगण्य होना चाहिए ।
    1. वैकल्पिक रूप से, यह ट्यूब एक निरंतर प्रोटीन थोक एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगों खींच प्रदर्शन से पहले प्रोटीन के साथ एक साथ GUVs गर्मी संभव है. यह देखते हुए कि ट्यूब पर और गुव पर प्रोटीन के सापेक्ष झिल्ली अंश मापा जाता है, जिस तरह से प्रोटीन वितरित कर रहे हैं वक्रता छँटाई गणना को प्रभावित नहीं करता (अनुभाग 4 देखें).

Figure 2
चित्र 2: ट्यूब-पुलिंग प्रयोग. (A) प्रयोग की योजनाबद्धता । (B) इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में खींची गई ट्यूब की एक फोकल छवि । स्केल बार = 2 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

4. माप और डेटा विश्लेषण

  1. झिल्ली तनाव मापने
    1. लगातार आकांक्षा दबाव में प्रत्येक कदम के लिए हीड्रास्टाटिक दबाव की गणना:
      ΔP = pgh
      जहां पी पानी घनत्व, जी गुरुत्वाकर्षण त्वरण, और चरण ३.११ से पानी की टंकी की ऊंचाई एच है ।
    2. फोकल छवियों से, गुव की त्रिज्या को मापने, आरगुव, और आकांक्षा पिपेट के त्रिज्या, rरंज (चित्रा 2) ।
    3. झिल्ली तनाव की गणना, σ, लाप्लास के समीकरण का उपयोग कर४९:
      Equation 1
  2. झिल्ली बल मापने
    1. ऑप्टिकल चिमटी की कठोरता का निर्धारण, कश्मीर, कई अंशांकन तरीकों में से एक का उपयोग करके27. इस सेटअप में, चिपचिपा खींचें विधि27का उपयोग k माप ।
    2. मनका, एक0के संतुलन की स्थिति की गणना, ट्यूब खींचने से पहले एक माप से एक औसत के रूप में (३.८ कदम) ।
    3. प्रत्येक लगातार तनाव माप के लिए, हूक के कानून से संतुलन झिल्ली बल, चकी गणना:
      F = k(a - a0)
      जहां a उस माप के दौरान मनका की औसत स्थिति है ।
  3. ट्यूब त्रिज्या को मापने
    1. एक नंगे झिल्ली के मामले में (कोई जोड़ा झिल्ली-curving अणुओं), ट्यूब त्रिज्या की गणना, आर, के रूप में बल से:
      R = F/(4πσ)
      (सन्दर्भ२२,२३).
    2. झिल्ली-curving अणुओं की उपस्थिति में ट्यूब त्रिज्या को मापने के लिए और स्वतंत्र रूप से कदम 4.3.1, पहले, ट्यूब लंबाई के साथ लिपिड प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्ड, मैंटब, और गुव समोच्च साथ, मैंगुव. एक ट्यूब या एक गुव समोच्च के प्रतिभाशाली लाइन के साथ एक औसत तीव्रता के रूप में एक fluorophore में या झिल्ली के लिए बाध्य औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने । गुव समोच्च या ट्यूब के एक क्षैतिज खंड वाले एक आयताकार बॉक्स का चयन करें और बॉक्स में प्रत्येक क्षैतिज रेखा के प्रतिदीप्ति तीव्रता के योग की गणना ।
      1. प्रत्येक योग को क्षैतिज रेखा के पिक्सल की संख्या से विभाजित करें (अर्थात, बॉक्स चौड़ाई) । ध्यान दें कि चयनित बॉक्स में, वहां कोई अंय झिल्ली मौजूद होना चाहिए । चयनित बॉक्स की लंबाई के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल प्राप्त की है ।
      2. पृष्ठभूमि तीव्रता को घटाकर के बाद, सबसे प्रतिभाशाली लाइन से औसत पिक्सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता ले । ट्यूब त्रिज्या रैखिकता के रूप में ट्यूब के समोच्च और गुव के साथ प्रतिदीप्ति के अनुपात से संबंधित है:
        R = Kटबiटब/मैंगुव
        जहां Kटब एक अंशांकन कारक25है ।
        नोट: इस विधि के लिए 10-80 एनएम रेंज में ट्यूब त्रिज्या को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जब ट्यूब काफी संकीर्ण है एक फोकल voxel चौड़ाई के भीतर झूठ) और ८० एनएम और उच्च श्रेणी में कुछ अधिक अनिश्चितता के साथ । माप की संवेदनशीलता सेटअप पर निर्भर करता है ।
    3. कदम 4.3.1 में स्वतंत्र त्रिज्या माप प्रदर्शन और एक सरल झिल्ली uncharged लिपिड का उपयोग कर संरचना पर 4.3.2 द्वारा Kटब निर्धारित करें । इस तरह की सरल झिल्ली रचना यह सुनिश्चित करती है कि त्रिज्या और बल के चरण 4.3.1 में दिया गया सरल संबंध है. प्रयोग को कई बार दोहराएं और आर, मुजे बल से (step 4.3.1) बनाम iटब/मैंगुव (step 4.3.2)/ फिट से कश्मीरटब की गणना । इस सेटअप में, Kटब = २०० ± ५० एनएम का उपयोग करके अंडा एल-α-phosphatidylcholine (अंडा-पीसी) झिल्ली और एक फ्लोरोसेंट लिपिड जिसका प्रतिदीप्ति ंयूनतम ध्रुवीकरण25पर निर्भर करता है ।
      नोट: कश्मीरटब अलग उद्देश्यों के लिए मापा जाना चाहिए, उनके विभिंन फोकल voxel संस्करणों के कारण । लिपिड fluorophore इंजेक्शन प्रोटीन/अणुओं के साथ बातचीत नहीं करनी चाहिए । फ्लोरोसेंट लिपिड यहां की सिफारिश की, BODIPY TR ceramide, प्रोटीन के साथ कोई बातचीत की उंमीद नहीं है । इस धारणा बार और मैं बार के पिछले अध्ययनों के साथ की पुष्टि की थी,25,३६,३७, जो कि उच्च प्रोटीन की सतह कवरेज पर दिखाया गया है, ट्यूब त्रिज्या प्रोटीन द्वारा तय की है, चाहे गुव में तनाव । यदि प्रोटीन लिपिड fluorophore के साथ बातचीत, एक कमी या fluorophore के संवर्धन विभिंन उच्च प्रोटीन सतह भागों में ट्यूब में मनाया जाएगा ।
  4. प्रोटीन की सतह घनत्व को मापने
    1. एक सरल uncharged लिपिड (जैसे, अंडा-पीसी) एक फ्लोरोसेंट लिपिड के बारे में पांच अलग तिल भागों के साथ पूरक (प्रोटीन लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया डाई के रूप में एक ही तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर घोला जा सकता है, उदा. BODIPY-FLC5-hexadecanoyl-phosphatidylcholine (एचपीसी *) के लिए उदा., Alexa488-लेबल्ड प्रोटीन) श्रेणी में: Xएचपीसी * = 0.01 – 1% । इतो प्लेट्स पर electroformation द्वारा १०० mM सुक्रोज में GUVs तैयार करें (पिछले एक प्रकाशन13के चरण 1 का पालन करे) ।
    2. GUVs लीजिए और β-कैसिइन के साथ एक प्रयोगात्मक चैंबर passivated के लिए स्थानांतरण । प्रायोगिक समाधान के लिए उदा, १०० mM ग्लूकोज़ का प्रयोग करें । GUVs को व्यवस्थित करने के लिए कुछ मिनटों तक प्रतीक्षा करें ।
    3. GUVs के फोकल प्रतिदीप्ति छवियों को ले लो और फ्लोरोसेंट लिपिड के तिल अंश के एक समारोह के रूप में गुव आकृति के साथ औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्ड (कदम 4.3.2 देखें) । प्रत्येक संरचना के लिए, फ्लोरोसेंट लिपिड के क्षेत्र घनत्व की गणना, φएचपीसी*। उदाहरण के लिए, यह मानते हुए कि लिपिड प्रति क्षेत्र ०.७ एनएम2, φएचपीसी* = १.४३ x 106 xएचपीसी * प्रति पत्रक है । प्लाट एचपीसी * गुव मे प्रतिदीप्ति तीव्रता, Iएचपीसी *, गुव, बनाम φएचपीसी*. फ़िट अंशांकन स्थिरांक देता है, A, φएचपीसी* = एअर इंडियाएचपीसी *, गुवद्वारा दिया गया । एक इस तरह के लेजर शक्ति और डिटेक्टर संवेदनशीलता (यानी, लाभ) के रूप में माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स, पर निर्भर करताहै, इसलिए विभिन्न आमतौर पर इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के लिए एक रिकॉर्ड ( चित्रा 3में उदाहरण देखें).
    4. एचपीसी के कई समाधान तैयार * डिटर्जेंट में भंग, जैसे, सोडियम dodecyl-सल्फेट (एसडीएस), से रेंज में अलग सांद्रता में ~ 1 10-50 µ m. रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति तीव्रता के प्रत्येक समाधान के थोक में और तीव्रता की ढलान की गणना बनाम एकाग्रता (चित्रा 3) । fluorophore है कि एक समान एकाग्रता रेंज में प्रोटीन के लिए संयुग्मित किया जाएगा के साथ माप दोहराएँ ( चित्रा 3में Alexa488 के साथ उदाहरण देखें) । इस माप प्रोटीन लेबल और लिपिड लेबल के प्रतिदीप्ति तीव्रता से संबंधित करने के लिए आवश्यक है, मैंA488, थोक / iएचपीसी *, थोक, के रूप में वे जरूरी एक ही थोक एकाग्रता में एक ही तरह से उत्सर्जन नहीं हो सकता है ।
    5. एक fluorospectrometer का उपयोग प्रोटीन अणु प्रति fluorophores की संख्या को मापने । उदाहरण के लिए, Alexa488 के मामले के लिए, प्रोटीन प्रति Alexa488 अणुओं की संख्या, nA488, निंनलिखित संबंध का उपयोग कर की गणना की जा सकती है:
      न A488 = (a४९४/εa४८८)/((a२८० -०.११A४९४)/εprot)
      जहां एक४९४ और एक२८० प्रति इकाई लंबाई ४९४ एनएम और २८० एनएम, क्रमशः में अवशोषित मान रहे हैं, और εएक४८८ और εprot Alexa488 के आणविक अवशोषण गुणांक है और प्रोटीन, क्रमशः ।
    6. गुव पर प्रोटीन की सतह घनत्व की गणना, φprot, गुव, निम्न सूत्र के अनुसार:
      Equation 2
      प्रोटीन की बहुलकीकरण स्थिति का ध्यान रखें । उदाहरण के लिए, बार प्रोटीन dimerize, इसलिए परिकलित घनत्व होगा कि क्षेत्र के प्रति बार मोनोमर अगर monomeric फार्म के विलुप्त होने गुणांक का उपयोग कर ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रोटीन की सतह घनत्व अंशांकन का एक उदाहरण । मापा थोक में एचपीसी * लिपिड प्रतिदीप्ति तीव्रता (बाएं) और GUVs (केंद्र) में हैं । इसके अलावा, मापा Alexa488 के थोक प्रतिदीप्ति तीव्रता (एक बार डोमेन के लिए बाध्य) (सही) हैं । प्रतिदीप्ति तीव्रता रैखिक एकाग्रता के साथ तराजू । दिखाया माप विशिष्ट पहचान लाभ और लेजर बिजली उत्पादन के लिए कर रहे हैं । संदर्भ३७से डेटा के आधार पर जनरेट किए गए प्लॉट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Representative Results

ट्यूब-पुलिंग प्रयोग झिल्ली के बारे में महत्वपूर्ण यांत्रिक जानकारी दे सकता है । प्रोटीन या अन्य अणुओं के अभाव में है कि झिल्ली वक्रता के साथ जोड़ी, झिल्ली बल और ट्यूब त्रिज्या Canham-Helfrich Hamiltonian समीकरण एक ट्यूब के लिए लागू करने के द्वारा झिल्ली तनाव के साथ संबंधित किया जा सकता है एक गुव५०,५१

Equation 3(समीकरण 1)

जहां ट्यूब की झिल्ली मुक्त ऊर्जा है, कश्मीर झिल्ली झुकने कठोरता, आर और Equation 4 आर0 , क्रमशः, मतलब और वक्रता के सहज radii, σ झिल्ली तनाव, ट्यूब के क्षेत्र एक , एल ट्यूब की लंबाई, और एफ बिंदु बल मनका पर ट्यूब द्वारा लागू । संतुलन में, आर ट्यूब त्रिज्या है, आरके रूप में चिह्नित, और च ट्यूब-कर्षण बल, एफ, यानी, संतुलन बल जिसके द्वारा ट्यूब ऑप्टिकल जाल में मनका खींच रहा है हो जाता है । एफ और आरकी गणना करने के लिए, Equation 4 हम एल और आरके संबंध को कम करने,22उपज,23

Equation 5(समीकरण 2)

Equation 6(समीकरण 3)

नि 0 उपेक्षित है अगर झिल्ली के दोनों पत्रक एक ही संरचना है, हालांकि यह अटकलें है कि अन्य कारकों, जैसे प्रभारी प्रतिकारक के रूप में कुछ सहज वक्रता४२प्रेरित कर सकते हैं । बल और १००% DOPC GUVs से खींचा ट्यूबों पर त्रिज्या माप समीकरण 2 और समीकरण 3 (चित्रा 4) में सैद्धांतिक भविष्यवाणियों के साथ उत्कृष्ट समझौते में हैं । दो माप बल ऑप्टिकल जाल में मनका के विस्थापन और प्रतिदीप्ति तीव्रता से त्रिज्या से मापा जाता है के रूप में स्वतंत्र हैं, इसलिए श्लेष्मा झुकता कठोरता की गणना के दो तरीके प्रदान. दिखाए गए डेटा पैदावार के लिए समीकरण 2 और समीकरण 3 फिटिंग: K = (२५.१ ± १.४) (± एसडी मतलब) कश्मीरबीटी और (२२.१ ± १.५) kbt, क्रमशः, के रूप में पहले मापा४२ .

यदि वक्रता-युग्मन प्रोटीन के साथ प्रयोग, यह समीकरण 1में से एक की तुलना में अधिक परिष्कृत है Hamiltonian समीकरण का उपयोग करने का सुझाव दिया है, के रूप में समीकरण 1 केवल एक प्रभावी सहज वक्रता के लिए खातों और नहीं खाते के लिए झिल्ली के यांत्रिक गुणों या संभव प्रोटीन प्रोटीन बातचीत पर प्रोटीन का प्रभाव । देखें, उदा,25,३५,३६,५२,५३. हालांकि उंनत सैद्धांतिक मॉडल के लिए आवश्यक है एक में एक विशिष्ट प्रोटीन की गहराई से समझ-झिल्ली प्रणाली, उंहें सहारा के बिना, यह अभी भी ट्यूब खींच विधि से बहुत उपयोगी जानकारी प्राप्त करने के लिए संभव है ।

उदाहरण के लिए, परीक्षण के लिए अगर प्रोटीन भावना वक्रता, ट्यूब पर प्रोटीन के सापेक्ष तीव्रता गुव, जो फ्लैट माना जाता है की तुलना में मापा जाता है । सकारात्मक वक्रता के साथ बातचीत दूसरी micropipette25के साथ ट्यूब के पास प्रोटीन इंजेक्शन द्वारा अध्ययन किया है । नकारात्मक वक्रता या transmembrane प्रोटीन के व्यवहार के साथ बातचीत encapsulating या गुव गठन३५,३६के दौरान प्रोटीन का पुनर्गठन द्वारा अध्ययन किया है । अंतर्निहित GUVs पर झिल्ली ट्यूबों पर बार और KvAP प्रोटीन के सापेक्ष संवर्धन इंगित करता है कि वे घुमावदार झिल्ली (चित्रा 5) पसंद करते हैं । और अधिक मात्रात्मक होने के लिए, यह संवर्धन एक छंटाई गुणांक के रूप में गणना की जा सकती है, S, के अनुसार:

Equation 7(समीकरण 4)

जहाँ मैंprot, टब और मैंprot, गुव ट्यूब और गुव पर, क्रमशः प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता रहे हैं, और मैंहोंठ, टब और मैंहोंठ, गुव प्रतिदीप्ति तीव्रता के होते है लिपिड ट्यूब पर और गुव पर, क्रमशः ।

एक अंय उदाहरण ट्यूब बल को मापने के रूप में प्रोटीन झिल्ली को बांधता है । चित्रा 5B, सी से पता चलता है कि एक N-बार प्रोटीन endophilin A2 धीरे से ट्यूब बल कम कर देता है, यह शूंय के लिए कम, यह दर्शाता है कि यह एक तीन आयामी संरचना है कि ट्यूब स्थिर रहता है, जो एक पाड़ है का गठन किया है । इस तरह के ढांचे endocytosis में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, ट्यूब त्रिज्या फिक्सिंग से लेकिन यह भी scission7,४१को सक्षम करने में । के माप S, साथ ही यांत्रिक और रूपात्मक प्रभाव है कि प्रोटीन झिल्ली पर थोपना कैसे वे कोशिका में झिल्ली झुकने घटना में काम में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रोटीन के अभाव में यांत्रिक माप के प्रतिनिधि परिणाम. दिखाया गया है बल और ट्यूब एक १००% DOPC झिल्ली के लिए झिल्ली तनाव पर निर्भरता, तीन स्वतंत्र माप से, पहले से४२प्रकाशित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: बार प्रोटीन द्वारा वक्रता संवेदन और पाड़ गठन के प्रतिनिधि परिणाम । (क) मैं-बार प्रोटीन IRSp53 द्वारा वक्रता संवेदन । प्रोटीन इंद्रियों नकारात्मक झिल्ली वक्रता और गुव के अंदर पर ही है, बाहरी झिल्ली पत्रक पर मौजूद प्रोटीन की नगण्य राशि के साथ । स्केल बार = 5 µm.३६से पुनर्मुद्रित, क्रिएटिव कॉमंस CC-लाइसेंस द्वारा, कॉपीराइट २०१५, प्रकृति प्रकाशन समूह के अंतर्गत । (ख) एन बार प्रोटीन endophilin द्वारा एक प्रोटीन पाड़ गठन । प्रोटीन ट्यूब के पास इंजेक्ट कर रहे है और इसलिए बाहरी झिल्ली पुस्तिका पर बंधे हैं । के रूप में३७में वर्णित है, endophilin ट्यूब आधार करने के लिए बांध और एक पाड़ रूपों कि लगातार ऑप्टिकल ट्रैप (ओटी, व्हाइट सर्कल) की ओर गुव से ट्यूब के साथ बढ़ता है । (ग) गुव से मनका तक के endophilin पाड़ वृद्धि का एक kymogram, लिपिड और प्रोटीन चैनलों के साथ मढ़ा । साजिश ट्यूब बल, एफदिखाता है, समय के एक समारोह के रूप में, टी। kymogram और प्लॉट में timescales समान है (x-अक्ष साझा किया गया है) । B और Cमें, स्केल बार = 2 µm. संदर्भ३७, कॉपीराइट (२०१६) राष्ट्रीय विज्ञान अकादमी से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

GUVs से ट्यूबों खींचने की विधि झिल्ली प्रोटीन प्रणाली पर समृद्ध जानकारी देता है, क्योंकि यह न केवल करने के लिए झिल्ली के बुनियादी यांत्रिक गुणों को मापने का मतलब है, लेकिन यह प्रोटीन और झिल्ली के बीच युग्मन पर प्रकाश डाला में मदद करता है वक्री. के रूप में परिचय में चर्चा की, अंय तकनीकों उप माइक्रोन liposomes के साथ प्रोटीन मशीन द्वारा या तो झिल्ली curving प्रोटीन के प्रभाव को मापने के लिए मौजूद एक passivated सतह18,19 के लिए सीमित या देख कर micropipette में नलिकाओं के सहज गठन-एक प्रोटीन के इंजेक्शन पर aspirated GUVs20,21. विधि यहां वर्णित endocytosis के लिए प्रत्यक्ष ज्यामितीय कनेक्शन प्रदान करता है और एक ही समय में प्रणाली के महत्वपूर्ण शारीरिक माप प्रदान करने में अद्वितीय है, जैसे प्रोटीन घनत्व, झिल्ली तनाव, और झिल्ली बल ।

विधि की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि यह तुच्छ के निर्माण और सभी परख में शामिल घटकों जांचना नहीं है । हालांकि, जबकि फोकल माइक्रोस्कोपी, ऑप्टिकल चिमटी का एक संयोजन, और micromanipulation अधिक से अधिक जानकारी प्रदान करता है, कुछ घटक परिचय में चर्चा के रूप में प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जानकारी है कि जरूरत के बारे में सीखा जा करने के लिए पर निर्भर करता है सिस्टम. न्यूनतम करने के लिए सफलतापूर्वक एक प्रोटीन, या किसी भी अन्य संभावित वक्रता-युग्मित अणु की वक्रता युग्मन जांच करने के लिए आवश्यक घटक, एक micropipette aspirator और एक फोकल माइक्रोस्कोप, ऑप्टिकल चिमटी औषधालय के साथ कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात, अंशांकन के कई (जैसे झिल्ली ट्यूब त्रिज्या के लिए अंशांकन के रूप में और प्रोटीन सतह घनत्व का निर्धारण करने के लिए) आम तौर पर केवल एक बार प्रदर्शन करने की जरूरत है । विधि की एक और सीमा है कि यह एक समय में केवल एक गुव उपाय कर सकते हैं, प्रति घंटे दो से तीन GUVs की राशि (अभ्यास के साथ); हालांकि प्रत्येक माप डेटा का खजाना प्रदान करता है ।

उच्च प्रवाह मापन के लिए या यदि यह गोलाकार और नहीं ट्यूबलर geometries के साथ प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है, अन्य परख का पता लगाया जा करने के लिए या विकसित करने की आवश्यकता होगी. भविष्य के प्रयासों के लिए समर्पित किया जाएगा: (1) एक उच्च प्रवाह प्रणाली डिजाइनिंग जिसमें कई ट्यूबों (एकाधिक GUVs से) और निकाला जा सकता है एक ही समय में मापा, और (2) सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी इतना घालमेल प्रोटीन पाड़ के विवरण का अध्ययन करने के लिए कि नैनोट्यूब पर रूपों ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों Benoit Sorre, डेमियन Cuvelier, पियरे Nassoy, फ़्रांस्वा Quemeneur, और गिल Toombes उनके आवश्यक योगदान के लिए समूह में नैनोट्यूब विधि स्थापित करने के लिए धंयवाद । पीईबी समूह CNRS कंसोर्टियम CellTiss के अंतर्गत आता है, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) के लिए, और पेरिस विज्ञान एट Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02) । एफ.-सी. Tsai EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप (ALTF 1527-2014) और मैरी क्यूरी क्रिया (H2020-MSCA-अगर-२०१४, परियोजना झिल्ली-ezrin-actin) द्वारा वित्त पोषित किया गया । M.S. यारों के शमौन सोसायटी के जूनियर फेलो हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC) Avanti 850375 Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin] Avanti 880129 biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide Molecular Probes (ThermoFisher) D7540 fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*) Molecular Probes (ThermoFisher) fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC) Avanti 840051 used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%) Sigma Aldrich C6905 used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose Sigma Aldrich S7903
D(+) glucose Sigma Aldrich G7021
NaCl Sigma Aldrich S7653
Tris Sigma Aldrich 10708976001
osmometer Loser n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure Goodfellow USA PT005139 used for GUV electroformation
function generator n/a used to create current for GUV electroformation
putty sealant Vitrex (from CML France) CRIT 140013 used to seal the electroformation chamber
bath sonicator n/a useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany) an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively) Harvard apparatus 30-0036
micropipette puller Sutter Instrument P-2100
microforge Narishige MF-800
piezoelectric actuator Physik Instrumente n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm) Spherotech SVP-30-5

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References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Johannes, L., Wunder, C., Bassereau, P. Bending "on the rocks"--a cocktail of biophysical modules to build endocytic pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
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Prévost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (130), e56086, doi:10.3791/56086 (2017).

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